Summary
نحن تصف كيفية تنفيذ photoactivated توطين المجهري (النخيل) القائم على الدراسات من الحويصلات في الخلايا العصبية مثقف الثابتة. المكونات الرئيسية لبروتوكول لدينا تشمل وضع العلامات الحويصلات مع الوهم photoconvertible، وجمع الصور الخام عينات قليلة مع نظام المجهر فائقة القرار، ومعالجة الصور الخام لإنتاج فائقة دقة وضوح الصورة.
Abstract
الكشف عن مضان يوفر الأساس لكثير من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع المجهري وتتقدم بسرعة المستخدمة في التطبيقات البيولوجية والطبية الحديثة. وتشمل نقاط القوة في مضان حساسيتها، والنوعية، والتوافق مع التصوير الحي. للأسف، الأشكال التقليدية للمضان المجهري يعانون من الضعف، محدودة حيود قرار رئيسي واحد في الطائرة والتصوير، مما يعوق الدراسات الهياكل ذات أبعاد أصغر من ~ 250 نانومتر. مؤخرا، تم التغلب على هذا القيد مع إدخال تقنيات مضان المجهري فائقة القرار، مثل المجهر photoactivated التعريب (النخيل). على عكس نظيراتها التقليدية، ويمكن PALM تنتج صورا مع قرار الوحشي للعشرات من نانومتر. بالتالي فمن الممكن الآن لاستخدام مضان، مع قوتها لا تعد ولا تحصى، لتوضيح مجموعة من الصفات التي يتعذر الوصول إليها سابقا من الهيكل الخلوي والتنظيم.
_content "> وللأسف، PALM ليست تافهة لتنفيذ، والاستراتيجيات الناجحة في كثير من الأحيان يجب أن يكون متلائما مع نوع النظام تحت الدراسة. في هذه المقالة، وتبين لنا كيفية تنفيذ الدراسات PALM أحادية اللون البنى حويصلي في الخلايا العصبية مثقف ثابت. يعتبر مثاليا النخيل لدراسة الحويصلات، والتي لها أبعاد التي تتراوح عادة من 50-250 نانومتر ~. الخطوات الرئيسية في نهجنا وصفها تشمل الخلايا العصبية مع photoconvertible (الأخضر إلى الأحمر) الوهم من البضائع حويصلة، وجمع الصور الخام عينات قليلة مع نظام المجهري فائقة القرار، ومعالجة الصور الخام لإنتاج صورة عالية الدقة النخيل، ونحن أيضا تدليل على فعالية نهجنا من خلال تقديم صور استثنائية تحل بشكل جيد من الحويصلات كثيفة الأساسية (DCVs) في الخلايا العصبية الحصين مثقف، الذي دحض الفرضية القائلة بأن الاتجار extrasynaptic من DCVs يتم بوساطة حد كبير من قبل مجموعات DCV.Introduction
وهناك عدد من العمليات الخلوية تعتمد على دقة وكفاءة الاتجار حويصلة بوساطة الجزيئات الحيوية إلى وجهات التحت خلوية معينة. أحد الأمثلة البارزة هو التجمع متشابك، والذي يسبقه تراوحت فترة طويلة، بوساطة حويصلة متشابك تسليم المكونة من مواقع نشوء حيوي في سوما العصبية إلى مواقع ما قبل وبعد المشبكي يحتمل القاصي 1.
مضان المجهري هو وسيلة قوية وشعبية لدراسة الاتجار حويصلة. وتشمل نقاط القوة في أسلوب حساسيتها، والنوعية، والتوافق مع التصوير الحي 2. للأسف، حتى وقت قريب نسبيا، فقد عانت هذه التقنية من ضعف رئيسي واحد، القرار محدودة حيود 2، مما يعوق الدراسات الهياكل ذات أبعاد أصغر من ~ 250 نانومتر. مؤخرا، القرار الوحشي في مضان المجهري تجاوزت حاجز الحيود مع الأخذ ميل مضان فائقة القرارتقنيات croscopy، مثل النخيل 3. القرار الوحشي من النخيل، وعشرات من نانومتر، يعتبر مثاليا لدراسة الحويصلات، والتي لها أبعاد التي تتراوح عادة من 50-250 نانومتر ~ 4. بالتالي فمن الممكن الآن لاستخدام مضان، مع قوتها لا تعد ولا تحصى، لتوضيح مجموعة من الصفات التي يتعذر الوصول إليها سابقا من الحويصلات، بما في ذلك بعض جوانب الاتجار بهم إلى مواقع التحت خلوية معينة.
