Het protocol beschrijft de corneale micropocket assay zoals ontwikkeld in muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Cornea micropocket Analyse: Een model van angiogenese in de muis Eye
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De muis cornea micropocket assay is een robuuste en kwantitatieve in vivo analyse voor het evalueren van angiogenese. Via gestandaardiseerde langzame afgifte pellets met specifieke groeifactoren die de groei van bloedvaten leiden gehele natuurlijke avasculaire hoornvlies, kan angiogenese worden gemeten en gekwantificeerd. In deze assay de angiogene respons wordt gegenereerd in de loop van enkele dagen, afhankelijk van het type en de dosering van groeifactor gebruikt. De inductie van neovascularisatie wordt gewoonlijk geactiveerd door hetzij basische fibroblastgroeifactor (bFGF) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF). Door deze groeifactoren met sucralfaat en Hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroxyethylmethacrylaat))) en gieten van het mengsel tot pellets, kunnen ze chirurgisch worden geïmplanteerd in het oog muis. Deze uniforme pellets langzaam laat de groeifactoren over vijf of zes dagen (bFGF of VEGF respectievelijk) waardoor voldoende angiogene respons nodig voor vaartuig gebied quantification met een spleetlamp. Deze test kan worden gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder de evaluatie van angiogene modulator geneesmiddelen of behandelingen en vergelijking tussen verschillende genetische achtergronden invloed angiogenese. Een ervaren onderzoeker na het uitvoeren van deze test kan een pellet implanteren in minder dan 5 minuten per oog.
Inleiding
Het proces van angiogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten te vormen reeds bestaande degenen, is zeer complex en wordt gereguleerd door een aantal endogene factoren die de verschillende stappen van het vaartuig kiemen en morfogenese controleren. Angiogenese wordt veroorzaakt door een verschuiving in balans tussen pro-en anti-angiogene factoren, het evenwicht dat gewoonlijk handhaaft de vasculatuur in een rusttoestand. Angiogenese bij volwassenen voorkomt in bepaalde fysiologische omstandigheden, zoals tijdens de vrouwelijke eierstokcyclus of herstel processen zoals wondheling en weefselregeneratie. Maar het is ook een kenmerk van verscheidene ziekten, waaronder tumoren, auto-immuunziekten en ontstekingsziekten. De betrokkenheid van angiogenese in deze fysiologische en pathologische omstandigheden maakt het een belangrijk onderwerp voor onderzoek en een aantrekkelijk doelwit voor therapie.
Vanwege de complexiteit van de angiogenese en de betrokkenheid van verschillende cells en factoren in het proces, zoals endotheelcellen, pericyten, circulerende cellen en stromale cellen in vitro modellen beperkt blijven en kunnen de unieke in vivo micro-omgeving niet herhalen. De belangrijkste in vitro assays van angiogenese zijn grotendeels gericht op het observeren directe effecten op endotheliale cellen en het meten van bepaalde stappen in angiogene proces onder gecontroleerde omstandigheden. Deze testen omvatten het kwantificeren van endotheliale celproliferatie 1, migratie 2, netwerkvorming 3, buisvorming 4 en ontspruit uit bolvormige deeltjes 5. Ex vivo modellen, anders dan in vitro die zijn complexer en bevatten meerdere weefsels celtypes, waarvan een voorbeeld de aorta-ring assay 6. Niettemin, zoals andere systemen, kan het niet de inbreng van circulerende cellen en natuurlijke stroma van endotheelcellen vangen zoals bekend in vivo. Pogingenom angiogenese te studeren onder stroom naar de in vivo omgeving worden uitgevoerd met behulp van microfluïdische systemen 7, echter zelfs deze testen bootsen, hoewel veel verbeterd, zijn nog steeds niet in staat om rekening te houden met alle compartimenten bestaande in vivo.
Door de beperkingen van de in vitro en ex vivo angiogenese modellen in vivo modellen blijven betrouwbaarder keuzes voor angiogenese studies. Voorbeelden van deze modellen zijn voorzien van de implantatie van transparante kamers, "ramen", dat de visualisatie van de groeiende bloedvaten onder de microscoop 8 toestaan, injecteerbare subcutane implantaten zoals matrigel en schip vorming in normale weefsels zoals muis oor en de kip chorioallantoïsmembraan (CAM ). Een van de meest aannemelijk en kwantitatieve in vivo angiogenese modellen de corneale neovascularisatie micropocket assay beschreven, waarbij de natuurlijk avasculaire exploiteerthoornvlies als een "scherm" te visualiseren en evalueren nieuwe angiogene 9 groei.
