Summary
该协议描述为开发在小鼠角膜微囊测定。
Abstract
小鼠角膜微囊法是一个强大的和定量的体内试验，用于评估血管生成。通过使用含有该触发血管生长的整个自然股骨头缺血性角膜特异性生长因子标准化的缓释小球，血管生成可被测量和量化。在该测定中的血管生成反应是在数天的过程中产生的，这取决于所用的生长因子的类型和剂量。新血管形成的诱导通常由任一碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）或血管内皮生长因子（VEGF）引起的。通过组合这些生长因子与硫糖铝和昌（聚-HEMA（聚（2 - 羟乙基甲基丙烯酸酯）））和铸造的混合物制成丸粒，它们可以通过外科手术植入在小鼠眼。这些颗粒均匀缓慢释放的生长因子在五，六天（bFGF的或VEGF分别为），使所需的船只区域Q足够的血管生成反应uantification用裂隙灯。此测定法可用于不同的应用，包括血管生成调节剂的药物或治疗方法，以及影响血管生成不同的遗传背景之间的比较进行评价。练此法后，一个熟练的研究者可以在每眼不到5分钟植入颗粒。
Introduction
血管生成的过程中，新血管的形成，形成预先存在的那些，是非常复杂的，并通过控制不同的步骤血管出芽和形态发生的几内源性因子的调节。血管生成是由于亲和抗血管生成因子之间的转变，平衡，通常保持在静止状态下的脉管系统的平衡被触发。血管发生在成人中发生一定的生理条件，如女性卵巢周期期间或在维修过程中如伤口愈合和组织再生。然而，它也是几种病状，包括恶性肿瘤，自身免疫性疾病和炎症性疾病的标志。血管生成的这些生理和病理条件下参与使得它对于研究和治疗的一个有吸引力的目标的一个重要课题。
由于血管发生的复杂性和几种策的参与LLS和因素的过程中，包括内皮细胞，周细胞，循环细胞和基质细胞， 在体外模型中仍是有限的，不能概括的唯一的体内微环境。 在血管生成的体外测定法的主要在很大程度上集中于观察对内皮细胞的直接影响和控制的条件下测量在血管生成过程中的某些步骤。这些测定法包括内皮细胞的增殖1，迁移2，网络形成三管形成4的量化，并从球状体5发芽。 体外模型，不同的是在体外的人，都比较复杂并包含多种组织类型的细胞，一个例子是主动脉环测定法6。然而，像其他系统，它不能在体内存在的捕获循环细胞和贡献内皮细胞的天然基质。尝试研究根据流量的血管生成模拟体内环境使用微流体系统7中执行，但即使是这些试验中，虽然大大改善，仍无法考虑到所有存在于体内的车厢。
由于在体外和离体血管生成模型中，限制在体内模型仍然是血管生成的研究更可靠的选择。这些模型的实例包括透明腔室，“窗口”，即允许的生长血管显微镜8下的可视化的植入剂，注射皮下植入物，如基质胶和血管形成中的正常组织，如小鼠耳和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM ）。然而，最可接受的和定量的体内血管生成的模型之一是在此描述的角膜微囊新血管形成测定法，其利用了自然股骨头缺血性角膜作为一个“屏”的可视化和评估新的血管生长9。
在这里，我们描述了角膜微囊测定作为开发中的小鼠。最初的模型被用来测量在兔角膜的非特异性血管生成的刺激。这是通过引入肿瘤块放入兔眼的前房的前房进行测定和肿瘤诱导的血管生成11。