النخيل ليست تافهة لتنفيذ، والاستراتيجيات الناجحة في كثير من الأحيان يجب أن يكون متلائما مع نوع النظام تحت الدراسة. نحن هنا تصف كيفية تنفيذ الدراسات PALM هياكل الحويصلي، وعلينا أن نبرهن على فعالية نهجنا لحالة DCVs في الخلايا العصبية قرن آمون. على وجه الخصوص، ونحن نستخدم النخيل لمعالجة الفرضية القائلة بأن الاتجار DCVs لنقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية قرن آمون بوساطة مجموعات DCV 5-8.
الاتجار بوساطة مجموعة من الحويصلات إلى نقاط الاشتباك العصبي في تطوير نeurons هو إمكانية مثيرة للاهتمام لأنها قد تسهل تحقيق الاستقرار متشابك السريع والتجمع 9،10. أنصار الاتجار عنقودية من DCVs الاستشهاد حجم واضحا كبير من نقاط والفلورسنت extrasynaptic إيواء البضائع DCV الخارجية كدليل دعم المجموعات 6. ومع ذلك، تظهر هذه الصور في نقاط والتي تم إنشاؤها باستخدام تقنيات المجهر مضان محدودة الحيود، والتي لا تتناسب مع حجم الآثار الناجمة عن حيود المميزة من تلك التي تنشأ من المجموعات.
لحل هذه المشكلة، جمعنا مضان widefield التقليدية والصور النخيل من الخلايا العصبية الحصين معربا عن الوهم تستهدف DCVs. وكشف تحليل هذه الصور التي> 92٪ من التجمعات المفترضة DCV extrasynaptic في الصور التقليدية يتم حلها إلى 80 نانومتر (الفردية DCV الحجم) 11 نقاط والنخيل في الصور. وبالتالي، فإن هذه البيانات يبطل إلى حد كبير فرضية التكتل كما ينطبق على DCVs في تطوير hippocaالخلايا العصبية mpal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد نموذج
- إعداد الحمض النووي ترميز الوهم photoconvertible أو photoactivatable تستهدف DCVs، وذلك باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
ملاحظة: أحد الاحتمالات هو ترميز الحمض النووي للمنشط البلازمينوجين النسيجي-Dendra2 الوهم (TPA-Dendra2). Dendra2 هو بروتين photoconvertible أن تتحول من الأخضر إلى الأحمر الانبعاثات عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية ضوء 12. - الخلايا العصبية قرن آمون الثقافة على الأداء العالي # 1.5 غطاء ينزلق ل~ 5-10 أيام، في أعقاب البروتوكولات القياسية 13.
- بالنقل تطوير الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام الدهون الموجبة كاشف.
ملاحظة: العدوى الفيروسية بوساطة هو أكثر فعالية لالخلايا العصبية الناضجة. وقد وصفت هذا النهج البديلة بالتفصيل في مكان آخر 14.- إعداد أنبوب 1.5 مل تحتوي على ~ 1 ميكروغرام من الحمض النووي و 250 ميكرولتر من الحد الأدنى من المتوسط الأساسية (MEM) والثانية أنبوب 1.5 مل تحتوي على 4 ميكرولتر من كاشف الموجبة الدهون و 250 ميكرولترمن MEM.
- احتضان الحلول لمدة 5 دقائق.
- الجمع بين الحلين واحتضان الخليط الناتج لمدة 30 دقيقة إضافية.
