Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lasernanosurgery av Cerebellar Axoner Published: July 28, 2014 doi: 10.3791/51371
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3,4
1European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, University of Florence, 2National Institute of Optics, National Research Council, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 4International Center for Computational Neurophotonics (ICON Foundation)

Summary

Två-foton avbildning, som är kopplad till laser nanodissection, är användbara verktyg för att studera degenerativa och regenerativa processer i det centrala nervsystemet med subcellulär upplösning. Detta protokoll visar hur man märka, bild, och dissekera enstaka klättring fibrer i cerebellar cortex in vivo.

Introduction

Axonal transektion till följd av mekanisk skada, giftiga förolämpning eller neurodegenerativa sjukdomar följs vanligen av degeneration av den distala delen av axon som är fristående från cellkroppen 10-13. Med några få undantag 2,7,14,15, avhuggna axoner i CNS hos vuxna djur är oftast inte kan aktivera en återväxt program 16.

Lite är känt om realtids dynamik degenerativa händelser på den cellulära och subcellulära nivå. Utvecklingen av nya strategier för att begränsa nervskada och främja neuronal återväxt kräver, som ett första steg, att klargöra den mekanism genom vilken ovanligt skadade nervceller urarta och regenerera. Denna studie är mest direkt adresseras genom att övervaka dynamiken hos en enda neuron in vivo. Medan en-foton fluorescens avbildningstekniker är begränsade av intensiv spridning av synligt ljus, når tvåfotonexcitering djupa kortikala skikt i live möss med subcellulära upplösning 3,4,17. Med utnyttjande av transgena möss där fluorescerande proteiner selektivt uttrycks i subpopulationer av nervceller 18-20, har TPF mikroskopi tillämpats på utforskandet av synaptisk plasticitet och axonal töjning under utvecklingen in vivo 21,22. D en förmåga ovanligt skadade nervceller att återföds efter skada kan undersökas med koppling in vivo övervakning av två-photon avbildning med en modell av skada speciellt riktade till axonet av intresse. Fler fotonabsorption av femtosecond pulser har använts för att störa enstaka dendriter eller enstaka ryggar 5,23. Dessutom tillåter denna skada paradigm skära enstaka axonal grenar utan att störa kontakt dendritliknande 6. I samband med att dissekera de funktioner som tillåter specifika neuronala befolkningen att regenerera sina axoner gång skadade, cerebellär klättring fibrer (CFS) är en användbar modell since de behåller anmärkningsvärda plastiska egenskaper efter skada även i vuxna djur 24,25. Nyligen, långsiktig avbildning av CFS visade att dessa axoner är kapabla av förnybara i dagarna som följer laser axotomy 6.

Detta protokoll beskriver hur man märka olivocerebellar nervceller och deras axonal töjning genom antero spårning. När neuronerna av intresse är fluorescensmärkt, kan de övervakas upprepade gånger vid godtyckliga tidpunkter i veckor eller månader under en kraniell fönster. Proceduren att dissekera enstaka axonal grenar med laser axotomy in vivo kommer då att belysas.

De tekniker som presenteras här ger nya insikter i mekanismen för axonal ombyggnad in vivo och kan bidra till utvecklingen av terapeutiska strategier för att begränsa neuronal degeneration och främja axonal återväxt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Axonal Märkning