然而，该法后来演变来研究特定生长因子的影响10，以更好地说明和规范血管生成作用。为了释放生长因子在眼内，来代替组织中含有已知量的血管生成生长因子的缓释颗粒。纯化的重组血管生成蛋白如的bFGF或VEGF的可用性使他们的血管生成modulaters 12的具体目标使用。最初，该测定是主要用于在兔，这是更容易使用，因为它们的大小，但后来的模型被翻译成小鼠正常工作;更小和更便宜的动物模型。从兔转移到小鼠的效果是：能够使用遗传操作的动物，从而产生一个新的研究领域进入遗传组分影响血管13的一个重要优点。除了角膜法的研究血管生成的多种可接受的使用，其他的生物学过程，也被用改性试验研究。例如，淋巴管生成的研究，通过低剂量的bFGF球团这使淋巴管，通过特定的分子标记14的可视化的植入能够成为可能。此外，该测定中提供了评估血管生成15辐射的影响的装置。
在总结中，角膜微囊血管生成分析是定量的，代表roducible，血管生成的体内灵活的评估。该测定的主要优点是，背景血管测量是不必要的，因为血管生长在天然无血管组织。我们在这里描述这个实验的详细协议，并讨论可能出现不同的情况。该试验由3离散区段。在这里，我们将描述的生长因子包括粒料用于量化所得到的新血管生长的制备，随后的外科手术植入，最后的方法。
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Protocol
所有涉及动物的协议是在波士顿儿童医院提交并经实验动物管理和使用委员会，并按照协会评估实验动物照护及认可委员会（AAALAC）的建议进行的。请务必使用消毒仪器和无菌techniqure在执行的过程。
1，制备的颗粒
- 称取硫糖铝10毫克，并用无菌展平铲60毫克海昌的。发生在不同的离心管。
- 将1厘米见方的块网格进入无菌10cm皿。反转所以目休息的浅盖。抛开。
- 加入500μl的乙醇，以在昌，涡旋至少10分钟。
- 添加生长因子（标准：20微克的bFGF和50微克的血管内皮生长因子），适量的硫糖铝和涡简要介绍。在商店里生长因子-80℃的冰箱中以1毫克/毫升的浓度。补充液体量应至少为20微升，以确保硫糖铝完全润湿，但不得超过50微升。更大的体积，使液体中的下一个步骤的蒸发困难。
- 将硫糖铝混合物倒入离心蒸发器在低设置，直到混合物完全干燥，通常30-50分钟取决于液体用的卷上。
- 检查残留水分的混合物，用无菌刮刀的锥形端。该混合物应该感到“脆脆”。
- 使用刮刀的锥形端，以在管内打破了硫糖铝混合物。
- 加入10微升昌与胃溃宁。
- 由于海昌的粘稠性，降低从200微升枪头年底再画，再吹打起来，加入到硫糖铝之前释放10微升。
- 赶紧使用弯曲的口水战乌拉混合的海昌和硫糖铝和管取出。
- 收集沿着弯曲刮铲尖的底侧的混合物，然后旋转该管的同时绘制抹刀沿所述管的壁。该混合物将迅速干燥所以这一步必须高效地完成。
- 用钳子将其固定到位混合物涂抹在准备网格。该混合物应为偶数层，填充到网格的孔中。
- 沉浸在弯曲刮铲入含管昌和使用目的是外套两侧。
- 将涂目靠在一边对菜的边缘，并允许在室温下干燥30-45分钟。
- 放置在-20℃冰箱网格或立即进行下一个步骤。保持网内盘。
- 将35毫米的菜大培养皿中，盖子里面。用钳子小心地拉网的纤维间隔超过35毫米的菜。流浪小球ç一个由在年底较大盘收集。
- 检查颗粒的均匀性下的范围。这个过程会产生约250颗粒因而每个块的标准剂量bFGF和VEGF是80纳克和200纳克，分别为。
- 商店粒料在35mm培养皿中的-20℃的冰箱中长达3个月。
球团2手术植入
- 设立手术显微镜下手术区域。
- 麻醉小鼠用阿佛丁（400-500毫克/千克，腹膜内），并在显微镜下将鼠标所以眼是可见的。执行脚趾捏，以确保麻醉足够的水平。
- 通过将1滴眼球之上的解决方案丙美卡因麻醉小鼠眼球。等待20-30秒，轻拍用纱布垫。