Hier beschrijven we de corneale micropocket assay zoals ontwikkeld in muizen. Aanvankelijk werd het model gebruikt om de niet-specifieke angiogene stimuli bij konijnen hoornvliezen meten. Dit werd gedaan door de invoering van de tumor stukken in de waterige humor van de voorste kamer van het oog van een konijn en gemeten tumor-geïnduceerde neovascularisatie 11.
Echter, werd de test later evolueerde naar effecten van specifieke groei bestuderen factoren 10 om beter te specificeren en standaardiseren van de angiogene effect. Om de groeifactor release in het oog werden langzame afgifte pellets bevattende bekende hoeveelheden van angiogene groeifactoren in plaats van weefsels. De beschikbaarheid van gezuiverde recombinante angiogene eiwitten zoals bFGF of VEGF in staat hun gebruik als specifieke doelstellingen van angiogenese modulaters 12. Aanvankelijk was de assayvoornamelijk gebruikt in konijnen, die makkelijker te verwerken vanwege hun grootte, maar later werd het model vertaald in muizen; een kleinere en minder dure diermodel. Verschuift van konijn tot muizen die een belangrijk voordeel van de mogelijkheid om genetisch gemanipuleerde dieren te gebruiken, waardoor een nieuw gebied van onderzoek naar de genetische componenten van invloed zijn angiogenese 13. Naast de meer aanvaardbaar gebruik van corneabepaling bestuderen angiogenese, kunnen andere biologische processen ook onderzocht middels gemodificeerde assays. Zo werden studies lymfangiogenese mogelijk gemaakt door de inplanting van een lage dosis bFGF pellets die de visualisatie van lymfevaten door specifieke moleculaire merkers 14 toegestaan. Daarnaast heeft deze assay een middel om de effecten van straling evalueren angiogenese 15 ontvangen.
In sommatie, het hoornvlies micropocket angiogenese assay is een kwantitatieve, reproducible, flexibele evaluatie van de angiogenese in vivo. Een groot voordeel van deze test is dat de meting van achtergrond vaartuigen is nodig omdat de vaten groeien op een natuurlijk avasculaire weefsel. We beschrijven hier het protocol van deze test in de details en bespreken verschillende scenario's die kunnen optreden. De test bestaat uit 3 afzonderlijke segmenten. Hier zullen we de voorbereiding van de groeifactor-inclusive pellets, de daaropvolgende chirurgische implantatie en tenslotte de methode die wordt gebruikt om de resulterende neovasculaire groei kwantificeren beschrijven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle protocollen met dieren wordt door de Institutional Animal Care en gebruik Comite voorgelegd aan en goedgekeurd in het Children's Hospital Boston en worden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care (AAALAC). Zorg ervoor dat steriele instrumenten en aseptische techniqure gebruiken tijdens het uitvoeren van de procedure.
1 Bereiding van pellets
- Weeg 10 mg sucralfaat en 60 mg van Hydron met de steriele unbent spatel. Plaatsen in aparte microcentrifugebuizen.
- Plaats een 1 cm vierkant stuk gaas in een steriele 10 cm schotel. Omkeren dus mesh rust op ondiepe deksel. Opzij te zetten.
- Voeg 500 ul van ethanol aan de Hydron en vortex gedurende ten minste 10 minuten.
- Voeg de juiste hoeveelheid groeifactor (standaard: 20 ug voor bFGF, 50 ug voor VEGF) bij de sucralfaat en vortex kort. Groei winkel factor in een-80 ° C vriezer bij een concentratie van 1 mg / ml. Vloeibare toegevoegde volumes moeten minimaal 20 pi de sucralfaat volledig bevochtigd waarborgen maar mag niet meer dan 50 pl. Groter volume maakt het verdampen van de vloeistof in de volgende stap moeilijk.
- Plaats het mengsel in de sucralfaat centrifugale verdamper laag aangezet tot het mengsel droog, normaal 30-50 min, afhankelijk van de hoeveelheid gebruikte vloeistof.
- Controleer het mengsel gedurende restvocht met het tapse uiteinde van een steriele spatel. Het mengsel moet "crunchy" te voelen.
- Gebruik het taps toelopende einde van de spatel te breken van de sucralfaat mengsel in de buis.
- Voeg 10 ul van de Hydron de sucralfaat.
- Vanwege de viskeuze aard van Hydron, snijd het einde van een 200 ul pipet tip en teken en laat het 10 pl voor pipetteren opnieuw en toe te voegen aan sucralfaat.
- Gebruik snel gebogen spuwdeula aan de Hydron en sucralfaat mixen en te verwijderen uit de tube.
- Verzamel het mengsel langs de onderkant van de punt van de gebogen spatel en draai de buis tijdens het tekenen van de spatel langs de wand van de buis. Het mengsel zal snel droogt zodat deze stap efficiënt moet gebeuren.
