कॉर्नियल Micropocket परख: माउस आँखों में angiogenesis की एक मॉडल
Summary
प्रोटोकॉल चूहों में विकसित रूप में कॉर्निया micropocket परख का वर्णन है.
Abstract
माउस कॉर्निया micropocket परख angiogenesis के मूल्यांकन के लिए एक मजबूत और मात्रात्मक इन विवो परख है. स्वाभाविक रूप से avascular कॉर्निया में रक्त वाहिनियों की वृद्धि को गति प्रदान कि विशिष्ट वृद्धि कारक युक्त मानकीकृत धीमी गति से जारी छर्रों का उपयोग करके, angiogenesis मापा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस परख में वाहिकाजनक प्रतिक्रिया प्रयोग किया जाता वृद्धि कारक के प्रकार और मात्रा पर निर्भर करता है, कई दिनों के पाठ्यक्रम पर उत्पन्न होता है. neovascularization की प्रेरण आमतौर पर या तो बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) या संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) से शुरू हो रहा है. Sucralfate और Hydron (पाली हेमा (पाली (2 hydroxyethyl methacrylate))) और छर्रों में मिश्रण कास्टिंग के साथ इन वृद्धि कारकों के संयोजन से, वे शल्य चिकित्सा माउस आंख में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. ये वर्दी छर्रों पोत क्षेत्र q के लिए आवश्यक पर्याप्त वाहिकाजनक प्रतिक्रिया सक्षम करने (क्रमशः bFGF या वीईजीएफ़) पांच या छह दिनों में वृद्धि कारकों धीरे धीरे जारीएक भट्ठा दीपक का उपयोग uantification. इस परख वाहिकाजनक न्यूनाधिक दवाओं या उपचार के साथ ही angiogenesis प्रभावित करने वाले विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच तुलना के मूल्यांकन सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख अभ्यास के बाद एक कुशल अन्वेषक आंख प्रति कम से कम 5 मिनट में एक गोली प्रत्यारोपण कर सकते हैं.
Introduction
angiogenesis की प्रक्रिया, नई रक्त वाहिकाओं के गठन के पहले से मौजूद लोगों को फार्म, अत्यधिक जटिल है और पोत अंकुरण और morphogenesis के विभिन्न चरणों को नियंत्रित कि कई अंतर्जात कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है. एंजियोजिनेसिस कारण समर्थक और विरोधी वाहिकाजनक कारकों के बीच संतुलन में बदलाव, सामान्य रूप से एक मौन राज्य में vasculature का कहना है कि एक संतुलन के लिए शुरू हो रहा है. वयस्कों में angiogenesis ऐसी महिला डिम्बग्रंथि चक्र के दौरान के रूप में या इस तरह के घाव भरने और ऊतक उत्थान के रूप में मरम्मत की प्रक्रिया में कुछ शारीरिक स्थितियों में होता है. हालांकि, यह भी कैंसर, autoimmune शर्तों और भड़काऊ रोगों सहित कई विकृतियों की एक बानगी है. इन शारीरिक और रोग की स्थिति में angiogenesis की भागीदारी यह अनुसंधान और उपचार के लिए एक आकर्षक लक्ष्य के लिए एक महत्वपूर्ण विषय बना देता है.
कारण angiogenesis की जटिलता और कई CE के शामिल होनेमॉडल सीमित रहते हैं और अद्वितीय में विवो microenvironment पुनरावृत्ति नहीं कर सकते हैं इन विट्रो endothelial कोशिकाओं, pericytes, घूम कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं, सहित प्रक्रिया में LLS और कारकों. angiogenesis के लिए इन विट्रो assays में मुख्य काफी हद तक endothelial कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष प्रभाव देख और नियंत्रित परिस्थितियों में वाहिकाजनक प्रक्रिया में कुछ कदम मापने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. ये assays endothelial सेल प्रसार 1, माइग्रेशन 2, नेटवर्क के गठन 3, ट्यूब गठन 4 की मात्रा का ठहराव और spheroids 5 से अंकुरण शामिल हैं. पूर्व vivo मॉडल, इन विट्रो लोगों के विपरीत, अधिक जटिल हैं और कई ऊतक प्रकार की कोशिकाओं को शामिल, एक उदाहरण है महाधमनी रिंग परख 6. विवो में मौजूद है फिर भी, अन्य प्रणालियों की तरह, यह घूम कोशिकाओं के योगदान और endothelial कोशिकाओं के प्राकृतिक स्ट्रोमा कब्जा नहीं कर सकते. प्रयासबहुत सुधार हुआ है, हालांकि microfluidic सिस्टम 7 का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे इन विवो सेटिंग, लेकिन फिर भी इन assays नकल करने के लिए प्रवाह के तहत angiogenesis अध्ययन करने के लिए, अभी भी विवो में मौजूदा सभी डिब्बों के लिए खाते में करने में असमर्थ हैं.