- Proptose鼠标眼睛的钝＃1珠宝商镊子是一定要离开钳和眼睛之间的皮肤。它来判断正常施加的压力是很重要的。60;拿着眼睛太用力会导致它变成红色并有点烦，而太松一抱让眼睛在手术过程中移动。
- 使用30°microknife使切口入角膜的角膜缘约1毫米。切口应是1-2毫米长。切口应足够深，以穿透外上皮细胞层到midstroma但没有那么深破裂的眼睛。
- 用冯格赖夫刀做一个口袋垂直切口。
- 滑动角膜层下方的刀在切口部位并在轻轻地刀和移动它沿切口扩大的空间中，从而形成口袋。它有助于移动鼠标，以及能够与眼球的曲率工作。要小心，不要用刀尖向下推，以避免破裂的眼球。
- 湿＃5珠宝商的镊子与丙美卡因和挑球团起来了菜。放置在眼睛的颗粒。 滋润冯格赖夫刀丙美卡因和转移一些液体颗粒上，使橡胶和柔韧。去除多余的水分用纱布垫或棉签。
- 将沉淀到使用冯格赖夫刀到它里面推角膜层下方的口袋。一旦整个粒料是内部运行的冯格赖夫刀的平面侧上的网站，以检查该粒料是安全的。
- 涂眼三重抗生素软膏。
- 把鼠标和在相反的眼睛重复手术。
3，定量角膜新生血管。
让动物发展船舶在设定的时间段。容器等级的天取决于所用的生长因子。级bFGF对第6天5天，较弱的血管内皮生长因子植入的当天为0天。
- 麻醉用阿佛丁鼠标（400-500毫克/千克，腹膜内）。
- 用裂隙灯显微镜GRA丁。一个眼有作为测量辅助量化血管长度和距离的眼部周围的周长，该船只已萌生目镜内的手提袋，行。
- 按住鼠标的范围前，定位鼠标指针的眼睛被认为是在眼部与球团正前方。稳定的拇指和食指之间的头，使皮肤收紧面部和眼部轻微proptosed。
- 放置在手提包的y轴沿角膜缘容器直接沉淀的下方。测量血管分支向上朝向丸粒的长度。记录此测量以毫米的十分之一，并指定容器长度（VL）（ 图1A）。
- 转动鼠标或分划板，使眼部周围的距离，这些船只如雨后春笋变得清晰。它是最容易想到的眼睛作为时钟面具有1间隔的通过12候这个数目时钟小时（CH）（ 图1中B）。它可以是一个整数或为0.25（ 例如，2，2.25，2.5或2.75）的级分。注：CH是主观的。例如，一些可以测量眼部周围的距离，包括来自角膜缘萌生，而其他人可能会停止在该点所在船只长度为半最大测量所有船只。的重要因素，是要与一个如何选择等级相一致。
图1：定量角膜新生血管（A）80纳克的bFGF颗粒植入C57BL / 6J小鼠显示出裂隙灯手提袋导向来衡量血管长度。 VL = 0.9毫米。 （二）同一只眼睛的表现裂隙灯手提袋旋转测量时钟小时。 CH = 3.25。计算出的血管面积= 1.84毫米2。这些图像被数字提高到允许添加划板原理图， 请点击这里查看大图。
- 计算血管面积（VA）使用下面的公式，它是基于椭圆的面积（注意，这是有帮助的分级时，记住这一点。）特快VA在平方毫米。其计算公式如下：
Vessel长度x时钟小时×0.2 =π血管面积
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Representative Results
典型的结果为bFGF和VEGF的小球在正常低血管C57BL / 6J小鼠示于图2A和B中 。 图2E示出了血管区域的正态分布（VA）在C57BL / 6J应变与不同剂量的这些生长因素。 80纳克的bFGF粒料通常导致的约为2.0 mm 2的VA，虽然在一系列1.8-2.4毫米2的值是可以接受的。 200 ng的血管内皮生长因子颗粒通常导致0.7mm左右2的响应，范围可以接受的0.6-0.9毫米2的值。用于实验中的抗血管生成作用之嫌，较大的容器中的区域是可取的，以便能够以可视化的降低， 图3示出了对bFGF驱动的新生血管形成的抗血管生成药物沙利度胺的作用。治疗导致38％的抑制血管生长的。在实验中的增加可能可以预料，最好是使用低剂量的标准丸导致接近最大响应。小球组成的10-40纳克的bFGF会更合适（ 图2C）。
