Summary
Twee-foton beeldvorming, gekoppeld aan laser nanodissection, zijn nuttige hulpmiddelen om degeneratieve en regeneratieve processen te bestuderen in het centrale zenuwstelsel met subcellulaire resolutie. Dit protocol laat zien hoe u een label, afbeelding en ontleden enkele klimmen vezels in de cerebellaire schors in vivo.
Introduction
Axonale doorsnijding gevolg van mechanische schade, toxische insult of neurodegeneratieve ziekten wordt meestal gevolgd door degeneratie van het distale gedeelte van de axon die wordt losgemaakt van het cellichaam 10-13. Op enkele uitzonderingen na 2,7,14,15, gescheiden axonen in het CZS van volwassen dieren zijn meestal niet in staat om een hergroei programma 16 te activeren.
Er is weinig bekend over de real-time dynamiek van degeneratieve gebeurtenissen op cellulair en subcellulair niveau. De ontwikkeling van nieuwe strategieën ter beperking van neuronale schade en het bevorderen van neuronale hergroei vereist, als eerste stap, verduidelijken het mechanisme waarmee singulier gewonde neuronale cellen degenereren en regenereren. Deze studie is het meest rechtstreeks door volgen van de dynamiek van een neuron in vivo. Terwijl de een-foton fluorescentie beeldvormende technieken worden beperkt door intense verstrooiing van zichtbaar licht, twee-foton excitatie diepe corticale lagen in li bereiktve muizen met subcellulaire resolutie 3,4,17. Gebruikmakend van transgene muizen waarin fluorescente proteïnen selectief uitgedrukt in subpopulaties van neuronen 18-20, is TPF microscopie toegepast op de exploratie van synaptische plasticiteit en axonale verlenging tijdens de ontwikkeling in vivo 21,22. D vermogen van singulier beschadigde neuronen teruggroeien na een blessure kan worden onderzocht door het koppelen in vivo controle door twee-foton beeldvorming met een model van letsel specifiek gericht op de axon van belang. Multi-foton absorptie van femtoseconde pulsen is gebruikt om enkele dendrieten of zelfs enkele stekels 5,23 verstoren. Bovendien is deze blessure paradigma laat snijden enkele axonale vertakkingen zonder verstoring van het contacteren van dendriet 6. In het kader van het ontleden van de functies die specifieke neuronale populatie laat hun axonen eenmaal beschadigd, cerebellaire klimvezels (CF) regenereren is een bruikbaar model siNVU ze behouden opmerkelijke plastische eigenschappen na een blessure, zelfs bij volwassen dieren 24,25. Onlangs langdurige beeldvorming van CF toonde aan dat deze axons in staat regrowing in de dagen laser axotomie 6 volgen.
Dit protocol beschrijft hoe olivocerebellair neuronen en hun axonen rek labelen door anterograde tracing. Zodra de neuronen van belang fluorescent gelabeld zijn, kunnen ze herhaaldelijk worden gecontroleerd op willekeurige tijdstippen gedurende weken of maanden onder een craniale venster. De procedure enkele axonale vertakkingen ontleden laser axotomie in vivo wordt dan geïllustreerd.
De hier gepresenteerde technieken bieden nieuwe inzichten in het mechanisme van axonale remodeling in vivo en kan helpen de ontwikkeling van therapeutische strategieën om neuronale degeneratie te beperken en te bevorderen axonale hergroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Axonale Labeling
- Klimvezels codeerbaar door het injecteren of organische kleurstoffen geconjugeerd aan hoogmoleculaire dextranen molecuulgewicht of plasmide / virussen die de expressie van fluorescerende eiwitten 26-29 induceren. In dit protocol wordt de organische kleurstof Alexa Fluor Dextran 488 geïnjecteerd in de oliva om klimvezels label en visualiseren in de cerebellaire cortex (figuur 1). Al de hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid.
- Bereid de glazen capillair door het op een micropipet trekker trekken. Knip het uiteinde van de glazen capillaire buis met een schaar tot de uitwendige diameter ongeveer 30 um.
- Laad het capillair met 1-2 ul van de dextran-geconjugeerde kleurstof.
- Voordat u begint, steriliseren alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf. Tijdens de procedure risico op verontreiniging door een glaskraal sterilisator.
- Verdoven van de muis (9-12weken) door intraperitoneale injectie van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (9 mg / kg). Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd met behulp van de staart en / of teen wringt. Gebruik dierenarts zalf op de ogen tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Scheer de haren boven de hals met een scheermesje of ontharingscrème. Veeg het chirurgisch tweemaal met betadine, afgewisseld met ethanol 70%.
- Plaats de muis op een stereotaxisch houder. Houd het dier warm met een verwarmingselement.
