Summary
O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos.
Abstract
O ensaio microbolsa córnea do rato é um ensaio robusto e quantitativa in vivo para avaliar a angiogénese. A utilização de peletes de libertação lenta padronizadas, contendo factores de crescimento específicos que provocam o crescimento de vasos sanguíneos para a córnea naturalmente avascular, a angiogénese pode ser medida e quantificada. Neste ensaio, a resposta angiogénica é gerada ao longo de vários dias, dependendo do tipo e dose de factor de crescimento utilizado. A indução de neovascularização é normalmente desencadeada por qualquer factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Através da combinação destes factores de crescimento com o sucralfato e hídron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietil))) e lançando-se a mistura em grânulos, que podem ser implantados cirurgicamente no olho do rato. Estes peletes uniformes-se lentamente libertar os factores de crescimento ao longo de cinco ou seis dias (bFGF ou VEGF, respectivamente), que permite a resposta angiogénica suficiente necessário para a área do vaso quantification utilizando uma lâmpada de fenda. Este ensaio pode ser usado para diferentes aplicações, incluindo a avaliação de fármacos moduladores angiogénicos ou tratamentos, bem como a comparação entre diferentes origens genéticas que afectam a angiogénese. Um investigador perito depois de praticar este ensaio pode implantar um sedimento em menos de 5 minutos em cada olho.
Introduction
O processo de angiogênese, formação de novos vasos sanguíneos formam os pré-existentes, é altamente complexa e é regulada por vários fatores endógenos que controlam diferentes etapas do surgimento navio e morfogênese. A angiogênese é acionado devido a uma mudança no equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogênicos, um equilíbrio que normalmente mantém a vascularização em um estado inativo. A angiogénese ocorre em adultos em determinadas condições fisiológicas tais como durante o ciclo do ovário ou do sexo feminino em processos de reparação, tais como cicatrização de feridas e regeneração de tecidos. No entanto, é também uma característica de várias patologias, incluindo neoplasias, doenças autoimunes e doenças inflamatórias. O envolvimento da angiogênese nestas condições fisiológicas e patológicas torna um assunto importante para a pesquisa e um alvo atraente para a terapia.
Devido à complexidade da angiogênese e do envolvimento de vários cells e fatores no processo, incluindo as células endoteliais, pericitos, células circulantes e células do estroma, in vitro modelos continuam a ser limitados e não pode recapitulam o microambiente única in vivo. A principal ensaios in vitro de angiogênese são amplamente focada na observação de efeitos diretos sobre as células endoteliais e medir determinadas etapas no processo de angiogênese em condições controladas. Estes ensaios incluem a quantificação da proliferação celular endotelial 1, migração 2, a formação da rede 3, a formação do tubo 4 e brotação de esferóides 5. Modelos ex vivo, ao contrário dos in vitro, são mais complexos e incorporar vários tipos de células de tecido, por exemplo, ser o ensaio do anel aórtico 6. No entanto, como os outros sistemas, que podem não captar a contribuição de células circulantes e o estroma natural das células endoteliais como existe in vivo. Tentativaspara estudar a angiogênese sob fluxo para imitar o ambiente in vivo são realizados utilizando sistemas microfluídicos 7, no entanto, mesmo esses ensaios, embora muito melhor, ainda não consegue dar conta de todos os compartimentos existentes in vivo.
Devido às limitações do in vitro, ex vivo e modelos de angiogénese, em modelos in vivo, continuam a ser as escolhas mais fiáveis para estudos de angiogénese. Exemplos destes modelos incluem a implantação de câmaras transparentes, "janelas", que permitem a visualização de vasos sanguíneos que crescem sob microscópio 8, implantes subcutâneos injectáveis, tais como a formação de matrigel e recipiente em tecidos normais, tais como a orelha de rato e da membrana corioalantóica de frango (CAM ). No entanto, um dos modelos de angiogénese in vivo mais aceitáveis e quantitativos é o ensaio de microbolsa neovascularização descrito aqui, o qual explora o naturalmente avascularcórnea como uma "tela" para visualizar e avaliar o novo crescimento angiogênico 9.