- أثناء الحضانة، وإعداد طبق يحتوي على العديد من مل من مستنبت تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
- نقل بلطف زلات غطاء تحتوي على الخلايا العصبية إلى صحن يحتوي المتوسطة الدافئة وإضافة خليط ترنسفكأيشن.
- إمالة طبق بلطف ثم وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- العودة إلى الخلايا العصبية على "طبق الوطن" وانتظر ~ 12-18 ساعة.
- إصلاح الخلايا لمدة 45 دقيقة في بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في التجارب النخيل، فمن المهم لتحقيق الحفاظ جيدة من التركيب الدقيق، والمعيار بروتوكولات الفورمالديهايد التثبيت تستخدم لتلوين المناعي عادة ما تكون غير كافية 15. أحد الأسباب المهمة لفقراء المحافظة الهيكلية غير كافية والوقت ixation لأن الفورمالديهايد التثبيت يشمل تشكيل معقد إضافي والبروتين يشابك، والعملية الأخيرة هي بطيئة جدا 16. A 45 دقيقة التثبيت يساعد على تخفيف هذه المشكلة مع عدم فقدان الناجم عن overfixation كشف من مضان. - غطاء غسل زلات ~ 10X مع برنامج تلفزيوني تصفيتها.
ملاحظة: هذا يقلل الملوثات الفلورسنت. عينات صورة بسرعة نسبيا بعد التثبيت. في، خلايا تخزين المؤقت في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني تصفيتها في وعاء محكم الضوء. - جبل زلات غطاء تحتوي على الخلايا العصبية في غرفة في برنامج تلفزيوني تصفيتها.
ملاحظة: يجب أن يتم تنظيمها العينة في وسط مائي، مثل برنامج تلفزيوني، مع معامل الانكسار أقل من الزجاج، لتنفيذ مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) القائمة على الإضاءة. إضاءة على أساس TIRF مفيد جدا لتغطية زلة القريبة fluorophores فقط متحمسون، وهناك انخفاض كبير في الخلفية المرتبطة مضان 17.
2. الحصول على صورة </ ع>
- بدوره على نظام التصوير فائقة الدقة.
- تشغيل مصباح القوس.
- الوجه "نظام / جهاز كمبيوتر" ومفاتيح "المكون" (على السلطة والتحول البعيد) إلى "على".
- بدوره على جهاز الكمبيوتر (بعد السيطرة المجهر محطة قرص / لرسو السفن يأتي على).
ملاحظة: محطة لرسو السفن يمكن استخدامها لمراقبة ورصد العديد من سمات البصريات ومسار الضوء، ولا سيما اختيار الهدف والتركيز. - انقر نقرا مزدوجا على أيقونة البرنامج واختيار "نظام تشغيل" الخيار في مربع الحوار تسجيل الدخول.
- فحص العينة.
- فتح الأمامية والألواح المتحركة أعلى على خزانة السلامة الليزر.
- إمالة الذراع الضوء المرسل للوصول إلى مرحلة والأهداف.
- نضع الزيت على خطة ألفا-100X امزيغ الفتحة العددية / NA = 1.46 (TIRF) الهدف.
ملاحظة: ثمة هدف عالية NA-63X يمكن استخدامها بدلا من 100X. - جبل العينة على المسرح، ورفع الالهدف ه نحو العينة.
- رصد موقف العدسة باستخدام وظيفة XYZ من محطة الإرساء. وقف عند العدسة هو في الملعب من التركيز (على سبيل المثال، ض ~ 2.50 ملم).
- إغلاق التام لوحات وصول.
ملاحظة: لإشراك سلامة الليزر. - غرامة ضبط التركيز باستخدام خلال oculars والأزرار في التبويب موقع.
