Summary
Vi beskriver, hvordan man gennemfører fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM)-baserede studier af vesikler i faste, dyrkede neuroner. De centrale elementer i vores protokol omfatter mærkning blærer med photoconvertible kimærer, indsamling af spredte, indsamlede rå billeder med en super-opløsning mikroskopi system og behandling af RAW-billeder til at producere en super-opløsning.
Abstract
Påvisning af fluorescens danner grundlaget for mange almindeligt anvendte og fremskridtsprægede mikroskopi teknikker, der anvendes i moderne biologiske og medicinske anvendelser. Styrker af fluorescens omfatter dens sensitivitet, specificitet og kompatibilitet med levende billeddannelse. Desværre konventionelle former for fluorescensmikroskopi lider en stor svaghed, diffraktionsbegrænset opløsning i afbildningsplanet, hvilket vanskeliggør undersøgelser af strukturer med dimensioner mindre end ~ 250 nm. For nylig er denne begrænsning blevet overvundet med indførelsen af super-opløsning fluorescensmikroskopi teknikker, såsom fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM). I modsætning til sine konventionelle kolleger, kan PALM producere billeder med en lateral opløsning af snesevis af nanometer. Det er således nu muligt at bruge fluorescens, med sine utallige styrker, at belyse et spektrum af tidligere utilgængelige attributter af cellestruktur og organisation.
_content "> Desværre PALM er ikke trivielt at implementere, og vellykkede strategier ofte skal være skræddersyet til den type system, der undersøges. I denne artikel viser vi, hvordan man gennemfører ensfarvede PALM studier af vesikulære strukturer i faste, dyrkede neuroner. PALM er velegnet til studiet af vesikler, der har dimensioner, der typisk spænder fra ~ 50-250 nm. Vigtige skridt i vores tilgang omfatter mærkning neuroner med photoconvertible (grøn til rød) kimærer af vesikel last, indsamling af spredte, indsamlede rå billeder med et super-opløsning mikroskopi system og behandling af RAW-billeder til at producere en høj opløsning PALM image. Vi viser også effekten af vores tilgang ved at præsentere usædvanligt godt løst billeder af tæt-core vesikler (DCVs) i dyrkede hippocampusneuroner, der tilbagevise den hypotese, at ekstrasynaptiske handel med DCVs medieres hovedsageligt ved DCV klynger.Introduction
En række cellulære processer er afhængige af præcis og effektiv vesikel-medieret handel af biomolekyler til specifikke subcellulære destinationer. Et prominent eksempel er synaptisk forsamling, der forud for lang varierede, vesikel-medieret levering af synaptiske bestanddele fra steder biogenese i den neuronale soma til potentielt distale præ-og postsynaptiske steder 1.
Fluorescens mikroskopi er en kraftfuld og populær metode til at studere vesikeludveksling. Styrker af teknikken omfatter dens sensitivitet, specificitet og kompatibilitet med levende billeddannelse 2. Desværre indtil for relativt nylig er teknikken udsat for en væsentlig svaghed, diffraktionsbegrænset opløsning 2, hvilket hæmmer undersøgelser af strukturer med dimensioner mindre end ~ 250 nm. For nylig, lateral opløsning i fluorescens mikroskopi overgået diffraktion barriere med indførelsen af super-opløsning fluorescens microscopy teknikker, såsom PALM 3. Den laterale opløsning på PALM, snesevis af nanometer, er velegnet til studiet af vesikler, der har dimensioner, der typisk spænder fra ~ 50-250 nm 4.. Det er således nu muligt at bruge fluorescens, med sine utallige styrker, til at belyse et spektrum af tidligere utilgængelige attributter af vesikler, herunder visse aspekter af deres handel til specifikke subcellulære sites.
PALM er ikke trivielt at implementere, og vellykkede strategier ofte skal være skræddersyet til den type system, der undersøges. Her beskriver vi, hvordan man gennemfører PALM studier af vesikuløse strukturer, og vi påvise effekten af vores tilgang til tilfælde af DCVs i hippocampus neuroner. Især bruger vi PALM til at løse den hypotese, at handel med DCVs til synapser i hippocampus neuroner medieres af DCV klynger 5-8.