已知具有高血管生成响应特定生长因子的菌株能有一个弗吉尼亚州的两倍多，一个典型的小血管应变。 图2D显示了129S1 / SvImJ鼠标至20毫微克的FGF颗粒的反应。为了比较，在相同剂量的沉淀显示在C57BL / 6J， 如图2C所示 。丰富的表，详细说明各个菌株对两种bFGF-和VEGF诱导的新生血管形成的血管生成潜力之前已经公布本实验室13。
某些菌株或色素沉着可表现出增长的虹膜血管渗漏或响应于粒料。这可以发生在一个或一个单独的小鼠的双眼，并且可以或可以不通过耳鼻喉科一致在该测定法中进行怒火基。此现象可导致使血液填充前房（前房出血）虹膜血管破裂。 Hyphemas可以使分级角膜新生血管困难或不可能的。 图4示出了一个温和的（4A）此发生和严重（ 图4B）的形式。
图的生长因子诱导的角膜新生血管2实施例（A）的 80毫微克的bFGF丸注入到低血管C57BL / 6J小鼠，导致血管面积为2.0 平方毫米。这是很常见的这种剂量引起血管到达沉淀和长成的。 （二）20毫微克的bFGF颗粒植入到C57BL / 6J小鼠，导致血管面积等于1.04 平方毫米。 （C）200毫微克的VEGF丸植入C57BL / 6J小鼠，导致血管面积等于0.71 平方毫米。 （ 四）20毫微克的bFGF颗粒在高血管129S1 / SvImJ应变。相比于（C）中 ，也有20纳克FGF粒料，该菌株具有血管生成潜力大于两倍的C57BL / 6J小鼠。 （ 五）角膜新生血管面积（平均值±标准差，N = 10）诱导增加剂量VEGF或bFGF对C57BL / 6J小鼠。 点击这里查看大图。
图3抑制bFGF诱导贝丝的EL增长抗血管生成剂（A）控制车辆的处理C57BL / 6J小鼠。植入80纳克bFGF的颗粒产生的一组血管面积为2.0 平方毫米。 （B）的沙利度胺处理过的小鼠（200毫克/千克，口服，连续5天）。组血管面积为1.25 平方毫米，并反映38％减少血管的生长。 点击这里查看大图。
图4生长因子诱导hyphemas在小鼠虹膜（A）在C57BL / 6J-TyrC-2J / J轻度前房积血。该菌株具有相同的角膜新生血管作为色素的同行，而是更亲NE虹膜出血。 （二）大型前房积血在129P3 / J小鼠。整个眼睛有发红，以及血液更接近虹膜底部更加明显池。 点击这里查看大图。
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Discussion
有在执行一个成功的角膜检测的几个关键步骤。首先是制作能够被植入并刺激血管均匀的颗粒。粒料制备中最重要的部件是：1）使用无载体的生长因子; 2）确保生长因子与硫糖铝和海昌和3个好混合物）迅速但仔细一动最终混合物从Eppendorf管到的颗粒投网。我们建议进行“虚拟”颗粒无生长因子练技术。球团应该会出现白色和粉化，并大致呈正方形。这包括明确的区域的任何颗粒，应排除在外，因为这些区域可能只包含海昌。还应当指出的是，粒料形成有乙醇和bFGF和VEGF通过包括硫糖铝，它模仿了肝素结合稳定化。硫糖铝还用来提供缓慢释放的PLatform为生长因子。如果其他刺激剂或抑制剂被加入到该颗粒中，这些因素应进行测试首先确定稳定性乙醇。我们建议进行“虚拟”颗粒无生长因子的初步实践的技术。 “假”或假小球只包含被测试硫糖铝和昌用PBS代替的生长因子或化合物的量。这些颗粒不刺激血管生长或角膜缘发炎。假小球作为实验的一个适当的控制，其中的药剂被怀疑是促血管发生和不添加生长因子的沉淀物进行测试。化合物和生长因子能以颗粒为其中的相互作用被调查的实例，其中的生长因子的情况下，粒料单独将是适当的控制进行组合。