कारण इन विट्रो और पूर्व vivo angiogenesis मॉडल, की सीमाओं के vivo मॉडल angiogenesis के अध्ययन के लिए और अधिक विश्वसनीय विकल्प रहते हैं. इन मॉडलों के उदाहरण माइक्रोस्कोप 8 के तहत बढ़ रही रक्त वाहिकाओं के दृश्य की अनुमति है कि पारदर्शी कक्षों, "विंडोज", का आरोपण शामिल हैं, ऐसे में इस तरह के माउस कान और चिकन chorioallantoic झिल्ली के रूप में सामान्य ऊतकों में Matrigel और पोत के गठन के रूप में इंजेक्शन चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण (सीएएम ). हालांकि, सबसे स्वीकार्य और मात्रात्मक vivo में angiogenesis मॉडलों में से एक स्वाभाविक रूप से avascular कारनामे जो यहाँ वर्णित कॉर्निया micropocket neovascularization परख है,एक "स्क्रीन" के रूप में कॉर्निया कल्पना और नए वाहिकाजनक वृद्धि 9 का आकलन करने के लिए.
चूहों में विकसित रूप में यहाँ हम कॉर्निया micropocket परख का वर्णन. प्रारंभ में मॉडल खरगोश कॉर्निया में अविशिष्ट वाहिकाजनक उत्तेजनाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह खरगोश आंख की पूर्वकाल चैम्बर के जलीय हास्य में ट्यूमर टुकड़े शुरू करने से किया जाता है और ट्यूमर प्रेरित neovascularization 11 मापा गया था.
हालांकि, परख बाद में बेहतर निर्दिष्ट और वाहिकाजनक प्रभाव मानकीकृत करने के लिए विशेष विकास के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए 10 कारकों विकसित किया गया था. आंख में वृद्धि कारक जारी करने के लिए आदेश में, वाहिकाजनक वृद्धि कारकों के ज्ञात मात्रा युक्त धीमी गति से जारी छर्रों के बजाय ऊतकों का इस्तेमाल किया गया. ऐसे bFGF या वीईजीएफ़ के रूप में शुद्ध पुनः संयोजक वाहिकाजनक प्रोटीन की उपलब्धता angiogenesis modulaters 12 के विशिष्ट लक्ष्यों के रूप में उनके उपयोग के सक्षम होना चाहिए. प्रारंभ में, परख थामोटे तौर पर अपने आकार की वजह से, लेकिन बाद में मॉडल चूहों में अनुवाद किया गया था के साथ काम करने के लिए आसान कर रहे हैं जो खरगोश, में इस्तेमाल किया; एक छोटे और कम खर्चीला पशु मॉडल. चूहों को खरगोश से स्थानांतरण जिससे angiogenesis 13 प्रभावित आनुवंशिक घटकों में अनुसंधान का एक नया क्षेत्र बनाने, आनुवंशिक रूप से चालाकी से पशुओं का उपयोग करने में सक्षम होने का एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान की. Angiogenesis का अध्ययन करने में कॉर्निया परख के अधिक स्वीकार्य उपयोग करने के अलावा, अन्य जैविक प्रक्रियाओं को भी संशोधित assays का उपयोग जांच की जा सकती है. उदाहरण के लिए, lymphangiogenesis की पढ़ाई विशिष्ट आणविक मार्कर 14 के माध्यम से लसीका वाहिकाओं के दृश्य अनुमति दी है जो कम खुराक bFGF छर्रों का आरोपण के माध्यम से संभव बनाया गया. इसके अलावा, इस परख angiogenesis 15 पर विकिरण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराया गया है.
योग में, कॉर्निया micropocket एंजियोजिनेसिस परख एक मात्रात्मक, प्रतिनिधि हैroducible, vivo में angiogenesis के लचीला आकलन. इस परख का एक प्रमुख लाभ वाहिकाओं एक स्वाभाविक रूप से avascular ऊतक पर बढ़ने क्योंकि पृष्ठभूमि जहाजों की माप अनावश्यक है. हम यहाँ के विवरण में इस परख के प्रोटोकॉल का वर्णन है और हो सकता है जो विभिन्न परिदृश्यों पर चर्चा की. परख 3 असतत क्षेत्रों के होते हैं. यहाँ हम परिणामस्वरूप neovascular विकास यों इस्तेमाल वृद्धि कारक समावेशी छर्रों की तैयारी, बाद में शल्य आरोपण और अंत में विधि का वर्णन करेंगे.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल कॉर्निया परख प्रदर्शन में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. पहले प्रत्यारोपित किया जा रहा है और वाहिकाओं उत्तेजक सक्षम वर्दी छर्रों कर रही है. गोली तैयार करने का सबसे महत्वपूर्ण भागों) वाहक मुक्त वृद?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ग्राफिक काम के लिए क्रिस्टिन जॉनसन धन्यवाद.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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