ملاحظة: توفر علامة تبويب تحديد الوصول إلى الأزرار التي تنتج قوس إضاءة مصباح مقرها ويسهل الملاحظة المباشرة من العينة مع خلال oculars. وبالمثل، فإن علامة التبويب اقتناء يوفر الوصول إلى الأدوات التي تنتج الإضاءة المعتمدة على الليزر ويسهل التقاط الصور بواسطة الكاميرا.- انتقل إلى علامة التبويب تحديد موقع، واختيار "ترانس في."
- انقر فوق رمز توسع العين.
ملاحظة: هذا إحضار التخطيطي لمسار الضوء. سمات مسار الضوء يمكن تغييرها بالضغط اليسرى الرموز المناسبة في التخطيطي أو باستخدام شاشة اللمس في محطة الإرساء. على سبيل المثال، وهو مرشحمناسبة للعرض من الانبعاثات Dendra2 يمكن اختيار باستخدام رمز عاكس مسدس. - النظر في العدسات، وجعل الخلايا في التركيز باستخدام محطة الإرساء كدليل.
ملاحظة: سوف تكون العينة قليلة جدا بالسكان مع خلايا الفلورسنت لأن الخلايا العصبية قرن آمون يصعب بالنقل، وبالتالي يمكن أن تكون صعبة قليلا للتركيز باستخدام الإضاءة المنعكسة. إذا كان هذا هو الحال، استخدام الإضاءة المنقولة والقراءة ض من محطة الإرساء كدليل. - تبديل ضوء "إيقاف" بعد التركيز.
- تحديد الخلية التي هو مشرق إلى حد ما، يسلك منقط مضان، ولها مورفولوجيا الكلاسيكية التي تدل على صحة جيدة.
- اختيار الضوء المنعكس والمناسبة مرشح للعرض الانبعاثات الأخضر من Dendra2.
- مسح الغطاء زلة لالخلايا معربا عن الوهم Dendra2 باستخدام ضوء انخفاض شدة الإثارة.
- التبديل إلى ACQالتبويب uisition.
- استخدام "مدير التجربة" لتحميل اكتساب التكوين النخيل التي تم تصميمها بشكل مناسب أو تعديلها بسهولة.
ملاحظة: في حالة وجود أي من هذه التجربة، تصميم التكوين التجريبية بدءا باستخدام الإعدادات التالية كدليل: المتزلجون الليزر الطاقة: 405 نانومتر (~ 0.01٪ لميغاواط الليزر 50)؛ 488 نانومتر (~ 3٪ ل100 ميغاواط الليزر)؛ 561 نانومتر (~ 40٪ عن 100 ميغاواط الليزر)؛ وقت التعرض: ~ 50 ميللي ثانية؛ مكاسب الكاميرا: ~ 200؛ اقتناء متعددة الأبعاد: سلسلة زمنية (دورات = 30،000، فاصل = 0)؛ المسارات: 488 نانومتر مع برنامج التحصين الموسع في الإضاءة، و 561 نانومتر مع إضاءة مقرها TIRF (راجع الخطوة 2.5.1)؛ الهدف: 100X (NA = 1.46)؛ زاوية TIRF المنزلق: الإصابة زاوية 67-72 ° ~؛ حجم بكسل: 100 نانومتر؛ مجال الرؤية: TIRF (الخيارات البديلة تسفر شدة الليزر العالي وتستخدم لfluorophores التي هي أكثر صعوبة لتبييض). - انقر على زر "نعم" عند ظهور القائمة المنبثقة مع استعلام حول تبديل على الليزر.
- استخدام "مدير التجربة" لتحميل اكتساب التكوين النخيل التي تم تصميمها بشكل مناسب أو تعديلها بسهولة.
- إحضار صورةمن الخلية إلى التركيز على الطائرة الكاميرا.
- اختيار 488 نانومتر برنامج التحصين الموسع في الإضاءة المسار الليزر.