Cluster-medieret handel med vesikler til synapser i udviklingslandene neurons er en spændende mulighed, fordi det kan lette en hurtig synaptic stabilisering og montage 9,10. Fortalere for klynger handel med DCVs citere stort tilsyneladende størrelse på ekstrasynaptiske fluorescerende puncta huser eksogene DCV last som dokumentation for clustering 6. Men disse puncta vises i billeder genereret ved hjælp af diffraktion-begrænset fluorescens mikroskopi teknikker, der ikke egner sig til størrelseseffekter skelne skyldes diffraktion fra dem, der opstår fra klyngedannelse.
For at løse dette problem, vi indsamlede konventionel Widefield fluorescens og PALM billeder af hippocampus neuroner udtrykker kimærer målrettet til DCVs. Analyse af disse billeder viste, at> 92% af formodede ekstrasynaptiske DCV klynger i konventionelle billeder er løst som 80 nm (individuel DCV-størrelse) 11 puncta i Palm billeder. Således er disse data i høj grad afkræfte clustering hypotese, som anvendes til DCVs i udviklingen hippocampal neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Prøveforberedelse
- Forbered DNA kodende for et photoconvertible eller fotoaktiverbart kimære målrettet DCVs ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker.
Bemærk: En mulighed er DNA, som koder et vævsplasminogenaktivator-Dendra2 kimære (TPA-Dendra2). Dendra2 er en photoconvertible protein, der skifter fra grøn til rød emission ved udsættelse for ultraviolet lys 12. - Kultur hippocampus neuroner på højtydende # 1.5 dækglas for ~ 5-10 dage, efter standardprotokoller 13.
- Transficere udvikle hippocampale neuroner ved hjælp af et kationisk lipid reagens.
Bemærk: Viral-medieret infektion er mere effektiv til modne neuroner. Denne alternative fremgangsmåde er blevet beskrevet i detaljer andetsteds 14.- Forbered et 1,5 ml rør indeholdende ~ 1 ug DNA og 250 pi minimalt essentielt medium (MEM) og en anden 1,5 ml rør indeholdende 4 pi af det kationiske lipid reagens og 250 piMEM.
- Inkubér løsninger for 5 min.
- Kombiner de to opløsninger og inkuberes den resulterende blanding i yderligere 30 min.
- Under inkubationen, forberede et fad indeholder nogle ml dyrkningsmedium opvarmet til 37 ° C.
- Overføre forsigtigt dækglas indeholder neuroner til fadet indeholder varme medium og tilsæt transfektionsblandingen.
- Vip skålen blidt og derefter placere den i en inkubator ved 37 ° C i 90 min.
- Retur neuroner til deres "hjem skål" og vente ~ 12-18 timer.
- Lave celler for 45 minutter i 4% paraformaldehyd / 4% saccharose i phosphatpufret saltopløsning (PBS, pH 7,4) opvarmes til 37 ° C.
Bemærk: i Palm eksperimenter, er det vigtigt at opnå en god konservering af ultrastruktur og standard formaldehyd fikseringen protokoller for immunfluorescensfarvning typisk ikke er tilstrækkelige 15. En vigtig årsag til dårlig strukturel konservering er utilstrækkelig fixation tid, fordi formaldehyd fiksering involverer adduktdannelse og proteintværbinding, og sidstnævnte proces er ganske langsomt 16. En 45 min fiksering er med til at afhjælpe dette problem med nogen påviselig overfixation-induceret tab af fluorescens. - Vask dækglas ~ 10x med filtreret PBS.
Bemærk: Dette reducerer fluorescerende stoffer. Billede prøver relativt hurtigt efter fiksering. I de mellemliggende, gemme celler ved 4 ° C i filtreret PBS i en lystæt beholder. - Mount dækglas indeholder neuroner i et kammer i filtreret PBS.
Bemærk: Prøven skal monteres i et vandigt medium, ligesom PBS, med brydningsindeks lavere end glas, for at gennemføre total intern refleksion fluorescens (TIRF)-baseret belysning. TIRF-baserede belysning er meget nyttigt, fordi kun dækglas-proksimale fluorophores er glade, og der er et stort tilhørende fald i baggrundsfluorescens 17..
2.. Image Acquisition </ P>
- Tænd super resolution imaging system.
- Tænd bue lampe.
- Vend "system / pc" og "Component" kontakter (på magten fjernbetjeningskontakten) til "on".
- Tænd for computeren (efter mikroskop kontrol tablet / docking station tændes).