  1. Climbing fibrer kan märkas genom att injicera antingen organiska färgämnen konjugerade till högmolekylära dextraner eller plasmid / virus som inducerar expression av fluorescerande proteiner från 26 till 29. I detta protokoll, är organiskt färgämne Alexa Fluor Dextran 488 injiceras i sämre oliv att märka klättring fibrer och visualisera dem i lillhjärnans cortex (Figur 1). Samtliga förfaranden som beskrivs här har godkänts av det italienska hälsoministeriet.
  2. Förbered glaskapillärrör genom att dra den på en mikropipett avdragare. Trim spetsen glaskapillärrör med sax tills den yttre diametern är ungefär 30 | im.
  3. Fyll på kapillär med 1-2 | il av dextran-konjugerade färgämne.
  4. Före start, sterilisera alla kirurgiska instrument i en autoklav. Under förfarandet, minska risken för kontaminering med hjälp av en glaspärla autoklav.
  5. Bedöva musen (9-12veckor) efter intraperitoneal injektion av ketamin (90 mg / kg) och xylazin (9 mg / kg). Se till att djuret är helt sövd med hjälp av svans och / eller tå nypor. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
  6. Raka håren ovanför halsen med antingen ett rakblad eller hårborttagningskräm. Tvätta operationsområdet två gånger med Betadine, varvat med etanol 70%.
  7. Placera musen på en stereotaktisk hållare. Håll djuret varm med en värmedyna.
  8. Tryck försiktigt de earbars på benet intill öronen så att huvudet hålls fast. Vrid på huvudet för att bilda en 140 ° vinkel med kroppen. Den önskade orienteringen kan erhållas genom att försiktigt ändra höjden på näsan hållaren stången på den stereotaktiska hållaren.
  9. Applicera några droppar lidokain på huden mellan öronen. Använd pincett eller ett rakblad för att utföra ett vertikalt snitt av ca 1 cm på huden nedanför bakhuvud.
  10. Separera försiktigt subkutan vävnad och muskler genom trubbig pincetts under dissektion mikroskop. Tryck ner den horisontella muskelknippet och hålla isär de två vertikala muskler fascicles för att exponera dura över foramen magnum.
  11. Med hjälp av extrem försiktighet, dissekera dura med en spruta nål eller mycket vassa pincett för att exponera hjärnstammen. En liten mängd cerebrospinalvätska kan spillas ut när dura har skurits.
  12. På den stereotaktisk mikromanipulator, rotera innehavaren av kapillär 45 ° från vertikalplanet. Placera kapillären vid mittlinjen, vid mittpunkten mellan den bakre spetsen på cerebellar cortex och den första halskotan. Sätt i pipetten på ett djup av 2 mm från ytan.
  13. Leverera en 0,5-1,5 l volym färgämne under 10-15 min. En mikroinjektion avgivningssystem tillåter kontrollerat tryck avgivning av vätska i kapillären (pulstryck = 20 psi; pulsvaraktighet = 3-4 msek; frekvensen av puls leverans = 12 Hz).
  14. Lämna kapillären på plats under 15 minuter, därefter slowly (2-3 min) ta bort den. Fint åter rikta musklerna och sutur i huden ovanför. Håll musklerna väl hydrerad genom att tillämpa en viss saltlösning under hela proceduren.
  15. För att undvika uttorkning, injicera subkutant 0,5 ml 0,9% NaCl. Håll djuret i en uppvärmd bur tills fullständig återhämtning från anestesi.
  16. Subkutant administrera Karprofen (5 mg / kg) dagligen i 2-3 dagar efter operationen.

2. Optisk Fönster på Cerebellar Cortex

OBSERVERA: Färgämnet transporteras i 2 veckor från den underlägsna olivary kärnan upp till cerebellar cortex till CFS terminaler (se figur 1). De glest märkta CFS kan visualiseras under ständig kraniala fönstret som kan utföras på följande sätt:

