Summary
Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir.
Abstract
Floresan tespiti, modern biyolojik ve tıbbi uygulamalarda kullanılan birçok yaygın olarak kullanılan ve hızla ilerleyen mikroskopi teknikleri için temel sağlar. Floresan güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme ile uyumluluk içerir. Ne yazık ki, floresan mikroskopi geleneksel formları ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir görüntüleme düzlemde önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük, muzdarip. Son zamanlarda, bu tür sınırlama fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri, tanıtımı ile aşılmıştır. Geleneksel muadillerine aksine, PALM nanometre onlarca yanal çözünürlükte görüntüler üretebilir. Bu hücresel yapı ve organizasyon önce ulaşılmaz özellikleri bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır.
_content "> Maalesef, PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Bu yazıda, sabit, kültürlü nöronlar veziküler yapıların tek renk PALM çalışmaları nasıl uygulanacağını göstermektedir. PALM ideal 50-250 nm ~ dan. yaklaşımımızda Temel adımlar şunlardır tipik aralığı boyutları veziküllerden çalışmaya uygun bir ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplama, photoconvertible (kırmızı yeşil) vezikül kargo kimeralardır nöronları etiketleme süper çözünürlük mikroskopi sistemi ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntü üretmek için ham görüntü işleme. Biz de çürütmek, hangi kültüre hipokampal nöronlar yoğun çekirdekli kesecikler derece iyi çözüme görüntüleri (DCVs) sunarak bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek DCVs arasında extrasynaptic kaçakçılığı AEOV kümeleri büyük ölçüde aracılık ettiğini hipotezi.Introduction
Hücresel süreçlerin bir dizi özel subsellüler noktaya biyomoleküllerin doğru ve verimli vezikül aracılı kaçakçılığı bağlıdır. Bir önemli örnek potansiyel distal pre-ve postsinaptik sitelere 1 nöronal soma içinde biyotekvinin sitelerinden sinaptik bileşenlerin uzun menzilli, vezikül aracılı teslimat öncesinde, hangi sinaptik montaj olduğunu.
Floresan mikroskopi vezikül kaçakçılığı okuyan güçlü ve popüler bir yöntemdir. Tekniği güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme 2 ile uyumluluğu gibi. Ne yazık ki, yakın zamana kadar, teknik ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük 2, zarar gördü. Son zamanlarda, floresan mikroskobu lateral çözünürlük süper çözünürlüklü floresan mi getirilmesi ile kırılma engelini aştıBöyle PALM 3 gibi croscopy teknikleri. PALM yanal çözünürlüğü, nanometre on, ideal olarak genelde ~ 50-250 nm 4 arasında değişen boyutlara sahip veziküller, çalışma için uygundur. Bu, belirli bir hücre içi sitelerine ticareti bazı yönlerini de dahil olmak üzere, daha önce veziküllerin erişilemez özellikleri, bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır.
PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Burada veziküler yapıların PALM çalışmaları nasıl tanımlamak, ve biz hipokampal nöronlarda DCVs durumunda bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek. Özellikle, biz hipokampal nöronlar sinaps hipotezi DCVs bu ticaretiyle mücadele için PALM kullanmak AEOV kümeleri 5-8 aracılık eder.
N gelişmekte sinaps veziküllerin Küme aracılı ticaretibu hızlı sinaptik istikrar ve montaj 9,10 kolaylaştırabilir çünkü eurons ilginç bir olasılıktır. DCVs kümelenmiş kaçakçılığı savunucuları kümeleme 6 destekleyen kanıt olarak eksojen AEOV kargo barındıran extrasynaptic floresan punktumlarda büyük görünen boyutunu öngörmektedirler. Ancak, bu puncta kümeleme kaynaklanan olanlardan difraksiyonuyla kaynaklanan ayırt edici boyutu etkilerine uygun değildir kırınım-sınırlı floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak oluşturulan görüntülerde.
Bu sorunu çözmek için, biz konvansiyonel widefield floresan ve DCVs hedefleyen kuruntulardan ifade hipokampalinden PALM görüntülerini topladı. Bu görüntülerin analiz konvansiyonel görüntülerde varsayılan extrasynaptic AEOV kümelerin> 92% 80 nm PALM görüntüleri (bireysel DCV-ölçekli) 11 puncta olarak çözülmesi olduğunu ortaya çıkardı. Hippoca gelişmekte DCVs uygulanan Bu nedenle, bu veriler, büyük ölçüde kümelenme hipotezi geçersizMPAL nöronlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Numune Hazırlama
- Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, DCVs hedeflenmiş bir photoconvertible veya foto-aktifleştirilebilen kimera kodlayan DNA hazırlayın.
Not: Bir olasılık, DNA kodlayan bir doku plazminojen aktivatör-Dendra2 kimera (tPA-Dendra2). Dendra2 yeşilden morötesi ışığa maruz kalma üzerine, 12 kırmızı emisyon geçer photoconvertible bir proteindir. - Yüksek performanslı # 1.5 kapağında Kültür hipokampal nöronlar standart protokollere 13 aşağıdaki ~ 5-10 gün boyunca kayar.