Aqui nós descrevemos o ensaio microbolsa córnea desenvolvida em camundongos. Inicialmente, o modelo foi utilizado para medir a estímulos angiogênicos inespecíficos em córneas de coelhos. Isto foi feito através da introdução de peças tumorais no humor aquoso da câmara anterior do olho de coelho e medido a neovascularização induzida por tumores 11.
No entanto, o ensaio foi mais tarde evoluiu para estudar os efeitos de crescimento específico fatores 10 para melhor especificar e padronizar o efeito angiogênico. A fim de libertar o factor de crescimento do olho, peletes de libertação lenta que contêm quantidades conhecidas de factores de crescimento angiogénicos foram usados em vez de tecidos. A disponibilidade de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos, tais como VEGF ou bFGF permitiu a sua utilização como alvos específicos de angiogénese modulaters 12. Inicialmente, o ensaio eralargamente utilizado em coelhos, que são mais fáceis de trabalhar devido ao seu tamanho, mas mais tarde o modelo foi traduzido em ratos; um modelo de animais mais pequenos e menos caros. Mudando de coelho para ratos proporcionou uma importante vantagem de ser capaz de usar animais geneticamente manipulados, criando assim uma nova área de pesquisa sobre os componentes genéticos que afetam a angiogênese 13. Além do uso de mais aceitável de ensaio córnea em estudar angiogénese, outros processos biológicos também podem ser investigadas utilizando ensaios modificados. Por exemplo, se tornaram possíveis estudos de lymphangiogenesis através da implantação de baixa dose de pelotas bFGF que permitiu a visualização dos vasos linfáticos por meio de marcadores moleculares específicos 14. Além disso, este ensaio tem fornecido um meio para avaliar os efeitos da radiação na angiogénese 15.
Em suma, o ensaio microbolsa angiogênese corneal é uma quantitativa, reproducible, avaliação flexível de angiogênese in vivo. Uma vantagem principal deste ensaio é que a medição dos vasos de fundo é desnecessário, porque os vasos crescem no tecido avascular naturalmente. Descrevemos aqui o protocolo deste ensaio em detalhes e discutir diferentes cenários que podem ocorrer. O ensaio consiste em três segmentos distintos. A seguir, descreveremos a preparação de peletes de crescimento de factores, inclusive, o implante cirúrgico subsequente e, finalmente, o método utilizado para quantificar o crescimento neovascular resultante.
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Protocol
Todos os protocolos que envolvem animais são apresentadas e aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional do Hospital Infantil de Boston e são conduzidas de acordo com as recomendações da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC). Certifique-se de usar a instrumentação estéril e techniqure asséptica durante a realização do procedimento.
1 Preparação de peletes
- Pesar 10 mg de sucralfato e 60 mg de Hydron com a espátula unbent estéril. Coloque em microtubos separados.
- Coloque um pedaço quadrado de 1 cm da malha em um estéril prato de 10 cm. Inverter tão malha repousa sobre tampa rasa. Reserve.
- Adicionar 500 mL de etanol para o hídron vórtice e para, pelo menos, 10 min.
- Adicionar a quantidade apropriada de factor de crescimento (padrão: 20 mg para o bFGF, 50 ng de VEGF) para o sucralfato e vortex brevemente. Fator de crescimento da loja em um-80 ° C congelador a uma concentração de 1 mg / ml. Volumes de líquido adicionados deve ter um mínimo de 20 ul de assegurar o sucralfato é totalmente humedecido mas não deve exceder 50 ul. Maior volume faz com que a evaporação do líquido no próximo passo difícil.
- Coloque a mistura de sucralfato no evaporador centrífugo definido em baixo até que a mistura está completamente seco, normalmente de 30-50 minutos, dependendo do volume do líquido utilizado.
- Verificar-se a mistura para a humidade residual com a extremidade cónica de uma espátula esterilizada. A mistura deve se sentir "crocante".
- Utilizar a extremidade pontiaguda da espátula para separar a mistura de sucralfato no interior do tubo.
- Adicionam-se 10 ul da hídron ao sucralfato.
- Devido à natureza viscosa de Hydron, cortar a extremidade de uma pipeta de ponta de 200 mL e, em seguida, extrair e libertar os 10 ul antes pipetando para cima e de novo para a adição de sucralfato.
- Rapidamente use briga dobradoula para misturar o Hydron e sucralfato e retire do tubo.