ملاحظة: المسارات هي تكوينات شعاع استخدامها أثناء التصوير. هنا، يتم تحديد أسماء المسار من الطول الموجي الإثارة التي تنتج الانبعاثات التي يتم تمريرها إلى الكاميرا. على سبيل المثال، يستخدم نانومتر المسار 561 كلا من 405 و 561 نانومتر ليزر خطوط، ولكن المكعب تصفية الانبعاثات يمر فقط من photoconverted Dendra2 ولع ضوء 561 نانومتر إلى الكاميرا. - التركيز على صورة الخلية على الكاميرا باستخدام "مستمرة" الزر الاستحواذ.
- اختيار 488 نانومتر برنامج التحصين الموسع في الإضاءة المسار الليزر.
- جمع الصورة widefield التقليدية.
- استخدم زر "عض".
- حفظ الصورة عن طريق الذهاب إلى قائمة "ملف" واختيار "حفظ / حفظ باسم".
- إعداد الإضاءة القائم على TIRF.
- اختيار المسار 488 والتحول إلى "TIRF" باستخدام زر برنامج التحصين الموسع / TIRF.
- اختيار اقتناء "المستمر".
- ضبط طنانه TIRF القائم على إضاءة المنزلق.
ملاحظة: يتم تحقيق TIRF عندما يكون هناك سواد المفاجئ للخلفية ويمكن أن تركز العينة في واحد 18 طائرة. إذا أصبحت الميزات الجديدة واضحة عبر التركيز حتى في العينة، وزاوية السقوط منخفض جدا لأنه في TIRF هناك طائرة واحدة فقط من التركيز. - مراجعة ضعف زاوية TIRF باستخدام المسار 561 مع ليزر 405 نانومتر "قبالة".
- تحويل الليزر 405 نانومتر العودة "على" قبل بدء التجربة النخيل.
- جمع البيانات النخيل.
- ضرب "بدء التجربة."
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، افتح "خيارات المعالجة على الانترنت" علامة التبويب وتحقق "معالجة النخيل على الانترنت" و "صالح Gauss2D" (قبل بدء التجربة) لرصد الصورة PALM بناؤها خلال جمع البيانات الخام. وهذا سيسهل تقييم جودة البيانات، وبالتالي قيمة مواصلة عملية جمع البيانات نسبيا تستغرق وقتا طويلا. - بصريارصد photoconversion.
- زيادة كثافة من 405 نانومتر (photoconverting) الليزر عندما Dendra2 يتناقص photoconversion (عادة بعد اكتساب ~ 10،000 الصور الخام).
- تستمر التجربة إذا زيادات photoconversion. خلاف ذلك، والتوقف عن التجربة (دون فقدان البيانات) عن طريق ضرب "إيقاف" الزر الخطوة الحالية.
- حفظ الصور عند جمع البيانات كاملة (بعد ~ 15 دقيقة).
- ضرب "بدء التجربة."
3. معالجة الصور، والعرض، والتحليل
- في غياب معالجة الصور الخام، وعملية على الانترنت التي تم حفظها إلى القرص.
- انقر فوق علامة التبويب تجهيز وفتح علامة التبويب الأسلوب، وحدد "النخيل".
- اختيار "النخيل" مرة أخرى من suboptions الأربعة.
- اذهب إلى قائمة ملف، فتح وعرض ملف الفائدة، وضرب "حدد".
- ضرب "تطبيق".
ملاحظة: ستكون هذه الذروة بدء / fluorophore الحقائق والذروة مع التعريب الأمثل الافتراضيإضافات. إذا لزم الأمر، ويمكن أيضا أن تصنف قمم باستخدام "PAL-المجموعة" علامة التبويب. تجمع يعين القمم التي تظهر في عدة إطارات متتالية لجزيء واحد إذا كانت الإحداثيات الذروة متشابهة بما فيه الكفاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصحيح البيانات عن الانجراف العينة باستخدام النموذج القائم على خيار البرنامج في محاذاة الانجراف.
- تصفية عناصر سيئة وسيئة المترجمة عينات في البيانات المترجمة الذروة.
- تجاهل fluorophores مع توضيحات التعريب، σ،> 35 نانومتر باستخدام "PAL-تصفية" الأداة.