- Duw de earbars op het bot naast de oren, zodat de kop stevig wordt vastgehouden. Draai de kop van een 140 ° hoek met het lichaam. De gewenste oriëntatie kan worden verkregen door voorzichtig het veranderen van de hoogte van de neus houder stang op de stereotactische houder.
- Breng wat druppels van lidocaïne op de huid tussen de oren. Gebruik een tang of een scheermesje om een verticale insnijding van ongeveer 1 cm uit te voeren op de huid onder het achterhoofd.
- Zachtjes scheiden het onderhuidse weefsel en de spieren door stompe pincets onder de dissectie microscoop. Duw de horizontale spierbundel en houd apart de twee verticale spieren bundels om de dura bloot via het foramen magnum.
- Plaats uiterst voorzichtig ontleden de dura met een injectienaald of zeer scherpe tang om de hersenstam bloot. Een kleine hoeveelheid van de cerebro-spinale vloeistof kan lekken wanneer de dura is gesneden.
- Op de stereotactische micromanipulator, draait u de houder van het capillair 45 ° van de verticale. Plaats het capillair aan de middellijn, in het midden tussen de caudale rand van de cerebellaire cortex en de eerste halswervel. Plaats de pipet op een diepte van 2 mm vanaf het oppervlak.
- Lever een 0.5-1.5 ul volume van kleurstof over 10-15 minuten. Een micro-injectie doseersysteem maakt gecontroleerde druk aflevering van de vloeistof in de capillaire (polsdruk = 20 psi; pulsduur = 3-4 msec, frequentie van pulsafgifte = 12 Hz).
- Laat de capillaire in de plaats voor 15 min, dan slowly (2-3 min) verwijderen. Fijn opnieuw uitlijnen van de spieren en hechtdraad de huid boven. Houd de spieren goed gehydrateerd door het toepassen van enkele zoutoplossing gedurende de gehele procedure.
- Om uitdroging te voorkomen, injecteren subcutaan 0,5 ml 0,9% NaCl. Houd het dier in een verwarmde kooi tot volledig herstel van anesthesie.
- Subcutaan Carprofen (5 mg / kg) per dag gedurende 2-3 dagen na de operatie.
2. Optisch Venster op de cerebellaire schors
OPMERKING: De kleurstof wordt vervoerd 2 weken vanaf het inferieure olivaris kern tot de cerebellaire cortex de CF klemmen (zie figuur 1). De dun gelabelde CF kan worden gevisualiseerd onder voortdurend craniale venster als volgt worden uitgevoerd:
- Steriliseer de chirurgische instrumenten.
- Verdoven muizen als hierboven beschreven. Gebruik teen knijpt om het dier te controleren is volledig verdoofd.
- Scheer het haar boven het hoofd, veeg de skin met afwisselend jat van 70% alcohol en betadine en oogzalf toepassen. Plaats de muis in een stereotaxisch frame en plaats de oor bars om stevig vast te houden het hoofd.
- Subcutaan Dexamethason (0,2 mg / kg) en Carprofen (5 mg / kg) tot zwelling van de hersenen en mogelijke ontstekingen in het craniale sitevenster voorkomen.
- Breng een druppel van lidocaïne op de huid boven de schedel en sneed een klep, van tussen de oren om boven de ogen. Solliciteer lidocaïne oplossing weer op het periost voordat schrapen met een scalpel.
- Gebruik de tandartsboor te dun een halfronde gebied van de schedel boven het cerebellum. Het venster wordt meestal geplaatst centraal en naar achteren hechtdraad, zodat de schedel diepte nagenoeg constant gedurende de omtrek van de halve cirkel. Plaatsing van het venster te dicht bij de lambda hechtdraad en repetitieve boren op deze zeer dikke gebied kan leiden tot oververhitting van de hersenen en de vorming van oedemen.
- Solliciteer hemostatischespons op de schedel in het geval van bloeden.
- Snijd een dekglaasje in twee helften met behulp van een scheermesje en pincet. Controleer of de dekglaasje is iets groter dan het eiland van het bot en heeft een soortgelijke vorm voordat u de klep van het bot met de pincet; zo niet, vernieuwing van het dekglaasje of kies een andere. Laat de dura mater niet aan met de pincet tijdens het tekenen van het bot. Legt zorgvuldig onderaan de dekglaasje op de dura. OPMERKING: De hechting van het gehele oppervlak van het glas op de dura is voorspellen van langdurige craniale ramen.
- Verwijder luchtbellen onder het glas door herhaaldelijk spoelen met zoutoplossing en drogen met katoen stokken. Dit zal ook helpen het verwijderen van een aantal resterende bloed die kunnen worden gemorst uit van kleine haarvaten na het positioneren van het glas. Dicht de raam met een mengsel van acryl lijm en tandheelkundige cement 30.