- Reunir a mistura ao longo do lado inferior da ponta de uma espátula e, em seguida, dobrado rodar o tubo, enquanto o desenho da espátula para fora ao longo da parede do tubo. A mistura vai secar rapidamente assim que esta etapa deve ser feito de forma eficiente.
- Espalhe a mistura sobre a malha preparado usando uma pinça para segurá-la no lugar. A mistura deve ser uma camada uniforme e encher os orifícios da malha.
- Imergir a espátula dobrada para dentro do tubo que contém hídron e usá-lo revestimento de ambos os lados da malha.
- Coloque a malha revestido inclinando-se sobre o lado contra borda do prato e deixe secar à temperatura ambiente durante 30-45 min.
- Coloque a malha em freezer -20 ° C ou proceder de imediato para a próxima etapa. Mantenha malha dentro prato.
- Coloque prato de 35 mm no interior do prato de petri maior, tampa. Utilizar o par de pinças para puxar cuidadosamente as fibras da malha entre si sobre o prato 35 milímetros. Pelotas Stray cum ser recolhidos a partir do prato maior no final.
- Verifique pelotas para a uniformidade sob escopo. O processo produz cerca de 250 pastilhas, assim, a dose padrão por pellet de bFGF e VEGF é de 80 ng e 200 ng, respectivamente.
- Pelotas de lojas em 35 milímetros prato em freezer -20 ° C por até 3 meses.
2. implantação cirúrgica de Pelotas
- Configurar uma área cirúrgica sob microscópio cirúrgico.
- Anestesiar o mouse com avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) e posicione o mouse sob o microscópio para que olho é visível. Realize toe pitada de garantir um nível suficiente de anestesia.
- Anestesiar o olho do rato, colocando uma gota de solução proparacaina cima globo ocular. Aguarde 20-30 segundos e bata com uma compressa de gaze.
- Proptose o olho do rato com o # entorpeceu um joalheiro fórceps sendo certo para deixar a pele entre fórceps e olho. É importante para avaliar a pressão aplicada correctamente.60; Segurando o olho com muita força fará com que ele se torne vermelha e irritada, enquanto muito solta um porão permitirá que olho para mover durante a cirurgia.
- Utilizar a 30 ° microlanceta para fazer uma incisão na córnea de aproximadamente 1 mm do limbo. A incisão deve ser de 1-2 mm de comprimento. Incisão deve ser profundo o suficiente para penetrar além da camada epitelial em midstroma mas não tão profundamente para romper o olho.
- Utilizar a faca von Graef para fazer um bolso perpendicular à incisão.
- Deslize a faca sob a camada córnea no local da incisão e trabalhar suavemente faca e movê-lo ao longo da incisão para ampliar o espaço, formando assim o bolso. Isso ajuda a mover o rato, assim como para ser capaz de trabalhar com a curvatura do olho. Tenha cuidado para não empurrar para baixo com a ponta para evitar a ruptura do olho.
- Molhe o fórceps # 5 do joalheiro com proparacaina e pegar uma bolinha para fora do prato. Coloque um sedimento no olho. Umedeça a faca von Graef com proparacaina e transferir algumas de líquido sobre pellet para torná-lo elástico e flexível. Retire o excesso de umidade com gaze ou cotonete.
- Insira o pellet no bolso usando a faca von Graef para empurrá-lo para dentro abaixo da camada córnea. Uma vez que todo o sedimento está dentro, execute o lado plano de von Graef faca sobre o local para verificar se o pellet é segura.
- Cubra o olho com pomada antibiótica tripla.
- Vire o mouse e repetir a cirurgia no olho oposto.
3 Quantificação de neovascularização da córnea.
Deixe os animais para desenvolver vasos durante um determinado período de tempo. O dia de peneiração navio depende do factor de crescimento utilizado. Grau de bFGF no dia 5 e o mais fraco de VEGF no dia 6 o dia da implantação é o dia 0.
- Anestesiar o mouse com avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal).
- Use o microscópio lâmpada de fenda para grading. Uma ocular tem uma retícula, linhas dentro da ocular usado como um auxílio de medição para quantificar comprimento do vaso e distância ao redor da circunferência do olho que as embarcações surgiram.