- Verspreid het mengsel op de voorbereide mesh behulp van een tang om het op zijn plaats houden. Het mengsel moet een gelijkmatige laag en vul in de gaten van het gaas.
- Dompel de gebogen spatel in de buis bevattende Hydron en gebruiken vacht beide zijden van de maas.
- Plaats de gecoate mesh neiging zijde tegen de rand van de schaal en laat drogen bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten.
- Leg het gaas in -20 ° C vriezer of ga onmiddellijk naar de volgende stap. Houd mesh binnenkant schotel.
- Plaats de 35 mm schotel in de grotere petrischaal, deksel. Gebruik de pincet voorzichtig trekken de vezels van het gaas elkaar via 35 mm schaal. Stray pellets ceen worden afgehaald bij de grotere schotel aan het einde.
- Controleer pellets voor uniformiteit onder de scope. Het proces levert ongeveer 250 pellets dus de standaard dosis per pellet voor bFGF en VEGF is 80 ng en 200 ng, respectievelijk.
- WINKEL pellets in 35 mm schaal in -20 ° C vriezer voor maximaal 3 maanden.
2 Chirurgische Implantatie van Pellets
- Het opzetten van een chirurgische gebied onder operationele microscoop.
- Verdoven van de muis met avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneaal) en de positie van de muis onder de microscoop, zodat de ogen zichtbaar is. Voeren teen knijpen om voldoende niveau van anesthesie te garanderen.
- Verdoven van de muis ogen door het plaatsen van 1 druppel proparacaïne oplossing bovenop oogbol. Wacht 20-30 seconden en dep met een gaasje.
- Proptose de muis oog met de afgestompt # 1 juweliers tang met de zekerheid om de huid tussen de tang en ogen vertrekken. Het is belangrijk dat de toegepaste druk kunnen beoordelen.60; Houd het oog te hard wordt, zal deze rood en geïrriteerd, terwijl ook los een greep zal toestaan oog te bewegen tijdens de operatie.
- Gebruik de 30 ° microknife een incisie in de cornea ongeveer 1 mm van de limbus. De incisie moet 1-2 mm lang zijn. Incisie moeten diep genoeg doordringen dan de epitheliale laag in midstroma maar niet zo diep het oog scheuren zijn.
- Gebruik von Graef mes om een zak te maken loodrecht op de incisie.
- Schuif het mes onder de hoornlaag op de incisie en werk voorzichtig mes in en verplaats het langs de incisie voor een vergroting van de ruimte, waardoor de vorming van de zak. Het helpt de muis ook kunnen werken met de kromming van het oog. Wees voorzichtig niet om naar beneden te duwen met de tip om te voorkomen dat scheuren in het oog.
- Bevochtig een tang de # 5 juwelier met proparacaïne en kies een pellet op uit schotel. Plaats een pellet op het oog.
- Bevochtig de von Graef mes met proparacaïne en breng een aantal van vloeistof op pellet om het rubberachtige en buigzaam te maken. Verwijder overtollig vocht met een gaasje of wattenstaafje.
- Plaats de pellet in de zak met de von Graef mes om het binnen duwen onder de cornea laag. Zodra de gehele pellet binnen is, lopen de platte kant van von Graef mes over de site om te controleren of de pellet is veilig.
- Coat het oog met triple antibiotische zalf.
- Zet de muis op en herhaal de operatie in de tegenovergestelde oog.
3 Kwantificering van neovascularisatie van de cornea.
Laat dieren schepen gedurende een bepaalde periode van tijd te ontwikkelen. De dag van het vaartuig inschaling is afhankelijk van groeifactor gebruikt. Grade bFGF op dag 5 en zwakkere VEGF op dag 6 De dag van implantatie dag 0.
- Verdoven de muis met Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneaal).
- Gebruik de spleetlamp microscoop voor grading. Een oculair heeft een tasje, lijnen binnen het oculair gebruikt als meetinstrument hulp aan scheepslengte en de afstand rond de omtrek van het oog, dat de schepen zijn ontsproten kwantificeren.
- Houd de muis in de voorkant van de scope, het positioneren van de muis dus oog wordt direct voor gezien bij oculaire met pellet. Het stabiliseren van de kop tussen duim en wijsvinger, zodat de huid wordt vastgezet op het gezicht en de ogen wordt iets proptosed.
- Plaats de y-as van de reticule langs de limbale verblijf direct onder pellet. Meet de lengte van de vaartuigen vertakkingen omhoog naar pellets. Noteer deze meting in tienden van millimeters en aanwijzen scheepslengte (VL) (Figuur 1A).