Bemærk: docking station kan bruges til at styre og overvåge mange attributter af optik og lys sti, navnlig valget af mål og fokus. - Dobbeltklik på ikonet software og vælg "start-system" i login-dialogen.
- Undersøg prøven.
- Åbn det forreste og øverste adgangspaneler på laser sikkerhedskabinet.
- Vip transmitteret lys arm at få adgang til scenen og målsætninger.
- Kom olie på alpha Plan-Apochromat 100X numeriske åbning / NA = 1,46 (TIRF) mål.
Bemærk: En 63X høj NA mål kan anvendes i stedet for 100X. - Monter prøve på scenen, og hæve the mål mod prøven.
- Monitor linsen position ved hjælp af XYZ funktion af dockingstationen. Stop, når objektivet er i ballpark af fokus (fx z ~ 2,50 mm).
- Fuldt lukke adgang paneler.
Bemærk: For at aktivere laser sikkerhed. - Finjuster fokus ved hjælp af okularer og knapper under fanen lokalisere.
Bemærk: Fanen lokalisere giver adgang til knapper, der producerer buelampe baseret belysning og letter direkte observation af prøven med okularerne. Tilsvarende fanen Købet giver adgang til værktøjer, der producerer laserbaseret belysning og letter billedoptagelse af kameraet.- Gå til fanen lokalisere, vælg "Trans On".
- Klik på det okulære ekspansion symbol.
Bemærk: Dette bringer en skematisk af lysstrålen. Attributter af strålegangen kan ændres ved at venstreklikke passende ikoner i skematisk eller ved hjælp af touch screen på dockingstationen. For eksempel, et filteregnet til visning emission fra Dendra2 kan vælges ved hjælp af ikonet reflektor revolver. - Kig i okularerne, og bringe cellerne i fokus ved hjælp af dockingstationen som en vejledning.
Bemærk: Prøven vil være meget tyndt befolket med fluorescerende celler, fordi hippocampus neuroner er vanskelige at transficere, og det derfor kan være lidt tricky at fokusere ved hjælp af reflekteret lys. Hvis dette er tilfældet, skal du bruge transmitteret belysning og z læsning af dockingstationen som en vejledning. - Skift lyset "Off" efter fokusering.
- Identificer en celle, der er temmelig lyse, udviser punktformet fluorescens, og har en klassisk morfologi, der er tegn på et godt helbred.
- Vælg reflekteret lys og filter, der passer til visning grøn emission fra Dendra2.
- Scan dækglasset for celler, der udtrykker Dendra2 kimærer ved hjælp af lav intensitet excitation lys.
- Skift til akkvfanen uisition.
- Brug "eksperiment manager" for at indlæse en PALM erhvervelse konfiguration, der er hensigtsmæssigt udformet eller let modificeret.
Bemærk: Hvis der ikke sådan eksperiment findes, designe en start eksperimentel konfiguration ved hjælp af følgende indstillinger som en vejledning: lasereffekt skydere: 405 nm (~ 0,01% for en 50 mW laser); 488 nm (~ 3% for en 100 mW laser); 561 nm (~ 40% for en 100 mW laser); Eksponering tid: ~ 50 msek; Kamera gevinst: ~ 200; Multidimensional erhvervelse: tidsserie (cyklusser = 30.000, interval = 0); Tracks: 488 nm med epi-belysning, og 561 nm med TIRF-baserede belysning (se trin 2.5.1); Formål: 100X (NA = 1,46); Skyderen TIRF vinkel: indfaldsvinkel ~ 67-72 °; Pixel størrelse: 100 nm; Synsfelt: TIRF (alternative valg giver højere laser intensiteter og anvendes til fluorophores, der er sværere at blege). - Klik på "Ja", når en pop op-menu med en forespørgsel om at skifte på lasere.
- Brug "eksperiment manager" for at indlæse en PALM erhvervelse konfiguration, der er hensigtsmæssigt udformet eller let modificeret.
- Bringe billedetaf cellen i fokus på kameraet flyet.
- Vælg 488 nm epi-belysning laser spor.
Bemærk: Spor er beam konfigurationer anvendes under billedbehandling. Her bliver spornavnene bestemmes af ekscitationsbølgelængden der producerer udledningen, der er gået til kameraet. For eksempel 561 nm sporet bruger både 405 og 561 nm laser linjer, men filteret terning passerer kun emission fra photoconverted Dendra2 ophidset af 561 nm lys til kameraet. - Fokuser billedet af cellen på kameraet ved hjælp af "kontinuerlig" knappen erhvervelsen.
- Vælg 488 nm epi-belysning laser spor.
- Saml en konventionel vidvinkel billede.
- Brug "Snap"-knappen.
- Gem billedet ved at gå til menuen "Filer" og vælge "gem / gem som."
- Opsæt TIRF-baserede belysning.
- Vælg 488 spor og skifte til "TIRF" ved hjælp af EPI / TIRF knappen.
- Vælg "fortsat" køb.
- Justér than TIRF-baserede belysning skyderen.
Bemærk: TIRF opnås, når der er en pludselig mørkfarvning af baggrund, og prøven kan være fokuseret i ét plan 18. Hvis de nye funktioner bliver synlige via fokus op i stikprøven, indfaldsvinklen er for lav, fordi i TIRF er der kun én fokusplanet. - Dobbelttjek TIRF vinkel ved hjælp af 561 spor med 405 nm laser "off".
- Drej 405 nm laser tilbage "på", før du starter en PALM eksperiment.
- Saml PALM data.
- Hit "starte eksperiment."
Bemærk: Hvis det ønskes, skal du åbne fanebladet "online forarbejdning muligheder" og marker "online behandling PALM" og "Fit Gauss2D" (før du starter eksperimentet) at overvåge rekonstrueret PALM billede under rå dataindsamling. Dette vil lette vurderingen af kvaliteten af de data, og dermed værdien af at fortsætte den relativt tidskrævende dataindsamling proces. - Visueltovervåge fotoomdannelse.
- Øge intensiteten af 405 nm (photoconverting)-laser, når Dendra2 fotoomdannelse aftager (typisk efter erhvervelsen af ~ 10.000 rå billeder).
- Fortsæt eksperimentet hvis fotoomdannelse stiger. Ellers stopper forsøget (uden tab af data) ved at trykke på "stop" aktuelle skridt knappen.
- Gem billederne, når dataindsamlingen er afsluttet (efter ~ 15 min.)
- Hit "starte eksperiment."
3.. Image Processing, Display, og analyse
- I mangel af online behandling, proces rå billeder, der blev gemt på disken.
- Klik på fanen behandling, åbne fanen metode, og vælg "PALM."
- Vælg "PALM" igen fra de fire delløsninger.
- Gå til fil-menuen, åbne og se filen af interesse, og klik på "Vælg".
- Hit "anvendelse."
Bemærk: Dette vil indlede peak / fluorophor fund og peak lokalisering med standard options. Hvis det er nødvendigt, også toppe kan grupperes ved hjælp af "PAL-Group" fanen. Gruppering tildeler toppe, der vises i flere på hinanden følgende rammer til et enkelt molekyle, hvis peak koordinater er tilstrækkeligt ens. Desuden kan data korrigeres for prøve afdrift ved hjælp af softwarens modelbaserede afdrift tilpasning mulighed.
- Filtrere dårligt lokaliserede og dårligt stikprøven komponenter i peak-lokaliserede data.
- Kassér fluorophores med lokaliserings præciseringer, σ,> 35 nm ved hjælp af "PAL-Filter" værktøj.
- Kassér fluorforer på områder, hvor den gennemsnitlige afstand mellem toppe, d, er for stort til at løse vesikler diameter, D.
- Uddrag den gennemsnitlige lokalisering præcision, σ, fra lokalisering præcision histogram.
- Beregn en maksimal acceptabel værdi for d baseret på σ, og Shannon-Nyquist Criterion 19, som kommer til udtryk i beslutningen tilnærmelse 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
- Indstil tærsklen i "Fjern PALM outliers" værktøj til at slette toppe omgivet af færre end πD 2 / (4d 2) naboer inden for en cirkel med en radius D / 2.
- Konverter forarbejdet PALM data i en PALM billedet ved hjælp af "PAL-Rendering" værktøj; se figur 1.
- Kvantificere størrelser og separationer ved at vælge "Profil"-funktion.
- Tjek den tilhørende linie og tabel indstillinger, og trække en linje langs den ønskede retning i billedet.
- Kvantificere diametre ved bestemmelse af fuld bredde ved halv maksimal intensitet.
- Kvantificere separationer ved at bestemme peak-to-peak afstande af intensitet profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et slutprodukt af billeddannelse og behandling. I denne PALM billede, laterale koordinater for lokaliserede fluoroforer vist ved hjælp af den geometriske tyngdepunkt display mode, og den super-opløsning billede af den tilhørende DCV er vist ved hjælp af Gauss visningstilstand.
Figur 2A viser analog Widefield og Palm billeder af soma og proksimale processer af en otte dage in vitro hippocampus neuron udtrykker tPA-Dendra2. Vigtige aspekter af billederne inkluderer (1) omfattende, en-til-en korrespondance, og overlapning mellem puncta i de konventionelle og palm billeder (2) betydeligt mindre størrelse af PALM puncta, og (3) lejlighedsvis opløsning af et enkelt Widefield punctum i flere PALM puncta.
Figur 2B viser en PALM billede af DCVs langs en del af en proces med en anden hippocampus neuron udtrykker tPA-Dendra2. Vigtigtfunktioner i denne billede omfatter (1) lille diameter, og homogent udseende af puncta, og (2) sjælden observation af tæt apposed puncta / formodede DCV klynger.
Figur 3 skitserer en simpel kvantitativ metode til bestemmelse af, om to eller flere DCVs er tæt nok til at bestå af en klynge; i systemer, hvor clustering er udbredt, mere sofistikerede metoder, baseret på fordelingsfunktioner, kan bruges til kvantificering 21. Den enkle metode er baseret på generering line profiler puncta intensiteter (vist i graferne), som kan anvendes til at kvantificere DCV separation og DCV bredde. Hvis separation væsentligt overstiger bredde (som omtalt i legenden), de DCVs ikke "kontakt", hvorimod hvis adskillelsen er omtrent den samme som bredden, kan de DCVs kontakt. Baggrund af dette kriterium blev DCVs i Panel A klassificeres som "ikke i kontakt" mens de i panel B blev klassificeret som i con Takt. Ved hjælp af denne metode, vi sætter en øvre grænse på ~ 8% på kontakt-associeret klynger af ekstrasynaptiske DCVs i udviklingen hippocampusneuroner. Vores DCV størrelse og klynge data er opsummeret i tabel 1.
Figur 1.. Overlay af en Gauss-renderet PALM billede af en DCV (rød) og et centrum-visningstilstand PALM billede, der viser koordinaterne for de enkelte photoconverted fluoroforer (hvide prikker) er indeholdt i DCV. Den tidligere tilstand viser fluorophores hverv for Gauss-funktioner med bredder bestemt af deres lokaliserings præcisionsniveau, og de sidstnævnte viser fluoroforer / toppe som prikker lokaliseret på deres (x, y)-koordinaterne. Bar = 0,1 um.t = "_blank"> Klik her for at se større billede.
Figur 2.. Overlay (A) summeres Widefield (grøn) og Palm (rød) billeder af soma og proksimale processer af et udviklingsland hippocampus neuron udtrykker tPA-Dendra2. Regioner i overlap forekommer gul / orange. PALM billede (B) DCVs foring et underområde af en proces i en anden celle, der udtrykker tPA-Dendra2. Barer = 5 og 2 um. Klik her for at se større billede .
Figur 3.. Overlays ( A og B) af opsummerede Widefield (grøn) og Palm (rød) billeder af puncta i et udviklingsland hippocampus neuron udtrykker tPA-Dendra2. I begge paneler, den Widefield billede viser en enkelt stor punctum, mens den tilhørende PALM billedet løser dette enkelt punctum i to meget smallere puncta. Graferne viser analogt farvekodede intensitetsprofiler opnået for puncta i panel A (venstre graf), og i panel B (højre graf). Profilerne afledt fra PALM billedet i panel A viser, at puncta har en fuld bredde ved halv maksimal intensitet, der er ~ 40% af deres spids-til-spids afstand; således disse to puncta er ikke i kontakt og ikke klassificeret som en formodet klynge. I modsætning hertil profilerne afledt fra PALM billedet i panel B viser, at puncta har en fuld bredde ved halv maksimal intensitet, som er i det væsentlige den samme som deres spids-til-spids afstand; således blev disse klassificeret som en formodet klynge. Bar = 0,2 um./ 51394fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
| Parameter | Resultat | Antal DCVs analyserede |
| Øvre-bundet på grupperede DCVs | 7,9 ± 5,9% | 618 |
| Mean DCV diameter | 77 ± 21 nm | 60 |
Tabel 1.. DCV størrelse og klynge data resumé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM og relaterede super opløsning fluorescens mikroskopi teknikker har for nylig dukket op som et værdifuldt supplement til bedre etablerede former for optisk mikroskopi og elektronmikroskopi (EM) 22-24. Positive egenskaber for PALM omfatter relativt simple prøveforberedelse og minimal prøve forstyrrelse. I princippet også PALM kan bruges til at studere levende celler. Sandsynligvis den vigtigste negative egenskab af PALM er tidskrævende dataindsamling, som i væsentlig grad hæmmer undersøgelser af hurtigere dynamiske processer i levende celler. Desuden PALM er relativt nyt, og derfor passende, robuste fluorophores og protokoller om prøveforberedelse og for indsamling og analyse af data ikke er fuldt udviklet og / eller dokumenteret 3.
Her har vi beskrevet en protokol, der er velegnet til ensfarvede, palme-baserede studier af vesikler i faste, dyrkede celler. Protokollen er også et godt udgangspunkt for udvikling af tilsvarenderettet, dual-farve PALM undersøgelser. Effekten af vores protokol understøttes af to vigtige egenskaber hos vores PALM data. Først, er meget lig fordelingen af puncta i vores rekonstrueret PALM, og supplerende Widefield, billeder. Den ene signifikant forskel i distribution - lejlighedsvis opløsning af diffraktionsbegrænset puncta i flere puncta ved PALM - afspejler den markant forbedret opløsning af PALM og understøtter yderligere teknikkens effektivitet og nytte.
For det andet, vores PALM resultater er i god overensstemmelse, og / eller i overensstemmelse med andre relevante resultater. For eksempel billeder af hippocampus neuroner opnået ved hjælp af EM lejlighedsvis afsløre skiver gennem DCVs og DCV diameter udledes skiverne er ~ 70-100 nm 11.. Den bemærkelsesværdige aftale mellem vores PALM data og EM-data er betryggende for begge tilgange. PALM stadig bliver testet, og EM generelt er underlagt bekymringer om den nødvendige barske prøveforberedelse. Tilsvarendediffraktionsbegrænset film af levende hippocampusneuroner coekspression grønne og røde kimærer målrettet til DCVs viser, at overlappende grønne og røde puncta gennemgå vedholdende comovement 25. Den mest enkle fortolkning af dette resultat - de røde og grønne signaler udspringer af samme DCV - er i overensstemmelse med Palm, der viser, at diffraktionsbegrænset puncta overvældende repræsenterer individuelle DCVs. En mindre ligetil fortolkning af comovement - de røde og grønne signaler opstår klynger DCVs - er i vid udstrækning afkræftes af PALM.
Protokollen beskrevet her har andre positive egenskaber. Især prøveforberedelse er forholdsvis ligetil og ganske svarende til den, der passer til konventionel fluorescens mikroskopi, med to markante undtagelser: (1) vesikler skal mærkes med photoconvertible eller fotoaktiverbare fluorophores, og (2) faste celler er bedst monteret i vandige medier. Denne relative enkelhedty afspejler, at forsøgene er korte, og derfor prøver behøver ikke at mærkes med referencemærker perler (for at lette drift korrektion), som kan være vanskelig 26. Desuden normalt vesikler markeret med mange fluoroforer; således opnå tilstrækkelig fluorofor mærkning tæthed er ligetil. I modsætning til andre strukturer, kan det være ganske vanskeligt 3. Billede købet også er forholdsvis ligetil. PALM har dog kræve elektroniske og optiske komponenter, der er dyre og banebrydende, fordi Palm signaler er uløseligt meget svag.
Sandsynligvis den mest avancerede aspekter af PALM centrum omkring behandling, analyse og visning af PALM billeder. Som fremhævet her, gennemføre disse aspekter af PALM kræver en forståelse af en række subtile spørgsmål, herunder forholdet mellem prøvetagning og opløsning, og sondringen mellem opløsning og lokalisering præcision. Således samlet, PALM studies uvægerligt er ganske indviklet, men dette opvejes af opløsning ekstraudstyr, der sandsynligvis vil være betydelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud 2 R15 GM061539-02 (til BAS), 2 R15 NS40425-03 (til JEL), MH 66.179 (Dr. Gary Banker of Oregon Health & Science University / OHSU), og P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher af OHSU). Vi takker Barbara Smoody for omfattende støtte med den kultur af hippocampus neuroner, og Drs. Brian Lang og James Abney for en kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