- Mantenha o mouse na frente do escopo, posicionando o mouse para que olho é visto na ocular com pellet em frente. Estabilize a cabeça entre o polegar eo dedo indicador de modo a pele é apertada no rosto e olho é ligeiramente proptose.
- Colocar o eixo y do retículo ao longo do vaso de limbo directamente abaixo do pellet. Meça o comprimento dos navios de ramificação para cima em direção pellets. Grave esta medida em décimos de milímetros e designar comprimento do vaso (VL) (Figura 1A).
- Vire o mouse ou a bolsa para que a distância ao redor do olho que estes navios têm brotou se torna claro. É mais fácil pensar no olho, como um relógio, com intervalos de 1 a 12 designar este número relógio hora (CH) (Figura 1B). Ele pode ser um número inteiro ou fracções de 0,25 (por exemplo, 2, 2,25, 2,5 ou 2,75). Nota: CH é subjetiva. Por exemplo, alguns podem medir a distância em torno do olho para incluir todos os vasos germinados a partir do limbo, enquanto outros podem parar a medição no ponto onde o comprimento embarcação é metade máxima. O importante é ser consistente com a forma como se escolhe a classe.
Figura 1 A quantificação da neovascularização da córnea. (A) de 80 ng de bFGF pelota implantada em ratos C57BL / 6J rato mostrando lâmpada de fenda retícula orientada para medir o comprimento do navio. VL = 0,9 mm. (B) O mesmo mostrando olho lâmpada de fenda bolsa rodada para medir relógio hora. CH = 3,25. Área do vaso Calculado = 1,84 milímetros 2. Estas imagens digital ter sido aumentada para permitir a adição de esquema bolsa. Clique aqui para ver a imagem ampliada.
- Calcule a área do vaso (VA) usando a fórmula a seguir, que é baseado na área de uma oval (Nota, é útil para manter isso em mente quando de classificação.) Expresso VA em milímetros quadrados. A fórmula é a seguinte:
Hora x 0,2 π = área navio navio comprimento x Relógio
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Representative Results
Os resultados típicos para bFGF e VEGF nos peletes normais baixos angiogénicos C57BL / 6J são mostrados na Figura 2A e B, respectivamente. Figura 2E mostra a distribuição normal de área do vaso (VA) em C57BL / 6J estirpe com doses variáveis de crescimento esses fatores. 80 ng de bFGF peletes normalmente resultam em um VA de cerca de 2,0 mm 2, apesar de os valores no intervalo de 1,8-2,4 mm 2 são aceitáveis. 200 ng pelotas de VEGF incluem geralmente uma resposta de aproximadamente 0,7 mm 2, com um intervalo de valores aceitáveis de 0,6-0,9 mm 2. Para as experiências em que se suspeita de um efeito anti-angiogénico, áreas de vasos maiores são desejáveis para ser capaz de visualizar uma diminuição. Figura 3 mostra o efeito de talidomida a droga anti-angiogénico na neovascularização bFGF-dirigido. O tratamento resultou em 38% de inibição do crescimento dos vasos. Em experimentos em que um aumento podeser esperado o melhor é o uso de doses mais baixas, como o sedimento padrão provoca uma resposta máxima perto. Pellets consistindo de 10-40 ng de bFGF seria mais apropriado (Figura 2C).
Estirpes conhecidas por terem uma elevada resposta-angiogénico de um factor de crescimento em particular pode ter um VA mais do que duas vezes a de uma estirpe de baixa angiogénico típico. Figura 2D mostra a resposta de um rato 129S1 / SvImJ a um pelete 20 ng de FGF. Para efeitos de comparação, a mesma pastilha de dosagem é mostrada numa C57BL / 6 J na Figura 2C. Uma extensa tabela detalhando o potencial angiogênico de várias cepas, tanto para bFGF e neovascularização induzida por VEGF foi publicado anteriormente pelo nosso laboratório 13.
Certas estirpes ou pigmentações podem apresentar crescimento ou vazamento dos vasos da íris, em resposta a um sedimento. Isto pode ocorrer em um ou ambos os olhos de um ratinho individual e pode ou não ser consistente ao longo do entira grupo em que o ensaio é realizado. Este fenómeno pode resultar na ruptura dos vasos de sangue que causam íris para encher a câmara anterior (hifema). Hifemas pode fazer a classificação de neovascularização da córnea difícil ou impossível. Figura 4 ilustra uma leve (4A) e (4B) forma grave desta ocorrência.
