Summary
To-foton bildebehandling, koblet til laser nanodissection, er nyttige verktøy for å studere degenerative og regenerative prosesser i sentralnervesystemet med subcellulære oppløsning. Denne protokollen viser hvordan du kan merke, image, og dissekere enkle klatrefibre i lillehjernen cortex in vivo.
Introduction
Aksonal tran følge av mekanisk skade, giftige fornærmelse eller nevrodegenerative sykdommer er vanligvis etterfulgt av degenerasjon av distal del av aksonet som er løsrevet fra cellekroppen 10-13. Med noen få unntak 2,7,14,15, avkuttede axoner i CNS av voksne dyr er vanligvis ikke i stand til å aktivere en gjenvekst program 16.
Lite er kjent om de sanntid dynamikken i degenerative hendelser på cellulært og subcellulære nivå. Utviklingen av nye strategier for å begrense neuronskade og fremme neuronal gjenvekst krever, som et første skritt, avklare den mekanismen som særdeles skadde nerveceller utarte og regenerere. Denne studien er mest direkte adressert ved å overvåke dynamikken i en enkelt nervecelle i vivo. Mens ett foton fluorescens bildeteknikker er begrenset av intense spredning av synlig lys, når to-foton-eksitasjon dype kortikale lag i live mus med subcellulære oppløsning 3,4,17. Benytte seg av transgene mus der fluorescerende proteiner er selektivt uttrykt i subpopulasjoner av nevroner 18-20, har TPF mikros blitt brukt til utforskning av synaptisk plastisitet og aksonal forlengelse under utvikling in vivo 21,22. T han evnen til bemerkelsesverdig ødelagte nerveceller til gjenvekst etter skade kan undersøkes ved kobling in vivo overvåking av to-foton bildebehandling med en modell av skade spesielt rettet mot axon av interesse. Multi-fotonabsorpsjon av femtosecond pulser har blitt brukt til å forstyrre enkelt dendritter eller enkelt pigger 5,23. Videre tillater denne skaden paradigmet kutte enkelt aksonale grener uten å forstyrre kontakte dendrite seks. Innenfor rammen av dissekere de funksjoner som lar spesifikke nevronale befolkningen til å regenerere sine axoner en gang skadet, lillehjernen klatrefibre (CFS) er en nyttig modell since de beholder bemerkelsesverdige plastiske egenskaper etter skade selv i voksne dyr 24,25. Nylig, langsiktig avbildning av CFer viste at disse axons er i stand til etterveksten i dagene som følger laser axotomy seks.
Denne protokollen beskriver hvordan å merke olivocerebellar nevroner og deres axonal forlengelse gjennom antero sporing. Når neuronene av interesse er fluorescensmerkede, kan de bli overvåket gjentatte ganger ved vilkårlige tidspunkter i flere uker eller måneder i henhold til en cranial vindu. Fremgangsmåten for å dissekere enkelt aksonale grener av laser axotomy in vivo vil da bli vist.
Teknikkene som presenteres her gir ny innsikt i mekanismen av aksonal ombygging in vivo og kan bidra til utvikling av terapeutiske strategier for å begrense neuronal degenerasjon og fremme aksonal gjenvekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Aksonale Merking
- Klatre fibre kan bli merket ved å injisere enten organiske fargestoffer konjugert til høy molekylvekt dekstraner eller plasmid / virus som induserer ekspresjonen av fluorescerende proteiner 26-29. I denne protokollen blir det organiske fargestoff Alexa Fluor Dextran 488 sprøytes inn i underlegen oliven å merke klatre fibre og visualisere dem i cerebellar cortex (figur 1). Alle de prosedyrene som er beskrevet her har blitt godkjent av det italienske helsedepartementet.
- Forbered glass kapillarrør ved å trekke den på en mikropipette avtrekker. Trim spissen av glass kapillarrør med saks til den utvendige diameter er omkring 30 mikrometer.
- Laste kapillær med 1-2 mL av dekstran-konjugert fargestoff.
- Før du starter, sterilisere alle kirurgiske instrumenter i en autoklav. I løpet av fremgangsmåten, å redusere risikoen for forurensning ved hjelp av en glassperle sterilisator.
- Anesthetize mus (9-12uker) etter intraperitoneal injeksjon av ketamin (90 mg / kg) og xylazin (9 mg / kg). Sørg for at dyret er fullt bedøvet ved hjelp av halen og / eller tå klyper. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Barbere hår over nakken med enten et barberblad eller hårfjerningskrem. Rens det kirurgiske området to ganger med Betadine, alternert med etanol 70%.