外科植入是在测定中最具挑战性的部分。0;它最初是非常困难的，以评估相应的深度的切口。过深的切口会使地球破裂和眼睛变得不可操作。这是一个戏剧性的效果，因此人们很快学会不要“啪”的眼睛。这需要相当长的时间始终做一个切口深，足以让口袋的形成。当切口太浅，角膜的最上层是容易损坏或与冯格赖夫刀撕下，因为它被插入以使口袋。定量的新血管生长的最后步骤需要在分级的方式一致。容器长度是一个简单的测量，而时钟小时值描绘眼部周围的圆周上的生长是更主观。所用的方法应该是相同的，从小鼠到小鼠和实验之间。
该测定法的另一个关键成分是麻醉的选择，它可以有上的简易性和外科手术的成功产生影响。注射阿佛丁是最复杂的，因为它可以很容易地操作鼠标在对比汽化麻醉经由鼻锥递送的。最好是避免氯胺酮和甲苯噻嗪的组合，以及由于其与角膜病变在啮齿类16,17关联。
要注意的实验过程中的小鼠的重量的任何变化是很重要的。减肥可以指示恶劣的住房条件或疾病，这些都可以鼠标的在眼部血管生长的能力产生负面影响。权重应采取的颗粒植入血管分级几天来确定权重的损失，这一比例（如有）。的5％或更少的损失是可以接受的，并可能导致从处理的小鼠中，尤其是在治疗实验频繁给药的应力。大于5％的重量损失是关系和非特异性会抑制血管生长。因此，从这样的实验结果应被视为无效。
考虑到固有的实验方差从过程技术和变量研究的功效，应当使用小鼠的最小数目来达到有效的结果。根据我们的经验，我们建议不超过每组5只小鼠产生的10眼的n少。
尽管角膜微囊法的诸多优点，也有一些限制。主要缺点是需要以掌握的技术相对长的训练周期。与在小鼠眼工作之前没有技术经验的个体将需要大约四个月的实践的前20-25老鼠的实验可被视为可靠。此外，也有不同的人谁进行测定，从而限制了实验之间进行比较的被执行的可能性之间的一些变在不同的时间由不同的人。该模型的另一个限制是，实验是相对短（5-6天），通过从球团的的bFGF或VEGF的释放受到限制。因此，该测定法是非常适合于在体内具有快速响应的疗法，虽然这可以部分地通过前处理的老鼠的前过程时所需要的长度来补偿。标准药物测试的分析通常会开始给药上的小球植入的当天（第0天）持续直到分级天（5天或6）。
这种技术的意义在于，它是最可靠的定量的血管发生测定法之一。在小鼠中的另一种是在基质胶塞分析中，但是该测定是更多的定性，并且更不与特定的生长因子，由于发生进插头广泛的细胞浸润。角膜测定法的灵活性允许一定制的量血管生成生成并选择一个特定的刺激。也能够代替在标准的生长因子与其它已知或怀疑的血管生成因子。此外，也可以结合标准的生长因子和可能的抑制剂相同的丸粒，以评估抗血管生成的活性，而不会全身递送内。最后，该测定法允许一个刺激血管生成的不同的遗传背景，其可以是在映射遗传效应和在建立特定的基因对血管生成的影响是有用的。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢克里斯汀·约翰逊的图形工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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