- Zet de muis of het tasje zodat de afstand rond het oog dat deze schepen zijn ontsproten duidelijk. Het is het makkelijkst om te denken van het oog als een wijzerplaat met een interval van 1 tot en met 12 Designate dit aantal klokuur (CH) (Figuur 1B). Het kan een geheel getal of een fractie van 0,25 (bijvoorbeeld 2, 2.25, 2.5 of 2.75) zijn. Opmerking: CH is subjectief. Bijvoorbeeld kan de enige afstand rond het oog te meten om alle vaartuigen ontsproten de limbus terwijl andere Stoppen van op het punt waar scheepslengte is halfmaximale omvatten. De belangrijke factor is in overeenstemming met hoe men kiest kwaliteit overeenkomen.
Figuur 1 Kwantificering van corneale neovascularisatie. (A) 80 ng bFGF pellet geïmplanteerd in C57BL / 6J muis geeft spleetlamp reticule georiënteerd scheepslengte meten. VL = 0.9 mm. (B) Zelfde oog tonen spleetlamp tasje gedraaid om klokuur meten. CH = 3.25. Berekend vaartuig gebied = 1,84 mm2. Deze beelden digitaal verbeterd te zijn om voor de toevoeging van tasje schema. Klik hier voor grotere afbeelding.
- Bereken het schip gebied (VA) met behulp van de onderstaande formule, die gebaseerd is op het gebied van een ovaal (Note, is het nuttig om dit in gedachten te houden bij de indeling.) In millimeter kwadraat Express VA. De formule is als volgt:
Scheepslengte x Klok uur x 0,2 π = Vessel gebied
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Typische resultaten voor bFGF en VEGF pellets in de normale lage angiogene C57BL / 6J-muizen zijn getoond in figuur 2A en B, respectievelijk. Figuur 2E toont de normale distributie van verblijf stippellijn (VA) in de C57BL / 6J stam met variërende doses van deze groei factoren. 80 ng bFGF pellets doorgaans tot een VA van ongeveer 2,0 mm 2, hoewel waarden in een bereik van 1,8-2,4 mm 2 zijn aanvaardbaar. 200 ng VEGF pellets veroorzaken doorgaans een...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende kritische stappen in het succesvol corneale assay. De eerste maakt uniforme pellets kunnen worden geïmplanteerd en stimulerende vaartuigen. De belangrijkste onderdelen van pellet preparaat zijn 1) met dragervrij groeifactor; 2) te zorgen voor een goede mix van groeifactor met de sucralfaat en Hydron en 3) het verplaatsen van het uiteindelijke mengsel snel maar zorgvuldig uit de eppendorfbuis aan het gaas waar de pellets worden gegoten. Aanbevolen wordt "dummy" pellets worden zonder groeif...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Kristin Johnson voor het grafische werk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sectie 1: Pellet voorbereiding | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (ook bekend als Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Groeifactoren: | Moet dragervrij zijn (geen bovien serumalbumine(BSA)) | ||
| Fibroblast groeifactor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vasculair endotheel groeifactor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm schaal | Becton-Dickson | #353001 | Wordt gebruikt voor het opslaan van pellets |
| 10 cm petrischaal | VWR | #25384-342 | Wordt gebruikt als werkoppervlak voor het bereiden van pellets |
| Gaas | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, gesneden in cm vierkante stukken en gesteriliseerd in autoclaaf |
| Spatels | Fisher Scientific | #21-401-10 | Gebruik de taps toelopende kant van de ene om de pelletmixtuur te breken. Buig de taps toelopende kant van de andere om de mixtuur uit de microcentrifugebuis te helpen verwijderen. |
| Microcentrifugebuisjes | Fisher Scientific | #05-408-146 | Een voor hydron, een voor sucralfate |
| Juwelierstangen, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Twee nodig om het gaas uit elkaar te trekken |
| Centrifuge evaprator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Sectie 2: Chirurgische implantatie van pellets | |||
| Operatiemicroscoop | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | Algemeen verdovingsmiddel | ||
| Proparacaine hydrochloride oogdruppels 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Oogverdoving |
| Drievoudig antibioticum oogzalf | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Bevat neomycine, polymixin en bacitracin |
| Oogmicromes, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 graden hoek |
| Von Graef mes | Ambler Surgical | #3401E | |
| Juwelierstangen, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Moet stomp gemaakt worden met slijpsteen voor protose oog |
| Juwelierstangen, #5 | Ambler Surgical | #2305E | Voor het oppikken van pellets en plaatsen op het oog |
| Kleine gebogen schaar | Ambler Surgical | #5636E | Voor het trimmen van snorharen |
| Gaas | Voor het uitblussen van het oog na proparacaine | ||
| Sectie 3: Beoordeling van corneale neovascularisatie | |||
| 2.5% Avertin | Algemeen verdovingsmiddel | ||
| Spleetlamp | Nikon | FS-2 | Heeft een oculaire nodig met een stippenlijn om te helpen met meten |
Referenties
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