- Plasser musen på en stereotaksisk holderen. Hold dyret varm med en varmepute.
- Skyv de earbars på beinet ved siden av ørene slik at hodet holdes fast. Drei hodet for å danne en 140 ° vinkel med legemet. Den ønskede orientering kan oppnås ved å endre forsiktig høyden av nesen holder stangen på stereotactic holderen.
- Påfør noen dråper av lidokain på huden mellom ørene. Bruk pinsett eller et barberblad for å utføre et vertikalt snitt på ca 1 cm på huden under bakhodet.
- Forsiktig skille subcutaneous vev og muskler etter stump pinsetts under disseksjon mikroskop. Trykk ned den horisontale muskelbunten og hold hverandre de to vertikale muskler fascicles for å avsløre dura over foramen magnum.
- Ved hjelp av ekstrem forsiktighet, dissekere dura med en sprøyte nål eller svært skarpe pinsett til å eksponere hjernestammen. En liten mengde av cerebrospinalvæsken kan renne ut når dura har blitt kuttet.
- På den stereomicromanipulator, rotere innehaveren av kapillær 45 ° fra den vertikale. Plasser kapillær på midtlinjen, på midtpunktet mellom halekanten av cerebellar cortex og den første halsvirvelen. Sett pipette i en dybde på 2 mm fra overflaten.
- Levere en 0,5-1,5 pl volum fargestoff enn 10-15 min. En mikroinjeksjon utleveringssystem tillater kontrollert trykk levering av væske i kapillarrøret (pulstrykk = 20 psi; pulsvarighet = 3-4 msek, frekvens av pulsleverings = 12 Hz).
- La kapillarrøret i stedet for 15 min, deretter slowly (i 2-3 min) fjerne den. Delikat avlede muskler og sy huden ovenfor. Hold musklene godt hydrert ved å bruke noen saltvann gjennom hele prosedyren.
- For å unngå dehydrering, injiseres subkutant 0,5 ml av 0,9% NaCl. Holde dyret i en oppvarmet bur inntil full oppvåkning fra anestesi.
- Subkutant administrere carprofen (5 mg / kg) daglig i 2-3 dager etter operasjonen.
2. Optisk Vindu mot Lillehjernen Cortex
MERK: Fargestoffet blir transportert i to uker fra den underlegne olivary nucleus opp til lillehjernen cortex til CFS terminaler (se figur 1). De tynt merket CFer kan visualiseres under permanent kranie vindu som kan utføres på følgende måte:
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter.
- Anesthetize mus som beskrevet ovenfor. Bruk tå klyper for å sjekke dyret er fullt bedøvet.
- Barbere håret over hodet, tørk den skpå med vekslende swipes av 70% alkohol og betadine og gjelder øyesalve. Plasser musen i en stereotaktisk ramme og plassere øret barene for å holde fast hodet.
- Subkutant administrere Deksametason (0,2 mg / kg) og carprofen (5 mg / kg) for å hindre svelling av hjernen og eventuelle betennelser i den kraniale vinduet tomt.
- Påfør en dråpe lidokain på huden over skallen og klippe en klaff, fra mellom ørene til over øynene. Påfør lidokain løsning igjen på periosteum før skraping det med en skalpell.
- Bruk dental drill til tynn en halvsirkelformet regionen i skallen over lillehjernen. Vinduet er vanligvis plassert sentralt og mot baksiden sutur, slik at hodeskallen dybde er nesten konstant over hele omkretsen av halvsirkelen. Plassering av vinduet for nær lambda sutur og repeterende Boring enn dette veldig tykk regionen kan resultere i overoppheting av hjernen og dannelsen av edemas.
- Påfør hemostatisksvamp på skallen i tilfelle av blødning.
- Skjær et coverglass i to halvdeler ved hjelp av et barberblad og pinsett. Kontroller at dekkglass er litt større enn øya av bein og har en lignende form før du fjerner klaff av bein med pinsett; hvis ikke, omforme dekkglass eller velg en annen. Ikke berør dura mater med pinsett mens tegning av beinet. Lå forsiktig ned dekkglass på dura. MERK: etterlevelse av hele overflaten av glasset på dura er foretelling av langvarige hjerne vinduer.