  1. Sterilisera alla kirurgiska instrument.
  2. Bedöva musen som beskrivs ovan. Använd tå nyper för att kontrollera att djuret är helt sövd.
  3. Raka håret ovanför huvudet, torka av skin med alternerande swipes av 70% alkohol och Betadine och applicera ögonsalva. Placera musen i en stereotaktisk ram och placera örat barer, för att stadigt hålla huvudet.
  4. Subkutant administrera Dexametason (0,2 mg / kg) och Karprofen (5 mg / kg) för att förhindra svallning av hjärnan och eventuella inflammationer vid den kraniala fönster stället.
  5. Applicera en droppe av lidokain på huden ovanför skallen och skär en flik, från mellan öronen till över ögonen. Applicera lidokainlösning igen in på benhinnan innan skrapning den med en skalpell.
  6. Använd tandläkarborr för att förtunna ett halvcirkulärt område av skallen ovanför lillhjärnan. Fönstret är vanligtvis placerad centralt och mot baksidan sutur, så att skallen djup är nästan konstant över hela omkretsen av den halvcirkel. Placering av fönstret för nära lambda sutur och repetitiva borrning under denna mycket tjock region kan leda till överhettning av hjärnan och bildning av ödem.
  7. Applicera hemostatisksvamp på skallen vid blödning.
  8. Skär ett täckglas i två halvor med hjälp av ett rakblad och pincett. Kontrollera att coverglass är något större än ön av ben och har en liknande form innan du tar bort luckan av ben med pincetten; om inte, omforma coverglass eller välj en annan. Rör inte dura mater med pincetten medan du ritar av ben. Lägg försiktigt ned coverglass på dura. ANMÄRKNING: vidhäftning av hela ytan av glaset på dura är förutsäga av långtids kraniala fönster.
  9. Ta bort luftbubblor i glaset genom att upprepade gånger skölja med koksaltlösning och torka med bomullspinnar. Detta kommer också att bidra till att ta bort en del kvarvarande blod som kan spillas ut ur små kapillärer efter positionering av glaset. Täta fönster med en blandning av akryl-lim och tandcement 30.
  10. Hålla djuret på en värmedyna i en återvinningskammare till dess helt återhämtat sig från bedövningen. Återanvänd intevrid möss i buren tills helt åter; inte lämna dem utan uppsikt tills de återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
  11. Subkutant administrera Karprofen (5 mg / kg) dagligen i 2-3 dagar efter operationen.

3. In Vivo Multi-photon laser Axotomy

  1. Vänta 2-7 dagar från operationen innan du utför den första avbildning session. Den specialbyggda två-photon mikroskop som används här är försedd med en Ti: Sapphire laserkälla (120 fs bredd pulser, 90 MHz repetitionsfrekvens), som först genomsöks av ett par galvanometrisk speglar och sedan fokuseras på provet genom en nedsänkning i vatten 20X objektiv (NA 0,95, WD 2 mm). En slutna piezoelektriska skede utför axiella förskjutningar upp till 400 nm av målet. Fotomultiplikatorrör samla fluorescenssignalen.
  2. Söva djuret, sedan placera huvudet i stereohållaren så att den kraniala fönstret lägger parallellt med SYFTEve fokalplan.
  3. Utforska med TPF avbildning hjärnbarken under kraniala fönstret. Välj axonet skadas bland de ljusaste.
  4. Skaffa en Z-stack (vanligtvis synfältet är 100 x 100 ìm 2, på 512 x 512 bildpunkter, 2 ìm z-axelsteg) för att få en 3D-rekonstruktioner av den riktade axon. Inom den avbildade volymen, välja lesionsstället på en axonal gren som ligger mestadels parallellt med fokalplanet. Denna inriktning gör det möjligt att snabbt göra mål morfologiska förändringar, som är prediktiva för en lyckad dissektion.
  5. Bestråla med en hög energidosen den valda punkten på en distal del av en CF. Detta görs via Labview programvara: öka lasereffekt 5-10x mer än den effekt som används för avbildning (≈ 300 mW, mätt efter objektiv), ange läget för de galvanometrisk speglar för att göra en linje scan (~ 4 - 10 | im) på skadestället och öppna laser slutare för 400 till 600 msek. Passa linjeavsökningenvinkelrät mot CF plan att helt tvärsnitt av axonet. Bestråla ljusare fläckar (t ex., Varicosities) brukar hjälpa dissekera axonet. Våglängden för laser axotomy är samma som används för avbildning (920 nm).
  6. Vanligtvis fluorescensen hos axonen i det bestrålade området transient minskar på grund av fotoblekning. Skaffa en stapel av samma region några minuter efter bestrålningen för att säkerställa att ablation har varit väl utförts. Om regionen började svullnad och axonet bildade pärla liknande strukturer, har neuron framgångsrikt dissekeras. I så fall, på några timmar (från några tiotals minuter till 24 timmar) den distala delen av axonen kommer urarta och försvinna helt.
  7. Tyvärr den dos som krävs för att producera en komplett axotomy energi är inte alltid förutsägbar. Om det enda resultatet av bestrålningen fotoblekning, bör fluorescensen snabbt återhämtat sig på grund av att färga diffusion, och bestrålningen bör upprepas igen för effektivly dissekera axonet. Också i fall tecken på svallning inte förekommer inom 5 - 20 minuter, eller svällning följs av återhämtning (. Analogt med vad som beskrivits för laser dendrotomy, se Allegra Mascaro et al 23), försök igen med nya avsökningar öka uppehållstid och / eller lasereffekten.
  8. Övervaka eventuell ombyggnad av axonet i dagarna som följer laser axotomy med två-photon in vivo imaging (figur 2 och 3). Den vaskulära mönstret används som referensmönster för att hämta den dissekerade axonet under de följande dagarna.
  9. Subkutant administrera Karprofen (5 mg / kg) varje avbildning session under hela experimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskrivs hur du utför axonal märkning, in vivo imaging och laser axotomy på enstaka nervceller. Tidslinjen av experimentet visas i Figur 1.