Figura 2: Exemplos de crescimento induzida pelo factor de neovascularização da córnea. (A) de 80 ng de bFGF pelota implantada num baixo angiogénico rato C57BL / 6 J, resultando em uma área do vaso igual a 2,0 mm2. É muito comum para esta dose para levar os vasos para alcançar a pelota e crescer dentro dela. (B) de 20 ng de bFGF pelota implantada numaC57BL / 6J ratinho, resultando em uma área do vaso igual a 1,04 mm 2. (C) a 200 ng de VEGF pelota implantada em um / 6J rato C57BL, resultando em uma área do vaso igual a 0,71 mm 2. (D) 20 ng bFGF pellet no angiogênico alta tensão 129S1 / SvImJ. Comparado a (C), também um FGF pellet 20 ng, esta cepa tem um potencial angiogênico maior que o dobro da C57BL / 6J. (E) da córnea área neovascular (média ± SD, n = 10) em C57BL / 6J induzidas por doses de VEGF ou bFGF aumentando. Clique aqui para ver a imagem ampliada.
Figura 3 Inibição de vess induzida por bFGFcrescimento el pelo agente anti-angiogénico. veículo (A) de controlo tratados C57BL / 6J rato. Implantação de 80 ng de bFGF sedimento resultante em uma área do vaso grupo igual a 2,0 mm2. (B) A talidomida rato (200 mg / kg, por via oral durante 5 dias) tratado. Área do vaso Grupo equivale a 1,25 mm 2 e reflete diminuição de 38% no crescimento dos vasos. Clique aqui para ver a imagem ampliada.
Figura 4 Crescimento hifemas induzida pelo fator na íris murino. (A) hifema leve em um C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Esta linhagem apresenta o mesmo neovascularização como os seus homólogos pigmentadas, mas é mais prone Iris sangrando. (B) hifema em grande escala em um mouse 129P3 / J. Todo o olho tem uma coloração avermelhada, bem como piscinas mais pronunciados de sangue mais perto de base da íris. Clique aqui para ver a imagem ampliada.
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Discussion
Existem várias etapas críticas realização de um ensaio de córnea bem sucedido. A primeira é fazer pellets uniformes, capazes de ser implantado e estimular vasos. As partes mais importantes da preparação de pelotas são 1), utilizando o factor de crescimento isento de transportador; 2) garantir uma boa mistura de fator de crescimento com o sucralfato e Hydron e 3) movendo a mistura final rapidamente, mas cuidadosamente do tubo eppendorf à malha, onde as pelotas são lançados. Recomenda-se que os aglomerados de "manequim" ser feita sem o factor de crescimento para a prática da técnica. Pelotas deve aparecer branco e giz e ser mais ou menos em formato quadrado. Quaisquer pastilhas que incluem áreas claras devem ser excluídos como essas áreas provavelmente contêm apenas hydron. Deve também notar-se que os grânulos são formados com etanol e que o bFGF e VEGF são estabilizados através da inclusão de sucralfato, que imita ligação à heparina. O sucralfato também serve para proporcionar uma libertação lenta platform para os factores de crescimento. Se outros estimuladores ou inibidores são adicionados aos peletes, estes factores deverão ser testados em primeiro lugar para determinar a estabilidade em etanol. Recomenda-se que os aglomerados de "manequim" ser feita sem o factor de crescimento para a prática da técnica inicialmente. "Manequim" sham ou pelotas contêm apenas sucralfato e Hydron com PBS substituído pelo volume de factor de crescimento ou o composto a ser testado. Estas pastilhas não estimulam o crescimento dos vasos ou inflamação do limbo. Pelotas Sham servir como um controlo apropriado, em experiências em que se suspeita de um agente de ser pró-angiogénico e é testado sem a adição de factor de crescimento para a pelota. Compostos e fator de crescimento podem ser combinados em pelotas para casos em que a interação está sendo investigado, no qual pelotas caso do fator de crescimento por si só seria o controle apropriado.