- Fjern luftbobler under glasset ved gjentatte ganger å skylle med saltvann og tørking med bomulls pinner. Dette vil også bidra til å fjerne noe gjenværende blod som kan bli sølt ut fra små blodkar etter posisjonering av glass. Tett vinduet med en blanding av akryl lim og dental sement 30.
- Hold dyret på en varmepute i en utvinning kammer til det er fullt restituert fra anestesi. Ikke reslår mus i hjemmet kassen til helt frisk; ikke la dem uten tilsyn før de gjenvant tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Subkutant administrere carprofen (5 mg / kg) daglig i 2-3 dager etter operasjonen.
Tre. In Vivo Multi-foton laser Axotomy
- Vent 2-7 dager fra operasjonen før du utfører den første bildebehandling økten. Den spesialtilpassede to-foton mikroskop benyttet her er forsynt med et Ti: safir laser-kilde (120 fs bredde pulser, 90 MHz repetisjonsfrekvens) som først blir skannet med et par av galvanometric speil og så fokusert på prøven ved en vann-nedsenking 20X Målet (NA 0,95, WD 2 mm). Et lukket piezoelektrisk trinn utfører aksiale forskyvninger opptil 400 mikrometer til objektivet. Fotomultiplikatorrør samle fluorescens signalet.
- Anesthetize dyret, deretter plassere hodet i stereo holderen slik at kranie vinduet legger parallelt med objektivtve fokusplan.
- Utforsk med TPF bildebehandling cortex under hjerne vinduet. Velg aksonet å bli skadet blant de mest lyssterke.
- Skaff et Z-stack (vanligvis synsfeltet er 100 x 100 mikrometer 2, på 512 x 512 piksler, 2 mikrometer z-aksen trinn) for å få en 3D-rekonstruksjoner av målrettet axon. Innenfor avbildes volum, velge lesjonen side på en aksonal gren som ligger stort sett parallelt med midtplanet. Denne orienteringen gjør det mulig å raskt scorer morfologiske endringer, som er prediktive for en vellykket disseksjon.
- Bestråles med en høy energi dose valgt punkt på en ytre del av en CF. Dette gjøres gjennom LabVIEW software: øke lasereffekten 5-10x mer enn kraften brukes til bildebehandling (≈ 300 mW, målt etter objektiv), angi plasseringen av de galvanometric speil for å gjøre en linje scan (~ 4 - 10 mikrometer) på lesjon området og åpne laser lukkeren for 400-600 msek. Orientere linjen skanningvinkelrett på CF flyet til helt skjære over axon. Bestråle lysere flekker (f.eks., Åreknuter) hjelper vanligvis dissekere aksonet. Bølgelengden til laser axotomy er den samme som brukes for avbildning (920 nm).
- Vanligvis fluorescensen av axon i det bestrålte område forbigående reduseres på grunn av fotobleking. Tilegner seg en stabel av de samme region få minutter etter at bestrålingen for å sikre ablasjon har blitt godt utført. Hvis regionen startet hevelse og aksonet dannet perle-lignende strukturer, har nervecellen blitt dissekert. I dette tilfellet, i noen få timer (fra noen titalls minutter til 24 timer) den distale delen av axon vil degenerere og forsvinner helt.
- Dessverre er den energidose nødvendig for å produsere en fullstendig axotomy er ikke alltid forutsigbar. Hvis det eneste resultatet av bestrålingen er fotobleking, bør fluorescens bli hurtig gjenopprettes på grunn av fargestoff diffusjon, og bestråling bør gjentas igjen for å effektivtly dissekere aksonet. Også i tilfelle tegn på svelling, vises ikke i løpet av 5 - 20 minutter, eller hevelse er etterfulgt av gjenvinning av (. Analogt med hva som er beskrevet for laser dendrotomy, se Mascaro Allegra et al 23), prøv igjen med nye skanninger øke holdetid og / eller lasereffekten.
- Overvåk eventuelt ombygging av axon i dagene som følger laseren axotomy med to-foton in vivo imaging (figurene 2 og 3). Den vaskulære mønsteret blir brukt som referansemønster for å hente den dissekerte axon i de følgende dager.
- Subkutant administrere carprofen (5 mg / kg) hver avbildning sesjon for hele varigheten av forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskrevet hvordan du utfører axonal merking, in vivo avbildning og laser axotomy på enkeltnerveceller. Tidslinjen av forsøket er vist i figur 1..