- تجاهل fluorophores في المناطق حيث متوسط المسافة بين القمم، د، كبير جدا لحل الحويصلات من قطر، D.
- استخراج الدقة يعني التوطين، σ، من الرسم البياني الدقة التعريب.
- حساب الحد الأقصى لقيمة مقبولة لد استنادا σ، وcriteron شانون-نيكويست 19، على النحو الوارد في القرار تقريب 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2D) 2] 1/2.
- تعيين العتبة في "إزالة القيم المتطرفة النخيل" أداة لحذف تحيط بها قمم أقل من πD 2 / (4D 2) الجيران داخل دائرة نصف قطرها D / 2.
- تحويل البيانات PALM معالجتها في صورة النخيل باستخدام "PAL-التقديم" أداة؛ انظر الشكل 1.
- تحديد أحجام وانتهاء الخدمة عن طريق اختيار وظيفة "الملف الشخصي".
- تحقق الخط والخيارات المرتبطة الجدول، ورسم خط على طول الاتجاه المطلوب في الصورة.
- قياس أقطار من خلال تحديد الاعراض الكامل في نصف كثافة القصوى.
- تحديد فصل عن طريق تحديد الذروة إلى الذروة المباعدة لمحات كثافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 المنتج النهائي واحد من التصوير والتجهيز. في هذه الصورة النخيل، وتظهر الإحداثيات الوحشي fluorophores المترجمة باستخدام وضع العرض النقطه الوسطى، ويظهر فائقة الدقة صورة DCV المرتبطة باستخدام وضع العرض الضبابي.
ويبين الشكل 2A widefield مماثلة وصور النخيل من سوما والعمليات القريبة من ثمانية أيام في الخلايا العصبية قرن آمون المختبر معربا عن سكتة-Dendra2. الميزات الهامة من الصور تشمل (1) واسعة، واحد الى واحد والمراسلات، والتداخل، وبين نقاط وفي الصور التقليدية والنخيل، (2) حجم أصغر بكثير من نقاط والنخيل، و (3) قرار من حين لآخر ل تنقط widefield واحد الى عدة نقاط والنخيل.
الرقم 2B يظهر صورة النخيل من DCVs على طول جزء من عملية الخلايا العصبية قرن آمون الثانية معربا عن سكتة-Dendra2. مهمملامح هذه الصورة تشمل (1) قطر صغير، ومظهر متجانس، من نقاط و، و (2) المراقبة نادرة من ارتباطا وثيقا apposed نقاط و/ مجموعات DCV المفترضة.
يوضح الشكل 3 طريقة بسيطة الكمي لتحديد ما إذا كان اثنين أو أكثر من DCVs قريبة بما فيه الكفاية لتشمل مجموعة؛ في النظم التي تجمع هو السائد، وأساليب أكثر تطورا، على أساس توزيع المهام، ويمكن استخدامها لتقدير 21. ويستند أسلوب بسيط على توليد ملامح خط شدة نقاط و(كما هو موضح في الرسوم البيانية)، والتي يمكن استخدامها لقياس وعرض الفصل DCV DCV. إذا فصل يتجاوز بكثير العرض (كما نوقش في أسطورة)، وDCVs لا "الاتصال"، في حين إذا الانفصال هو تقريبا نفس العرض، قد DCVs الاتصال. على أساس هذا المعيار، صنفت DCVs في لوحة وبأنها "ليست على اتصال" في حين تم تصنيف تلك الموجودة في لوحة B كما في يخدع براعة. باستخدام هذا النهج، وضعنا حدا أعلى من 8٪ ~ على المجموعات المرتبطة الاتصال DCVs extrasynaptic في تطوير الخلايا العصبية قرن آمون. وتتلخص حجمنا DCV والبيانات العنقودية في الجدول 1.
