Hornhinnen Micropocket analysen: En modell av Angiogenese i Mouse Eye
Summary
Protokollen beskriver det corneale micropocket assay som utvikles hos mus.
Abstract
Musen korneal micropocket assay er et robust og kvantitativt in vivo-forsøk for vurdering av angiogenese. Ved å bruke standardiserte slow-release pellets inneholdende spesifikke vekstfaktorer som utløser blodkarvekst gjennom hele den naturlig avaskulær hornhinnen, kan angiogenese kan måles og kvantifiseres. I dette assay den angiogene responsen blir generert i løpet av flere dager, avhengig av type og dosen av vekstfaktor som brukes. Induksjonen av neovaskularisering er vanligvis utløst av enten basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) eller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Ved å kombinere disse vekstfaktorer med sukralfat og Hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroksyetylmetakrylat))), og støping av blandingen til pellets, kan de bli kirurgisk implantert i mus øyet. Disse ensartede pellets sakte-frigjøre vekstfaktorer over fem eller seks dager (bFGF eller VEGF henholdsvis) som muliggjør tilstrekkelig angiogent respons krevde for fartøy område quantification bruker en spaltelampe. Denne analysen kan brukes til forskjellige anvendelser, inkludert evalueringen av angiogene modulator legemidler eller behandlinger, så vel som sammenligning av forskjellige genetiske bakgrunner som påvirker angiogenese. En dyktig etterforsker etter å ha praktisert denne analysen kan implantere en pellet på mindre enn 5 min per øye.
Introduction
Prosessen med angiogenese, dannelsen av nye blodkar dannes forhåndseksisterende de, er meget komplisert og er regulert av flere endogene faktorer som styrer forskjellige trinn av fartøyet spiring og morfogenese. Angiogenese er utløst som følge av en forskyvning i balanse mellom profiler og anti-angiogene faktorer, en balanse som normalt opprettholder blodkar i en hviletilstand. Angiogenese hos voksne forekommer i visse fysiologiske betingelser slik som under den kvinnelige eggløsningssyklus eller i reparasjonsprosesser som sårheling og regenerering av vev. Imidlertid er det også et kjennetegn av flere patologier inkludert maligne tilstander, autoimmune og inflammatoriske sykdommer. Involvering av angiogenese i disse fysiologiske og patologiske tilstander som gjør det til et viktig tema for forskning og et attraktivt mål for terapi.
På grunn av kompleksiteten i angiogenese og involvering av flere ceLLS og faktorer i prosessen, inkludert endotelceller, pericytes, utegående celler og stromale celler, in vitro-modeller er begrenset og kan ikke rekapitulere den unike in vivo mikromiljøet. Hoved in vitro analyser av angiogenese er i stor grad fokusert på å observere direkte effekter på endotelceller og måle visse trinn i angiogeneprosessen under kontrollerte forhold. Disse assayer omfatter kvantifisering av endotelial celleproliferasjon 1, migrering 2, nettverksdannelse 3, røret dannelsen 4 og spirende fra sfæroider 5. Ex vivo-modeller, i motsetning til in vitro-de, er mer komplisert og innlemme flere vev celletyper, et eksempel er aorta ring analysen seks. Ikke desto mindre, i likhet med andre systemer, kan det ikke ta bidraget av sirkulerende celler og naturlige stroma av endotelceller som eksisterer in vivo. Forsøkå studere angiogenese henhold flyt å etterligne in vivo innstillingen utføres med microfluidic systemer 7, men selv disse analysene, selv om mye bedre, er fortsatt ikke i stand til å gjøre rede for alle avdelinger eksisterende in vivo.
På grunn av begrensninger i in vitro og ex vivo angiogenese modeller, in vivo-modeller forbli de mer pålitelig valg for angiogenese studier. Eksempler på disse modellene inkluderer implantasjon av gjennomsiktige kamre, "Windows", som tillater visualisering av voksende blod fartøy under mikroskop 8, injiserbare subkutane implantater som matrigel og fartøy dannelse i normalt vev som mus øret og kylling chorioallantoic membran (CAM ). Imidlertid er en av de mest akseptable og kvantitative in vivo angiogenese-modeller er det corneale micropocket neovaskularisering analysen beskrevet her, som utnytter naturlig avaskulærhornhinnen som en "skjerm" for å visualisere og vurdere nye angiogent vekst ni.
Her beskriver vi det corneale micropocket assay som utvikles hos mus. Utgangspunktet modellen ble brukt for å måle ikke-spesifikke angiogene stimuli i kanin hornhinner. Dette ble gjort ved å innføre tumorstykker inn i den vandige humor fra det fremre kammer i kaninøyne målt og tumor-indusert neovaskularisering 11.
Imidlertid analysen ble senere utviklet for å studere virkningene av spesifikke vekstfaktorer 10 for bedre å spesifisere og standardisere den angiogene effekten. For å frigjøre vekstfaktor i øyet, ble det langsomt frigjørende pellets inneholdende kjente mengder av angiogene vekstfaktorer brukes i stedet for vev. Tilgjengeligheten av renset rekombinante angiogenetiske proteiner som bFGF eller VEGF aktivert deres bruk som konkrete mål av angiogenese modulaters 12. Til å begynne med analysen vari stor grad brukes i kaniner, som er lettere å jobbe med på grunn av sin størrelse, men senere modellen ble oversatt til mus; en mindre og rimeligere dyremodell. Skifter fra kanin til mus gitt en viktig fordel av å være i stand til å bruke genetisk manipulerte dyr, og dermed skape et nytt område av forskning på genetiske komponenter som påvirker angiogenese 13. I tillegg til den mer akseptabel bruk av cornea analysen i å studere angiogenese, kan andre biologiske prosesser også undersøkt ved bruk av modifiserte assays. For eksempel ble studier av lymphangiogenesis gjort mulig gjennom implantasjon av lavdose bFGF pellets som tillot visualisering av lymfekar gjennom konkrete molekylære markører 14. I tillegg har denne analysen ga et middel for å evaluere effekten av stråling på 15 angiogenese.
I summering, er hornhinnen micropocket angiogenese analysen en kvantitativ, reproducible, fleksibel vurdering av angiogenese in vivo. En stor fordel med denne analysen er at målingen av bakgrunns fartøy er unødvendig fordi fartøyene vokse på en naturlig avaskulære vev. Vi beskriver her protokollen fra denne analysen i detaljer og diskutere ulike scenarier som kan oppstå. Analysen består av tre adskilte partier. Her vil vi beskrive fremstillingen av vekstfaktor inkludert pellets, den etterfølgende kirurgisk implantering og til slutt den metode som brukes til å kvantifisere resulterende neovaskulær vekst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere kritiske trinn med å utføre en vellykket korneal analyse. Den første er å gjøre ensartede pellets istand til å bli implantert og stimulerende fartøy. De viktigste deler av pellet preparatet er 1) ved hjelp av transportør-fritt vekstfaktor; 2) å sikre en god blanding av vekstfaktor med sukralfat og Hydron og 3) å bevege den avsluttende blanding raskt, men forsiktig fra Eppendorf-rør til nettingen, hvor pelletene er støpt. Det anbefales at "dummy" pellets gjøres uten vekstfaktor for å …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Kristin Johnson for det grafiske arbeidet.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D’Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D’Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D’Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D’Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