Et eksempel på CFS merket med Alexa Fluor 488 Dextran og visualisert under kranievinduet ved in vivo to-foton mikroskopi er rapportert i figur 2. Som tidligere rapportert 6,27, de stigende grenene vise en høy stabilitet gjennom hele observasjonsperioden på flere dager .
Figur 3 viser et eksempel på aksonal for adskillelse av laser axotomy av en enkelt gren av en CF. Som tidligere beskrevet, ble skaden utføres ved å bestråle en distal gren (~ 30 mikrometer under pia) av en CF med en høy energi-dose av infrarødt lys. Som vist i det andre panel i figur 3, 15 min etter at laserbestråling den distale delen av axon startet hevelse og degenevurdering. Dagen etter den del av axon distalt til lesjonen side helt forsvunnet (figur 3, d17). Den degenererte delen er markert med de røde pilene i den tiden kurset. De to siste panelene viser også den progressive dannelsen av en ny tverrgående gren (grønn pilspiss) fra den skadde axon (flere detaljer på den spirende av nye grener etter laser axotomy in vivo kan finnes i 6).
Figur 1. Linjen av laseren nanosurgery eksperimentet. Etter injeksjonen inn i den nedre olivary kjernen, to uker etter gjenvinning vil tillate antero dekstran-konjugerte fargestoff å merke klatre fibre. Den cerebellar cortex blir så eksponert ved å utføre en permanent kranie vindu. Fra 2-7 senere, kan de merkede CFer bli fotografert under to-foton microscope in vivo på vilkårlige tidsintervaller. Laseren nanosurgery på de merkede axoner kan utføres når som helst etter at den kraniale vinduet er blitt implantert.
Figur 2. Klatre fiber merking. Viser venstre panel et eksempel på et CF merket med Alexa Fluor 488 Dextran og visualisert in vivo ved TPF mikroskopi. Høyre panel viser tids-lapse bilder av samme CF fra dag 16 (D16) til D18. Scale bar, 10 mikrometer.
Figur 3. Laser axotomy på en enkelt gren av en klatring fiber. Nervecellen ble bestrålt hvor den røde pilen peker på D16. Røde pilspisser highlight forsvinningen av den distale delen av aksonet etter laser axotomy (D18). En nylig dannet tverrgående gren er påpekt av den grønne pilspiss. Scale bar, 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen viser hvordan å merke nevroner av mindreverdig oliven med et fluorescerende fargestoff. Deretter er fremgangsmåten for å utføre en cranial vindu på lillehjernen cortex beskrevet. Denne teknikken gir optisk adgang til terminaldelen av olivocerebellar nevroner, klatring fibre. Dessverre er resultatet av både merking og kraniotomi kirurgi ganske lav, selv i hendene på dyktige operatører (vanligvis en av tre mus er merket, og en av tre kranie vinduer er fortsatt klart etter 1-2 uker).
Fremgangsmåten for å utføre laser axotomy i levende mus blir deretter presentert. Denne metoden gjør det mulig å dissekere fluorescerende nevroner i målrettede områder. Mens brukte skade paradigmer, enten ved mekanisk adskillelse eller bruk av kjemikalier, forårsake massive forstyrrelser i hjernevevet, er det viktig styrke ved denne modellen høy romlig innesperring og spesifisitet. Faktisk, tidligere studier viste at enslige pigger kan ablated mens sparsom than strukturelle integriteten til den overordnede dendrite 5; Videre kan enkle aksonale grener bli forstyrret unngår dannelsen av en vedvarende glial arr 6.. Den degenerasjon prosessen kan deretter etterfulgt i sann tid, så vel som eventuelt ombygging av skadde nevroner. Denne metoden er derfor et kraftig verktøy for å studere den grunnleggende mekanisme for aksonal strukturell plastisitet in vivo.
Muligheten for å dissekere valgte strukturer avhenger i første tilnærming av dybden av konstruksjonen og på sin fluorescens emisjonsintensitet. Selv om to-foton mikroskopi tillater bilde nevroner opp til 600-800 mikrometer dypt, fant vi at nanosurgery er begrenset til de første lagene av hjernebarken (opp til 300 mm).
I denne protokollen laser axotomy ble rettet mot lillehjernen klatrefibre, men det kan brukes til å dissekere noen fluorescerende strukturen i levende hjerne. Laser bestråling har blitt brukt til å dissekere enkelt nevronale cell organer, dendrittiske grener, axons eller enkelt pigger av GFP-merket pyramidale nevroner i hjernebarken av transgene mus 5,8,9,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, hemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O'Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