الشكل 1. تراكب من صورة PALM جاوس-المقدمة من DCV (أحمر) ووضع النقطه الوسطى العرض PALM صورة تظهر إحداثيات fluorophores photoconverted الفردية (بقع بيضاء) الواردة في DCV. يعرض الوضع السابق fluorophores المقدمة إلى وظائف جاوس مع الاعراض التي يحددها توضيحات التعريب فيها، ويعرض الأخير fluorophores / قمم كنقاط المترجمة في اجتماعهم (س، ص) بتنسيق. شريط = 0.1 ميكرون.ر = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. تراكب (أ) من widefield لخص (الخضراء) والنخيل (الحمراء) صور سوما والعمليات القريبة من الخلايا العصبية قرن آمون النامية معربا عن سكتة-Dendra2. تظهر مناطق التداخل أصفر / برتقالي. PALM الصورة (ب) من DCVs بطانة دون الإقليمية لعملية خلية أخرى معربا عن سكتة-Dendra2. قضبان = 5 و 2 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. الأغطية ( A و B) من widefield لخص (الخضراء) والنخيل (الحمراء) صور نقاط والخلايا العصبية في قرن آمون النامية معربا عن سكتة-Dendra2. وفي كلتا وحات، وتبين الصورة widefield تنقط كبيرة واحدة، في حين أن الصورة المرتبطة PALM حل هذه تنقط واحدة إلى قسمين نقاط وأضيق من ذلك بكثير. الرسوم البيانية تظهر ملامح كثافة مرمزة بالقياس تم الحصول عليها للنقاط وفي لوحة A (الرسم البياني الأيسر) في لوحة وB (الرسم البياني على اليمين). لمحات المستمدة من صورة النخيل في لوحة وتظهر أن لديها نقاط والعرض الكامل في نصف كثافة القصوى وهذا هو ~ 40٪ من التباعد بهم الذروة إلى الذروة؛ وبالتالي، هذه نقاط وهما ليسوا على اتصال ولم تصنف على أنها الكتلة المفترضة. في المقابل، فإن ملامح الصورة المستمدة من النخيل في لوحة B تظهر أن لديها نقاط والعرض الكامل في نصف كثافة القصوى التي هي في جوهرها نفس تباعد بهم الذروة إلى الذروة؛ وبالتالي، تم تصنيف هذه كمجموعة المفترضة. شريط = 0.2 ميكرون./ 51394fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| المعلمة | نتيجة | عدد DCVs تحليلها |
| العليا ملزمة على DCVs عنقودية | 7.9 ± 5.9٪ | 618 |
| يعني قطر DCV | 77 ± 21 نانومتر | 60 |
الجدول 1. حجم DCV وملخص البيانات العنقودية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ظهرت النخيل وتقنيات الفحص المجهري مضان فائقة الدقة ذات الصلة مؤخرا باعتباره مكملا قيما لأشكال أفضل من تأسيس المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني (EM) 22-24. وتشمل سمات إيجابية من النخيل إعداد نموذج بسيط نسبيا والحد الأدنى من العينة الاضطراب. من حيث المبدأ، PALM يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة الخلايا الحية. ربما السمة السلبية الرئيسية من النخيل هو الحصول على البيانات تستغرق وقتا طويلا، مما يعيق بشكل كبير الدراسات العمليات أسرع ديناميكية في الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك، PALM هو جديد نسبيا، وبالتالي المناسبة، fluorophores وبروتوكولات لإعداد العينات وللحصول على البيانات وتحليل دقيق لا يتم تطويرها و / أو موثقة بالكامل 3.
هنا وصفناها بروتوكول التي تناسب أحادية اللون، والدراسات القائمة على النخيل من الحويصلات في الخلايا المستزرعة ثابت. البروتوكول هو أيضا نقطة انطلاق جيدة لتطوير بالمثلوجهت والدراسات النخيل ثنائي اللون. ويدعم فعالية بروتوكول لدينا من قبل اثنين من السمات الرئيسية من البيانات النخيل لدينا. الأولى، وتوزيع نقاط والنخيل في منطقتنا بناؤها، وwidefield التكميلية والصور هي مشابهة جدا. الفرق كبير واحد في التوزيع - قرار عرضية من حيود محدودة في نقاط ونقاط ومتعددة عن طريق النخيل - يعكس قرار تعزيز ملحوظ من النخيل وزيادة فعالية هذه التقنية يؤكد والمرافق العامة.