Ett exempel på CFS märkta med Alexa Fluor 488 Dextran och visualiseras under kraniala fönstret genom in vivo-två-photon mikroskopi redovisas i Figur 2. Som tidigare rapporterats 6,27, de uppstigande grenar visar en hög stabilitet under hela observationsperioden på flera dagar .

Figur 3 visar ett exempel på axonal avskärning med laser axotomy av en enda gren av en CF. Såsom tidigare beskrivits har den skada som utförs genom att bestråla en distal grenen (~ 30 | im under pia) av ett CF med en hög energidosen av infrarött ljus. Såsom visas i den andra panelen i figur 3, 15 min efter laserbestrålning den distala delen av axonet började svälla och degenerating. Dagen efter den del av axon distalt om skadestället försvunnit fullständigt (Figur 3, d17). Den degenererade delen markeras med de röda pilarna i tidsförloppet. De sista två panelerna visar också den progressiva bildandet av en ny tvärgående gren (grön pilspets) från den skadade axonet (mer information om groning av nya kontor efter laser axotomy in vivo finns i 6).

Figur 1
Figur 1. Tidslinje för lasersnanosurgery experimentet. Efter injektion i underlägsen olivary kärnan kommer två veckors återhämtning tillåta antero dextran-konjugerade färgämne för att märka klättring fibrer. Den cerebellär cortex exponeras sedan genom att utföra en permanent kraniell fönster. Från 2-7 senare, kan de märkta CFS avbildas under två-photon MICRoscope in vivo vid godtyckliga tidsintervall. Lasern nanosurgery på de märkta axoner kan utföras när som helst efter den kraniala fönster har implanterats.

Figur 2
Figur 2. Klättring fibrer märkningen. Den vänstra panelen visar ett exempel på ett CF-märkt med Alexa Fluor 488 Dextran och visualiserades in vivo genom TPF mikroskopi. Höger paneler visa tidsförlopp bilder av samma CF från dag 16 (d16) till d18. Scale bar, 10 | im.