- Houd het dier op een verwarmingselement in een herstel kamer tot ze volledig hersteld van anesthesie. Niet opnieuwdraai muizen in de kooi totdat volledig hersteld; laat ze niet onbeheerd achter tot ze weer voldoende bewustzijn borstligging handhaven.
- Subcutaan Carprofen (5 mg / kg) per dag gedurende 2-3 dagen na de operatie.
3. In vivo Multi-foton laser axotomy
- Wacht 2-7 dagen na de operatie voordat het uitvoeren van de eerste opnamesessie. De op maat gebouwde twee-foton microscoop die hier gebruikt is voorzien van een Ti: Sapphire laserbron (120 fs breedte pulsen, 90 MHz herhalingsfrequentie) die voor het eerst wordt gescand door een paar galvanometrische spiegels en dan gericht op het monster door een onderdompeling in water 20X objectief (NA 0.95, WD 2 mm). Een closed-loop piëzo stadium presteert axiale verplaatsingen tot 400 micrometer van de doelstelling. Fotomultiplicatorbuizen verzamelen van de fluorescentie-signaal.
- Verdoven van het dier, vervolgens de kop in de stereotactische houder, zodat de craniale venster ligt parallel aan de objectiveringve focal plane.
- Verkennen met TPF beeldvorming van de cortex onder de craniale venster. Kies de axon beschadigd onder de helderste.
- Acquire een Z-stack (meestal het gezichtsveld is 100 x 100 urn 2 bij 512 x 512 pixels, 2 urn z-as stap) om een 3D-reconstructies van de beoogde axon verkrijgen. Binnen het volume afgebeeld, kiest de laesie site op een axonale tak die meestal parallel aan de focal plane ligt. Deze oriëntatie kan snel scoren morfologische veranderingen die voorspellend voor een succesvolle dissectie zijn.
- Bestralen met een hoge energie-dosis het geselecteerde punt op een distale gedeelte van een CF. Dit wordt gedaan door middel van de Labview software: verhoging van het laservermogen 5-10x meer dan de stroom die wordt gebruikt voor de beeldvorming (≈ 300 mW, gemeten na het objectief), stelt u de positie van de galvanometrische spiegels op een lijn scan (~ 4 - 10 micrometer) op de laesie en open de laser sluiter voor 400-600 msec. Oriënteer de lijn scanloodrecht op de CF vliegtuig volledig doorsnijden van de axon. Bestralen helderder plekken (bv., Varicosities) meestal helpt het ontleden van de axon. De golflengte van de laser axotomy is hetzelfde gebruikt voor beeldvorming (920 nm).
- Meestal de fluorescentie van het axon in het bestraalde gebied tijdelijk afneemt door fotobleken. Het verwerven van een stapel van dezelfde regio enkele minuten na de bestraling te zorgen voor de ablatie is goed uitgevoerd. Als de regio begon zwelling en de axon gevormde kraal-achtige structuren, is het neuron is succesvol ontleed. In dit geval, in een paar uur (van enkele tientallen minuten tot 24 uur) het distale gedeelte van de axon zullen degenereren en verdwijnen.
- Helaas is de energie-dosis die volledig axotomie produceren niet altijd voorspelbaar. Als het enige resultaat van de bestraling wordt photobleaching, moet de fluorescentie snel worden hersteld door diffusie verven, en de bestraling moet opnieuw worden herhaald om effectiefly ontleden de axon. Ook in het geval tekenen van zwelling lijken niet binnen 5 - 20 minuten, of zwelling gevolgd door herstel (. Analoog aan wat is beschreven voor laser dendrotomy zie Allegra Mascaro et al. 23), probeer opnieuw met nieuwe scans verhogen van de verblijftijd en / of de laservermogen.
- Controleer de uiteindelijke hermodellering van het axon in de dagen dat de laser axotomie volgen met twee-foton in vivo beeldvorming (figuren 2 en 3). De vasculaire patroon wordt gebruikt als referentie patroon naar de ontleed axon te halen in de volgende dagen.
- Subcutaan Carprofen (5 mg / kg) elke opnamesessie voor de gehele duur van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol wordt beschreven hoe axonale etikettering, in vivo beeldvorming en laser axotomy gedrag van individuele neuronen. De tijdlijn van het experiment wordt getoond in figuur 1.
Een voorbeeld van CF gelabeld met Alexa Fluor 488 dextraan en zichtbaar gemaakt onder de craniale venster in vivo twee-foton microscopie wordt vermeld in Figuur 2. Zoals eerder gemeld 6,27, opgaande takken vertonen een hoge stabiliteit gedurende de waarnemingsperiode van enkele dagen .
Figuur 3 toont een voorbeeld van axonale doorsnijden door laser axotomie van een tak van een CF. Zoals eerder beschreven, werd de schade uitgevoerd door bestraling een distaal aftakking (~ 30 urn onder de pia) van een CF met een hoge energie dosis van infrarood licht. Zoals in het tweede paneel van figuur 3, 15 minuten na laserbestraling het distale gedeelte van de axon zwol en degenecijfer. De dag na het deel van de axon distaal van de laesie volledig verdwenen (figuur 3, d17). De gedegenereerde gedeelte wordt gemarkeerd door de rode pijlen in het tijdsverloop. De laatste twee panelen tonen ook de geleidelijke vorming van een nieuwe dwarse tak (groene pijl) van de benadeelde axon (meer details over de kiemen van nieuwe vestigingen na laser axotomy in vivo kan worden gevonden in 6).
Figuur 1. Tijdlijn van de laser nanosurgery experiment. Na de injectie in de inferieure olivaris kern, twee weken van herstel zal de anterograde dextran-geconjugeerde kleurstof aan het klimmen vezels labelen. De cerebellaire cortex wordt vervolgens blootgesteld door het uitvoeren van een permanente craniale venster. Van 2-7 later, kan de gelabelde CF onder de twee-foton micr worden afgebeeldoscope in vivo op willekeurige tijdstippen. De laser nanosurgery de gemerkte axons kunnen worden uitgevoerd op elk moment na de craniale venster is geïmplanteerd.
Figuur 2. Klimvezels etikettering. Het linker paneel toont een voorbeeld van een CF gelabeld met Alexa Fluor 488 dextraan en gevisualiseerd in vivo door TPF microscopie. Rechter panelen tonen time-lapse beelden van dezelfde CF van dag 16 (D16) naar D18. Schaal bar, 10 micrometer.
Figuur 3. Laser axotomy op een enkele tak van een klimvezel. Het neuron werd bestraald waar de rode pijl op d16. Rode pijlpunten Highlight het verdwijnen van het distale gedeelte van het axon na laser axotomie (D18). Een nieuw gevormde dwarse tak wordt opgemerkt door de groene pijlpunt. Schaal bar, 10 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol laat zien hoe de neuronen van de inferieure olijf labelen met een fluorescerende kleurstof. Vervolgens wordt de methode craniaal venster uitvoeren op de cerebellaire cortex beschreven. Deze techniek biedt optische toegang tot het eindgedeelte van olivocerebellair neuronen, het klimmen vezels. Helaas, de uitkomst van zowel de etikettering en craniotomy operatie is vrij laag, zelfs in de handen van geschoolde operatoren (meestal 1 op 3 muizen is gelabeld, en 1 op de 3 craniale ramen helder blijft na 1-2 weken).
De procedure om laser axotomy presteren in levende muizen wordt vervolgens gepresenteerd. Deze methode maakt het ontleden van fluorescerende neuronen in gerichte sites. Terwijl gebruikelijke schade paradigma, hetzij door mechanische verbreking of het gebruik van chemicaliën, veroorzaken grote verstoring van hersenweefsel, de belangrijkste kracht van dit model is de hoge ruimtelijke opsluiting en specificiteit. Inderdaad, eerdere studies is gebleken dat enkele stekels kan worden weggenomen, terwijl sparen tHij structurele integriteit van de bovenliggende dendriet 5; Bovendien kunnen enkele axonale vertakkingen verstoord vermijden van de vorming van een persistente gliale litteken 6. De degeneratie proces kan dan gevolgd in real time, en eventuele herinrichting van de gewonden neuron. Deze methode is dan ook een krachtig hulpmiddel om de fundamentele mechanisme van axonale structurele plasticiteit in vivo te bestuderen.
De mogelijkheid ontleden geselecteerde structuren hangt in eerste benadering van de diepte van de structuur en de fluorescentie-emissie-intensiteit. Hoewel twee-foton microscopie maakt beeldvorming neuronen tot 600-800 urn diep, vonden we dat de nanosurgery is beperkt tot de eerste lagen van de cortex (tot 300 mm).
In dit protocol laser axotomie is gericht tot cerebellaire klimmen vezels, maar kan worden gebruikt om fluorescerende structuur ontleden levende hersenen. Laserstraling is gebruikt om enkele neuronale ce ontledenll lichamen, dendritische takken, axonen of enkele stekels van GFP-gelabelde piramidale neuronen in de cortex van transgene muizen 5,8,9,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, hemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F.
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P.
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O'Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F.
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P.
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