الثاني، نتائج النخيل لدينا هي في اتفاق جيد، و / أو إذا كان يتمشى مع النتائج الأخرى ذات الصلة. على سبيل المثال، صور من الخلايا العصبية قرن آمون التي تم الحصول عليها باستخدام EM تكشف أحيانا عن طريق شرائح DCVs، وقطر DCV استنتاجها من شرائح 70-100 نانومتر هو ~ 11. الاتفاق ملحوظا بين البيانات النخيل لدينا وبيانات EM يبعث على الاطمئنان لكلا النهجين. PALM يزال يجري اختبارها، وEM عموما تخضع لمخاوف بشأن المطلوبة قاسية إعداد العينات. وبالمثل،أفلام محدودة حيود يعيشون الخلايا العصبية قرن آمون coexpressing الوهم الأخضر والأحمر التي تستهدف DCVs تبين أن تداخل نقاط والأخضر والأحمر الخضوع comovement المستمرة 25. التفسير الأكثر وضوحا من هذه النتيجة - تنشأ الإشارات الحمراء والخضراء من نفس DCV - يتسق مع النخيل، والذي يدل على أن الحيود محدودة نقاط وتمثل بأغلبية ساحقة DCVs الفردية. يبطل إلى حد كبير من النخيل - تفسير أقل وضوحا من comovement - تنشأ الإشارات الحمراء والخضراء من DCVs متفاوت المسافات.
بروتوكول الموصوفة هنا سمات إيجابية أخرى. على وجه الخصوص، وإعداد العينات واضحة نسبيا ومشابهة تماما لتلك مناسبة للفحص المجهري مضان التقليدية، مع اثنين من الاستثناءات البارزة: (1) يجب أن الحويصلات المسمى مع fluorophores photoconvertible أو photoactivatable، و (2) خلايا ثابتة وأفضل شنت في الوسط المائي. هذا simplici النسبيةتاي يعكس حقيقة أن التجارب هي قصيرة، وبالتالي لا تحتاج إلى عينات يكون المسمى مع حبات إيمانية (لتسهيل تصحيح الانحراف)، والتي يمكن أن تكون خادعة 26. بالإضافة إلى ذلك، وعادة ما تكون الحويصلات الموسومة مع العديد من fluorophores؛ وبالتالي، تحقيق كافية كثافة وضع العلامات fluorophore واضح ومباشر. في المقابل، لهياكل أخرى، وهذا يمكن أن يكون صعبا جدا 3. الحصول على الصور واضحة ومباشرة نسبيا أيضا. ومع ذلك، لا تتطلب PALM المكونات الإلكترونية والبصرية التي هي مكلفة والمتطورة لإشارات النخيل هي في جوهرها ضعيفة جدا.
ربما أكثر الجوانب تعقيدا من مركز النخيل حول معالجة، وتحليل، وعرض الصور النخيل. كما سلط الضوء هنا، وتنفيذ هذه الجوانب من النخيل يتطلب فهم العديد من القضايا خفية، بما في ذلك العلاقة بين أخذ العينات والقرار، والتمييز بين القرار ودقة الترجمة. وهكذا، عموما، PALM قtudies هي معقدة جدا دائما، ولكن هذا القرار تعزيز متوازنة من قبل أن من المرجح أن تكون كبيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R15 GM061539 2-02 (لوبا)، 2 R15 NS40425-03 (لJEL)، MH 66179 (الدكتور غاري بانكر أوريغون للصحة والعلوم / OHSU)، وP30 NS061800 (للدكتور سو Aicher من OHSU). نشكر باربرا Smoody للحصول على دعم واسع النطاق مع الثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون، والدكاترة. بريان لونج وجيمس بيلي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