O implante cirúrgico é a parte mais difícil do ensaio.0; É muito difícil, inicialmente, para medir a profundidade adequada para a incisão. Muito fundo de uma incisão faz com que o mundo a ruptura eo olho torna-se inoperante. Este é um efeito dramático e, portanto, um aprende rapidamente para não "estourar" o olho. Leva muito mais tempo para constantemente fazer uma incisão profunda o suficiente para permitir a formação de bolso. Quando a incisão é muito raso, a camada superior da córnea pode ser facilmente danificada ou rasgado com a faca von Graef medida que é inserido para fazer a bolsa. O passo final de quantificar o crescimento de novos vasos requer consistência na forma de classificação. Comprimento do navio é uma medição simples, enquanto o valor da hora do relógio que descreve o crescimento em torno da circunferência do olho é mais subjectivo. O método usado deve ser o mesmo a partir de rato para rato e entre experiências.
Outro componente fundamental do ensaio é a escolha da anestesia, o qual pode terum impacto sobre a facilidade e sucesso do procedimento cirúrgico. Avertina injectável é a menos complicada, uma vez que permite a fácil manipulação do rato, em contraste com a anestesia vaporizado entregue através de cone de nariz. É aconselhável evitar a combinação de cetamina e xilazina, bem como devido à sua associação com lesões da córnea em roedores 16,17.
É importante observar qualquer alteração no peso dos ratos durante a experiência. A perda de peso pode ser um indicativo de condições precárias de moradia ou doença e estes podem afetar negativamente a capacidade de um rato para crescer vasos nos olhos. Pesos devem ser tomadas em dias de implantação da pelota e classificação navio para determinar a percentagem de peso perdido, se houver. Perda de 5% ou menos é aceitável e pode resultar do stress de lidar com os ratos, especialmente durante as experiências de tratamento com doses freqüentes. Mais de 5% de perda de peso é preocupante e vontade inespecíficasuprimir o crescimento dos vasos. Assim, os resultados de tais experimentos devem ser considerados inválidos.
Para ter em conta as variações experimentais inerentes da técnica de procedimento e a eficácia das variáveis estudadas, um número mínimo de ratos deve ser usada para atingir resultados válidos. Em nossa experiência, aconselhamos não menos de 5 ratos por grupo produzindo um n de 10 olhos.
Apesar das muitas vantagens do ensaio da microbolsa córnea, existem também algumas limitações. A principal desvantagem é a necessidade de um período de formação relativamente longo a fim de dominar a técnica. Uma pessoa sem experiência técnica prévia trabalhando no olho do rato exigiria cerca de quatro meses de prática antes dos experimentos de 20-25 ratos pode ser considerado como confiável. Além disso, existem algumas variações entre os diferentes pessoas que realizam o ensaio, limitando, assim, a possibilidade de comparação entre ensaios que são realizadosem momentos diferentes por pessoas diferentes. Outra limitação deste modelo é que as experiências são relativamente curtos (5-6 dias) e são restritas pela liberação do bFGF ou VEGF do sedimento. Por isso, este ensaio é altamente adequado para terapias que têm uma resposta rápida in vivo, embora isto possa ser parcialmente compensada pelo pré-tratamento dos ratinhos durante período de tempo desejado antes do procedimento. Ensaios de testes de drogas convencionais geralmente começam administração no dia da implantação da pelota (Dia 0) continua até o dia de graduação (dia 5 ou 6).
O significado desta técnica é que é um dos ensaios de angiogénese quantitativos mais fiáveis. Uma alternativa em ratos é o ensaio de tampão de Matrigel, no entanto, este ensaio é mais qualitativa e é menos específico para um determinado factor de crescimento devido a uma grande infiltração de células que ocorre na bucha. A flexibilidade do ensaio da córnea permite adequar a quantidadeda angiogênese gerado e escolher um estimulador específico. É possível substituir os fatores de crescimento padrão com outros fatores angiogênicos conhecidos ou suspeitos. Além disso, é possível combinar os factores de crescimento convencionais e inibidores possíveis dentro da mesma pastilha para avaliar a actividade anti-angiogénico, sem distribuição sistémica. Finalmente, este ensaio permite estimular a angiogénese em diferentes origens genéticas, que podem ser úteis no mapeamento de efeitos genéticos e para estabelecer o impacto de um gene em particular na angiogénese.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Kristin Johnson para o trabalho gráfico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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