Figur 3
Figur 3. Laser axotomy på en enda gren av en klättring fiber. Neuron bestrålades där den röda pilen pekar på d16. Röda pilspetsar highlight försvinnandet av den distala delen av axonet efter laser axotomy (d18). Ett nybildat tvärgående gren påpekats av den gröna pilspets. Scale bar, 10 | im.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll visar hur man märka nervceller i sämre oliv med en fluorescerande färg. Därefter används metoden för att göra en kraniell fönster på cerebellar cortex beskrivas. Denna teknik ger optisk access till terminaldelen av olivocerebellar nervceller, klättring fibrerna. Tyvärr, är ganska låg resultatet av både märkning och kraniotomi kirurgi även i händerna på skickliga operatörer (vanligtvis 1 av 3 möss är märkt, och 1 av 3 kraniala fönster förblir klar efter 1-2 veckor).

Proceduren att utföra laser axotomy i levande möss presenteras sedan. Denna metod gör att dissekera fluorescerande nervceller i utvalda anläggningar. Samtidigt som vanligen används paradigm skada, antingen genom mekanisk avskiljning eller användning av kemikalier, orsaka omfattande störningar i hjärnvävnad, är den viktigaste styrkan i denna modell med hög rumslig instängdhet och specificitet. I själva verket tidigare studier visat att enstaka ryggar kan borttagen utan att skada than strukturell integritet hos moder dendrit 5; Dessutom kan enstaka axonala grenar störas undvika bildandet av en ihållande glial scar 6. Den degeneration processen kan sedan följas i realtid, samt eventuell ombyggnad av den skadade neuron. Denna metod är därför ett kraftfullt verktyg för att studera den grundläggande mekanismen av axonal strukturell plasticitet in vivo.

Möjligheten att dissekera utvalda strukturer beror i första approximation på djupet av strukturen och på dess fluorescensemissionsintensitet. Trots att två foton mikroskopi tillåter avbildning nervceller upp till 600-800 nm djup, fann vi att nanosurgery är begränsad till de första lagren av hjärnbarken (upp till 300 mm).

I detta protokoll laser axotomy var riktad till cerebellär klättring fibrer, men det kan användas för att dissekera varje fluorescerande struktur i levande hjärna. Laser strålning har använts för att dissekera enda neuronal cell organ, dendritiska grenar, axoner eller enstaka ryggar av GFP-märkta pyramidala nervceller i hjärnbarken av transgena möss 5,8,9,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab standard stereotaxic, rat and mouse Stoelting  51670
Borosilicate glass with filament Sutter Instrument Inc BF100-50-10
Germinator 500 (Glass bead sterilizer) Roboz
Microinjection dispense system Picospritzer
Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) Warner Instruments  64-0720
Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate Coherent Chameleon 
Spongostan, hemostatic sponge Ferrosan MS0005
Galvanometric mirrors  GSI Lumonics VM500+
Objective Olympus XLUMPLFLN 20XW
Piezoelectric stage  Physik Instrumente P-721
Photomultiplier modules  Hamamatsu Photonics H7710-13
LabVIEW System Design Software National Instruments
Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) Boheringer Ingelheim
Rymadil (carprofen)  Pfizer
Lidocaine clorohydrate 2% ATI
Alexa488 dextran Life Technologies D22910

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
  2. Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
  3. Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
  4. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
  5. Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
  6. Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
  7. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
  8. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  9. Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
  10. Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
  11. Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
  12. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  13. Luo, L., O'Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
  14. Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
  15. Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
  16. Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
  17. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  18. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  19. Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
  20. De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
  21. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  22. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
  23. Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
  24. Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
  25. Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
  26. Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
  27. Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
  28. Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
  29. Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
  30. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).

Tags

Neurovetenskap axonal märkning neuronal spårning, två foton mikroskopi lillhjärnan klättring fibrer laser axotomy kraniotomi
Lasernanosurgery av Cerebellar Axoner<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allegra Mascaro, A. L., Sacconi, L., … More

Allegra Mascaro, A. L., Sacconi, L., Pavone, F. S. Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo. J. Vis. Exp. (89), e51371, doi:10.3791/51371 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter