Summary
We beschrijven hoe de uitvoering fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)-gebaseerde studies van blaasjes in vaste, gekweekte neuronen. Belangrijke onderdelen van ons protocol etiket voorzien blaasjes met photoconvertible hersenschimmen, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een super-resolutie te produceren.
Abstract
Detectie van fluorescentie vormt de basis voor vele grote schaal gebruikt en snel voortschrijdende microscopie technieken die in de moderne biologische en medische toepassingen. Sterke punten van fluorescentie zijn onder meer de sensitiviteit, specificiteit, en compatibiliteit met live beeldvorming. Helaas, conventionele vormen van fluorescentie microscopie lijden aan een grote zwakte, buigingsbegrensd resolutie in het beeldvlak, die studies van structuren met afmetingen kleiner dan ~ 250 nm belemmert. Onlangs is deze beperking overwonnen door de invoering van superresolutie fluorescentie microscopie technieken, zoals fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM). In tegenstelling tot de conventionele tegenhangers, kan PALM beelden te produceren met een laterale resolutie van tientallen nanometers. Het is nu dus mogelijk om fluorescentie te gebruiken, met zijn talloze krachten, om een spectrum van eerder ontoegankelijke attributen van cellulaire structuur en organisatie helderen.
_content "> Helaas, PALM is niet triviaal te implementeren en succesvolle strategieën vaak moet worden afgestemd op het type systeem onder studie. In dit artikel laten we zien hoe een kleur PALM studies van vesiculaire structuren te implementeren in vaste, gekweekte neuronen. PALM is bij uitstek geschikt om de studie van blaasjes, die dimensies die doorgaans variëren van ~ 50-250 nm. Belangrijke stappen in onze aanpak zijn hebben etikettering neuronen met photoconvertible (groen naar rood) hersenschimmen van blaasje lading, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een hoge-resolutie PALM produceren. we de effectiviteit van onze aanpak aan te tonen ook door de presentatie bijzonder goed opgelost beelden van dense-core blaasjes (DCVS) in gekweekte hippocampale neuronen, die weerleggen de hypothese dat extrasynaptic handel in DCVS grotendeels wordt gemedieerd door DCV clusters.Introduction
Een aantal cellulaire processen afhankelijk nauwkeurige en efficiënte vesikel gemedieerde transport van biomoleculen specifieke subcellulaire bestemmingen. Een prominent voorbeeld is synaptische vergadering, die wordt voorafgegaan door lange varieerden,-blaasje bemiddelde levering van synaptische bestanddelen van sites van biogenese in de neuronale soma om potentieel distale pre-en postsynaptische plaatsen 1.
Fluorescentie microscopie is een krachtige en populaire methode van de bestudering blaasje mensenhandel. Sterke punten van de techniek zijn onder meer de sensitiviteit, specificiteit, en compatibiliteit met live beeldvorming 2. Helaas, tot voor kort, is de techniek te lijden van een grote zwakte, buigingsbegrensd resolutie 2, die studies van structuren met afmetingen kleiner dan ~ 250 nm belemmert. Onlangs, laterale resolutie in fluorescentie microscopie overtroffen de diffractie barrière met de introductie van de super-resolutie fluorescentie microscopy technieken, zoals PALM 3. De laterale resolutie van PALM, tientallen nanometers, is uitermate geschikt voor de studie van blaasjes, die dimensies die doorgaans variëren van ~ 50-250 nm 4 hebben. Het is nu dus mogelijk om fluorescentie te gebruiken, met zijn talloze krachten, om een spectrum van eerder ontoegankelijke attributen van vesicles, waaronder aspecten van de handel naar specifieke subcellulaire locaties helderen.
PALM is niet triviaal te implementeren en succesvolle strategieën vaak moet worden afgestemd op het type systeem onder studie. Hier beschrijven we hoe PALM studies van vesiculaire structuren voeren, en we de doelmatigheid van onze aanpak bij DCVS in hippocampale neuronen. In het bijzonder, maken we gebruik van PALM om de hypothese te staven dat de handel van DCVS om synapsen in de hippocampus neuronen wordt gemedieerd door DCV clusters 5-8.
-Cluster gemedieerde transport van blaasjes aan synapsen in het ontwikkelen van neurons is een intrigerende mogelijkheid, omdat het snelle synaptische stabilisatie en assemblage 9,10 kan vergemakkelijken. Voorstanders van geclusterde handel in DCVS noemen de grote schijnbare grootte van extrasynaptic fluorescerende puncta herbergen exogene DCV lading als bewijs dat clustering 6. Echter, deze puncta verschijnen in beelden geproduceerd met buigingsbegrensde fluorescentiemicroscopie technieken die niet geschikt zijn onderscheidende maat effecten van diffractie van die welke uit clustering.
Om dit probleem op te lossen, hebben we verzameld conventionele groothoek fluorescentie en PALM beelden van de hippocampus neuronen die hersenschimmen gericht op DCVS. Analyse van deze beelden bleek dat> 92% van de vermeende extrasynaptic DCV clusters in conventionele beelden worden opgelost als 80 nm (individuele DCV-en kleinbedrijf) 11 puncta in PALM beelden. Zo, deze gegevens grotendeels vervalt de clustering hypothese zoals toegepast op DCVS in ontwikkelingslanden HippocaMpal neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Bereid DNA dat voor een photoconvertible of fotoactiveerbare chimeer gericht op DCVS, met behulp van standaard moleculair biologische technieken.
Opmerking: Een mogelijkheid is DNA dat codeert voor een weefselplasminogeenactivator-Dendra2 chimera (TPA-Dendra2). Dendra2 is een photoconvertible eiwit dat overschakelt van groen naar rood emissie bij blootstelling aan ultraviolet licht 12. - Cultuur hippocampusneuronen op high performance # 1.5 dekglaasjes voor ~ 5-10 dagen, volgende standaard protocollen 13.
- Transfecteren ontwikkeling hippocampale neuronen met behulp van een kationogeen lipide reagens.
Opmerking: Virale-gemedieerde infectie is effectiever voor volwassen neuronen. Deze alternatieve benadering is elders in detail beschreven 14.- Bereid een 1,5 ml buis met ~ 1 ug DNA en 250 ul minimaal essentieel medium (MEM) en een tweede buis van 1,5 ml met 4 ui van het kationische lipide reagens en 250 glMEM.
- Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten.
- Combineer de twee oplossingen en incubeer het verkregen mengsel nog eens 30 minuten.
- Tijdens de incubatie stelt een schotel met meerdere ml kweekmedium verwarmd tot 37 ° C.
- Zacht overdracht dekglaasjes bevattende neuronen aan het schaaltje met warm medium en voeg de transfectie mengsel.
- Kantel de schotel voorzichtig en plaats deze vervolgens in een incubator bij 37 ° C gedurende 90 minuten.
- Terug neuronen naar hun "home gerecht" en wacht ~ 12-18 uur.
- Fix cellen voor 45 minuten in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) opgewarmd tot 37 ° C.
Opmerking: In PALM experimenten, is het belangrijk om een goede bewaring van ultrastructuur bereiken en formaldehyde fixatie standaard protocollen gebruikt voor immunofluorescentie kleuring typisch onvoldoende 15. Een belangrijke reden voor de slechte structurele behoud onvoldoende fixation tijd, omdat formaldehyde fixatie gaat adductvorming en eiwit verknoping, en het laatste proces is vrij traag 16. Een 45 minuten fixatie helpt dit probleem verminderen zonder waarneembare overfixation-geïnduceerd verlies van fluorescentie. - Wash dekglaasjes ~ 10x met gefilterd PBS.
Opmerking: Dit vermindert fluorescente verontreinigingen. Afbeelding monsters relatief snel na fixatie. In de tussentijd, bewaar de cellen bij 4 ° C in gefilterd PBS in een lichtdichte verpakking. - Mount dekglaasjes bevattende neuronen in een kamer in gefilterd PBS.
Opmerking: Het monster moet in een waterig medium, zoals PBS, met brekingsindex lager dan die van glas worden gemonteerd uitvoering totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) gebaseerde verlichting. -TIRF gebaseerde verlichting is erg handig omdat alleen dekglas-proximale fluoroforen zijn enthousiast, en er is een grote bijbehorende daling van de achtergrond fluorescentie 17.
2. Image Acquisition </ P>
- Zet de super-resolutie imaging systeem.
- Schakel de booglamp.
- Flip de "systeem / pc" en "component" schakelaars (op de kracht externe schakelaar) op "on."
- Zet de computer aan (na de microscoop controle tablet / dock gaat branden).
Opmerking: Het docking station kan worden gebruikt om vele eigenschappen van de optica en lichtpad, met name gekozen doelstelling en concentratie besturen en bewaken. - Dubbelklik op het software icoon en kies de "start-systeem" in het login dialoog.
- Onderzoek het monster.
- Open de voor-en bovenkant toegang panelen op de laser veiligheidskabinet.
- Kantel het doorgelaten licht arm om het podium en doelstellingen.
- Doe olie op de alpha Plan-Apochromat 100X numerieke lensopening / NA = 1,46 (TIRF) doelstelling.
Opmerking: Een 63X hoge NA doel kan worden gebruikt in plaats van de 100X. - Monteer het monster op het podium, en verhogen the doelstelling richting van het monster.
- Bewaken van de lens aan met de XYZ functie van het docking station. Stoppen wanneer de lens zich in de marge van de focus (bijvoorbeeld z ~ 2.50 mm).
- Volledig sluiten de toegang panelen.
Opmerking: Om de laser veiligheid bezighouden. - Fine-tunen van de focus met de lenzen en de knoppen in het tabblad te vinden.
Opmerking: Het lokaliseren tabblad biedt toegang tot knoppen die arc lampen op basis van de verlichting te produceren en vergemakkelijkt directe observatie van het monster met de oculairen. Ook het tabblad overname biedt toegang tot tools die laser-gebaseerde verlichting te produceren en vergemakkelijkt het vastleggen van beelden van de camera.- Ga naar het tabblad te vinden, kiest u "Trans On."
- Klik op de oculaire expansie symbool.
Let op: Deze actie zal een schema van het lichtpad. Attributen van het lichtpad kan worden gewijzigd door met de linkermuisknop te klikken op de juiste pictogrammen in het schema of met behulp van het touch screen op het docking station. Bijvoorbeeld, een filtergeschikt voor het bekijken van emissie uit Dendra2 kan worden gekozen met behulp van het pictogram reflector revolver. - Kijk in de oculairs, en breng de cellen in beeld met behulp van het docking station als een gids.
Opmerking: Het monster zal zeer dun bevolkt met fluorescerende cellen omdat hippocampusneuronen zijn moeilijk te transfecteren, en het kan dus een beetje lastig om scherp te stellen met gereflecteerd verlichting. Als dit het geval is, gebruik doorvallende verlichting en de z lezing van het docking station als een gids. - Toggle the light "Uit" na het scherpstellen.
- Identificeer een cel die is vrij helder, vertoont punctata fluorescentie, en heeft een klassieke morfologie, die indicatief is voor een goede gezondheid.
- Kies gereflecteerd licht en de filter geschikt is voor het bekijken van groene emissie uit Dendra2.
- Scan de dekglas voor cellen die Dendra2 chimaera's met behulp van lage intensiteit excitatie licht.
- Schakel over naar de ACQtabblad uisition.
- Gebruik de "experiment manager" een PALM overname configuratie die goed doordacht systeem is eenvoudig aan te passen of te laden.
Opmerking: Indien een dergelijke experiment bestaat, het ontwerpen van een beginnend experimentele configuratie met de volgende instellingen als leidraad: macht van de laser schuiven: 405 nm (~ 0,01% voor een 50 mW laser); 488 nm (~ 3% voor een 100 mW laser); 561 nm (~ 40% voor een 100 mW laser); Sluitertijd: ~ 50 msec; Camera winst: ~ 200; Multidimensionale overname: tijdreeksen (cycli = 30.000, interval = 0); Tracks: 488 nm met epi-verlichting, en 561 nm met TIRF-gebaseerde verlichting (zie stap 2.5.1); Doelstelling: 100X (NA = 1,46); TIRF hoek slider: invalshoek ~ 67-72 °; Pixelgrootte: 100 nm; Gezichtsveld: TIRF (de alternatieve keuzes leveren een hogere laser intensiteiten en worden voor fluoroforen die moeilijker te bleken). - Klik op "ja" als een pop-up menu verschijnt met een vraag over het inschakelen van lasers.
- Gebruik de "experiment manager" een PALM overname configuratie die goed doordacht systeem is eenvoudig aan te passen of te laden.
- Breng het beeldvan de cel in beeld op de camera vlak.
- Kies de 488 nm epi-verlichting laser spoor.
Opmerking: Tracks zijn beam configuraties gebruikt tijdens de beeldvorming. Hier worden tracknamen bepaald door de golflengte die de emissie die wordt doorgegeven aan de camera produceert. Bijvoorbeeld, de 561 nm spoor maakt gebruik van zowel de 405 en 561 nm laser lijnen, maar de filter kubus laat alleen emissie van photoconverted Dendra2 opgewekt door 561 nm licht naar de camera. - Scherp op het beeld van de cel op de camera met behulp van de "continu" overname knop.
- Kies de 488 nm epi-verlichting laser spoor.
- Verzamel afbeelding een conventionele groothoek.
- Gebruik de "Snap" knop.
- Sla de afbeelding op door te gaan naar het menu "Bestand" en te kiezen voor "opslaan / opslaan als."
- Stel de-TIRF gebaseerde verlichting.
- Kies de 488 spoor en over te schakelen naar "TIRF" met de EPI / TIRF knop.
- Kies "continu" overname.
- Pas thij-TIRF gebaseerde verlichting slider.
Opmerking: TIRF wordt bereikt wanneer er een plotselinge verduistering van de achtergrond en het model kan worden gericht in een vlak 18. Als er nieuwe functies worden duidelijk via scherp te stellen in het monster, de invalshoek is te laag, want in TIRF is er slechts een vlak van focus. - Controleer de TIRF hoek met de 561 track met de 405 nm laser "off."
- Draai de 405 nm laser terug "aan" voor het starten van een PALM experiment.
- Verzamelen PALM gegevens.
- Hit "start experiment."
Opmerking: Indien gewenst, opent u het tabblad "online processing opties" en vink "online verwerking PALM" en "Fit Gauss2D" (voordat het experiment) om het beeld gereconstrueerd PALM bewaken tijdens het verzamelen van ruwe data. Hierdoor wordt de beoordeling van de kwaliteit van de gegevens en dus de waarde van aanhoudende relatief tijdrovende gegevensverzameling te vergemakkelijken. - Visueelmonitoren photoconversion.
- Verhoog de intensiteit van de 405 nm (photoconverting) laser wanneer Dendra2 photoconversion afneemt (meestal na de overname van ~ 10.000 ruwe beelden).
- Blijven het experiment als photoconversion toeneemt. Anders stopt het experiment (zonder verlies van gegevens) door op de "stop" huidige stap knop.
- Sla de beelden bij het verzamelen van gegevens is voltooid (na ~ 15 min).
- Hit "start experiment."
3. Beeldverwerking, Display, en Analyse
- Bij het ontbreken van online verwerking, proces rauwe beelden die zijn opgeslagen op schijf.
- Klik op het tabblad bewerken, opent u het tabblad methode, en selecteer "PALM."
- Kies "PALM" weer uit de vier subopties.
- Ga naar het menu Bestand, open en bekijk het dossier van belang, en druk "te selecteren."
- Hit "van toepassing."
Opmerking: Dit zal piek / fluorophore bevinding en piek lokalisatie starten met standaard options. Indien nodig pieken ook kunnen worden gegroepeerd via het tabblad "PAL-groep". Groepering kent pieken die voorkomen in meerdere opeenvolgende frames om een enkel molecuul als de piek coördinaten voldoende vergelijkbaar zijn. Daarnaast kunnen de gegevens worden gecorrigeerd voor steekproef drift gebruik modelgebaseerde drift alignment optie van de software.
- Filteren slecht gelokaliseerde en slecht bemonsterd componenten in de piek-gelokaliseerde gegevens.
- Gooi fluoroforen met lokalisatie precisie, σ,> 35 nm, waarbij de "PAL-Filter" tool.
- Gooi fluoroforen in gebieden waar de gemiddelde afstand tussen de pieken, d, is te groot om blaasjes met een diameter van, D. lossen
- Pak de gemiddelde lokalisatie precisie, σ, uit de lokalisatie precisie histogram.
- Bereken een maximaal aanvaardbare waarde voor d op basis van σ, en de Shannon-Nyquist criteron 19, zoals belichaamd in de resolutiebenadering 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
- Stel de drempel in de "Verwijder PALM uitschieters" tool om pieken omringd door minder dan πD 2 / (4d 2) verwijderen buren binnen een straal van D / 2.
- Zetten de verwerkte gegevens PALM PALM afbeelding met behulp van de "PAL-Rendering" tool een in; zie figuur 1.
- Kwantificeren maten en scheidingen door te kiezen voor de "Profile"-functie.
- Controleer de bijbehorende lijn en tafel opties, en trek een lijn langs de gewenste richting in het beeld.
- Kwantificeren diameters door het bepalen van de volledige breedte op halve maximale intensiteit.
- Kwantificeren scheidingen door het bepalen van de piek-tot-piek afstanden van intensiteit profielen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een eindproduct van beeldvorming en verwerking. In dit beeld Palm, zijn laterale coördinaten van gelokaliseerde fluoroforen getoond met behulp van het zwaartepunt weergavemodus, en de super-resolutie afbeelding van de bijbehorende DCV wordt weergegeven met behulp van de Gauss weergavemodus.
Figuur 2A toont analoog groothoek en PALM beelden van de soma en proximale processen van een acht dagen in vitro hippocampus neuron uiten tPA-Dendra2. Belangrijke kenmerken van de beelden zijn de (1) uitgebreid, een-op-een relatie, en overlap tussen puncta in de conventionele en PALM afbeeldingen (2) aanzienlijk kleinere omvang van de PALM puncta en (3) af oplossing van een enkele groothoek punctum in meerdere PALM puncta.
Een PALM beeld van DCVS langs een deel van een proces van een tweede hippocampus neuron uiten tPA-Dendra2 figuur 2B toont. Belangrijkeigenschappen van dit beeld zijn de (1) kleine diameter en homogeen uiterlijk van de puncta en (2) zelden waarneming nauw apposed puncta / vermoedelijke DCV clusters.
Figuur 3 schetst een eenvoudige kwantitatieve methode te bepalen of twee of meer DCVS dicht genoeg bij een cluster omvat; in systemen waar clustering voorkomt, meer geavanceerde methoden, gebaseerd op verdelingsfuncties, kan worden gebruikt voor de kwantificering 21. De eenvoudige methode is gebaseerd op het genereren van lijnprofielen puncta intensiteiten (weergegeven in de grafieken), die kan worden gebruikt voor DCV scheiding en DCV breedte te kwantificeren. Als scheiding breedte aanzienlijk groter is dan (zoals besproken in de legenda), de DCVS niet "contact," terwijl als de scheiding is ongeveer hetzelfde als breedte, kan de DCVS contact. Op basis van dit criterium werden de DCVS in Panel A geclassificeerd als "geen contact" terwijl die in panel B werden geclassificeerd als in con tact. Met deze aanpak hebben we een bovengrens van ~ 8% on-contact geassocieerd clustering van extrasynaptic DCVS in het ontwikkelen van hippocampale neuronen. Onze DCV shape and cluster gegevens zijn samengevat in tabel 1.
Figuur 1. Overlay een Gauss-gerenderde PALM beeld van een DCV (rood) van beeld en een zwaartepunt-weergavemodus PALM tonen coördinaten van individuele photoconverted fluoroforen (witte stippen) die in de DCV. De voormalige modus geeft fluoroforen bewezen aan Gaussische functies met breedte bepaald door hun lokalisatie precisie, en deze displays fluoroforen / pieken als stippen gelokaliseerd in de (x, y)-coördinaten. Bar = 0,1 urn.t = "_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Overlay (A) van gesommeerd groothoek (groen) en PALM (rood) beelden van de soma en proximale processen van een zich ontwikkelende hippocampus neuron uiten tPA-Dendra2. Regio's van overlap verschijnen geel / oranje. PALM afbeelding (B) van DCVS voering een deelgebied van een proces van een andere cel die tPA-Dendra2. Bars = 5 en 2 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Overlays ( A en B) van gesommeerd groothoek (groen) en PALM (rood) beelden van puncta in een ontwikkelingsland hippocampus neuron uiten tPA-Dendra2. In beide panelen, het imago van de groothoek toont een enkele grote punctum, terwijl de bijbehorende afbeelding PALM lost deze single punctum in twee veel smaller puncta. De grafieken tonen analoog kleurcode intensiteit profielen verkregen voor de puncta in paneel A (linker grafiek) en in panel B (rechter grafiek). De profielen zijn afgeleid van de palm in paneel A blijkt dat de puncta hebben een breedte bij halve maximale intensiteit die is ~ 40% van de top-tot-piek afstand; dus, deze twee puncta niet in contact en werden niet geclassificeerd als een vermoedelijke cluster. In tegenstelling, de profielen afgeleid van de palm in panel B tonen dat de puncta een breedte op halve maximale intensiteit die in wezen hetzelfde als de piek-tot-piek afstand; derhalve werden deze geclassificeerd als potentieel cluster. Bar = 0,2 pm./ 51394fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
| Parameter | Resultaat | Aantal DCVS geanalyseerd |
| Bovengrens op geclusterde DCVS | 7.9 ± 5.9% | 618 |
| Bedoel DCV diameter | 77 ± 21 nm | 60 |
Tabel 1. DCV grootte en cluster data samenvatting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM en aanverwante super-resolutie fluorescentie microscopie technieken zijn onlangs naar voren gekomen als een waardevolle aanvulling om beter gevestigde vormen van optische microscopie en elektronenmicroscopie (EM) 22-24. Positieve eigenschappen van PALM omvatten relatief eenvoudige monstervoorbereiding en minimale steekproef verstoring. In principe PALM ook worden gebruikt om levende cellen te bestuderen. Waarschijnlijk de belangrijkste negatieve eigenschap van PALM is tijdrovend data-acquisitie, die aanzienlijk belemmert studies van snellere dynamische processen in levende cellen. Daarnaast PALM is relatief nieuw, en dus van toepassing, robuust fluoroforen en protocollen voor monstervoorbereiding en voor data-acquisitie en-analyse niet volledig zijn ontwikkeld en / of gedocumenteerd 3.
Hier hebben we een protocol dat geschikt is voor een kleur,-PALM gebaseerde studies van blaasjes in vaste, gekweekte cellen beschreven. Het protocol is ook een goed uitgangspunt voor de ontwikkeling van soortgelijke wijzegericht, PALM tweekleurige studies. De werkzaamheid van ons protocol wordt ondersteund door twee hoofdkenmerken van onze PALM gegevens. Ten eerste, de verdeling van de puncta in onze gereconstrueerde PALM en complementaire groothoek, beelden is zeer vergelijkbaar. De een significant verschil in de distributie - incidentele resolutie van buigingsbegrensde puncta in meerdere puncta door PALM - weerspiegelt de sterk verbeterde resolutie van PALM en verder onderstreept effectiviteit en het nut van de techniek.
Ten tweede, onze PALM resultaten komen goed overeen, en / of niet consistent, met andere relevante resultaten. Bijvoorbeeld, beelden van hippocampale neuronen verkregen met behulp van EM soms onthullen plakjes door DCVS, en de DCV diameter afgeleid uit de plakjes is ~ 70-100 nm 11. De opmerkelijke overeenkomst tussen onze PALM gegevens en de EM-gegevens is geruststellend voor beide benaderingen. PALM nog wordt getest, en EM algemeen is onderworpen aan de bezorgdheid over de vereiste harde monstervoorbereiding. Evenzobuigingsbegrensd films van levende hippocampusneuronen co-expressie groene en rode chimaera's gericht op DCVS tonen dat overlappende groene en rode puncta ondergaan aanhoudende comovement 25. De meest eenvoudige interpretatie van dit resultaat - de rode en groene signalen voortkomen uit dezelfde DCV - in overeenstemming is met PALM, waaruit blijkt dat buigingsbegrensd puncta overweldigend vormen de afzonderlijke DCVS. Een minder eenvoudige interpretatie van comovement - de rode en groene signalen komen voort uit geclusterde DCVS - wordt grotendeels ontkracht door PALM.
De hier beschreven protocol heeft ook andere positieve eigenschappen. Vooral monstervoorbereiding is betrekkelijk eenvoudig en lijkt op die geschikt zijn voor conventionele fluorescentiemicroscopie, met twee uitzonderingen: (1) vesicles worden gelabeld met photoconvertible of activeerbare fluoroforen, en (2) gefixeerde cellen worden best aangebracht in waterige media. Deze relatieve Simplicity weerspiegelt het feit dat de experimenten zijn kort en daardoor monsters hoeven niet met betrouwbaarheidsgrenzen kralen worden gemerkt (drift correctie vergemakkelijken), die moeilijk 26 kunnen worden. Bovendien blaasjes meestal gelabeld met fluoroforen veel; dus toereikende fluorofoor etikettering dichtheid eenvoudig. In tegenstelling tot andere structuren, kan dit heel moeilijk 3. Afbeelding overname is ook relatief eenvoudig. Echter, PALM vereist elektronische en optische componenten die zijn duur en cutting-edge omdat PALM signalen zijn intrinsiek zeer zwak.
Waarschijnlijk de meest geavanceerde aspecten van PALM centrum rond de verwerking, analyse en weergave van PALM afbeeldingen. Zoals hier uitgelicht, de implementatie van deze aspecten van PALM vereist een begrip van enkele subtiele kwesties, waaronder de relatie tussen monsterneming en resolutie, en het onderscheid tussen resolutie en lokalisatie precisie. Daarom als geheel PALM studies steevast zijn vrij ingewikkeld, maar dit wordt gecompenseerd door de resolutie verbetering die is waarschijnlijk significant zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent 2 R15 GM061539-02 (aan BAS), 2 R15 NS40425-03 (naar JEL), MH 66.179 (dr. Gary Banker van Oregon Health & Science University / OHSU), en P30 NS061800 (dr. Sue Aicher van OHSU). Wij danken Barbara Smoody voor uitgebreide ondersteuning met de cultuur van hippocampale neuronen, en Drs. Brian Long en James Abney voor een kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