- Bir katyonik lipid tepkime maddesi kullanılarak hipokampal nöronlar geliştirilmesi transfer edin.
Not: Viral aracılık ettiği enfeksiyon olgun nöronlar için daha etkilidir. Bu alternatif yaklaşım, başka bir yerde, 14 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir.- ~ 1 ug DNA ve minimum temel ortam (MEM) ve katyonik lipid tepkime maddesi 4 ul ve 250 ul ihtiva eden ikinci bir 1.5 ml tüp 250 ul ihtiva eden bir 1.5 ml tüpü hazırlayınMEM.
- 5 dakika için çözümler inkübe edin.
- Iki çözeltinin birleştirin ve fazladan bir 30 dakika boyunca inkübe edilen karışımın.
- İnkübasyon sırasında, kültür ortamı birkaç ml ihtiva eden bir tabak 37 ° C'ye kadar ısıtıldı hazırlamak
- Yavaşça sıcak ortamı içeren çanak nöron içeren kapak fişleri aktarmak ve transfeksiyon karışımı ekleyin.
- Yavaşça çanak yatırın ve daha sonra 90 dakika boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin.
- Kendi "ev çanak" nöronların dönün ve ~ 12-18 saat bekleyin.
- Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz içinde 45 dakika boyunca, hücreler (PBS, pH 7.4) 37 ° C'ye ısıtıldı
Not: PALM deneylerde, bu ultrastrüktürdeki iyi bir koruma elde etmek için önemlidir ve immünofloresan boyama için kullanılan standart formaldehit tespit protokoller genellikle 15 yeterli değildir. Zayıf yapısal korunması için bir önemli nedeni yetersiz fformaldehit tespit adukt oluşumunu ve protein çapraz bağlanmayı gerektirir, ve ikincisi süreç 16 oldukça yavaş ixation zamanı çünkü. Bir 45 dakika tespit Flüoresansın saptanabilir overfixation kaynaklı kaybı ile bu sorunu azaltmaya yardımcı olur. - Yıkama kapak süzülmüş PBS ile ~ 10x kayıyor.
Not: Bu floresan kirleticileri azaltır. Görüntü örnekleri nispeten hızlı bir şekilde tespit sonrası. Bir ışık geçirmez bir kap içinde, filtre PBS içinde 4 ° C de ara depolamak hücrelerinde. - Süzülmüş, PBS içinde bir bölme ihtiva eden nöronların Dağı kapak slipleri.
Not: Örnek camın daha düşük bir kırılma endeksi ile PBS gibi sulu bir ortamda, monte edilmelidir, toplam iç yansıma flüoresans (TIRF) bazlı aydınlatma uygulamak. Sadece kapak kayma-proksimal flüoroforlar heyecanlıyız çünkü TIRF-tabanlı aydınlatma çok yararlı olduğunu ve eşiğe 17 büyük ilişkili düşüş var.
2.. Image Acquisition </ P>
- Süper çözünürlük görüntüleme sistemi açın.
- Ark lambasını açmak.
- Için (güç uzaktan anahtarı) "Sistem / pc" ve "bileşen" anahtarları çevirin "üzerine."
- Bilgisayar (mikroskop kontrol tablet / docking istasyonu sonra yanar) açın.
Not: Docking istasyonu optik ve ışık yolu birçok niteliğini, objektif ve odak özellikle seçim kontrol etmek ve izlemek için kullanılır. - Çift yazılım simgesini tıklatın ve oturum açma iletişim kutusunda "start sistemi" seçeneğini seçin.
- Örneği inceleyin.
- Lazer güvenlik kabini üzerinde ön ve üst erişim panellerini açın.
- Sahne ve hedeflerini ulaşmak için iletilen ışık kolunu eğin.
- Alfa Plan-Apochromat 100X sayısal açıklık üzerinde yağ koymak / NA 1.46 (TIRF) nesnel =.
Not: A 63X yüksek NA amacı 100X yerine kullanılabilir. - Sahnede örnek montaj ve inci yükseltmeknumunenin doğru e objektif.
- Docking istasyonunun XYZ fonksiyonunu kullanarak mercek konumunu izlemek. Lens odak Basketbol Sahası (örneğin, z ~ 2.50 mm) olduğu zaman durdurun.
- Tam erişim panelleri kapatın.
Not: lazer güvenlik meşgul etmek. - İnce ayar bulmak sekmesinde Okülerin ve düğmelerini kullanarak odağı.
Not: bulmak sekmesi ark lambası-tabanlı aydınlatma üretmek ve Okülerin ile numunenin doğrudan gözlem kolaylaştıran düğmeler erişim sağlar. Benzer şekilde, satın alma sekmesi lazer tabanlı aydınlatma üretmek ve kamera tarafından görüntü yakalama kolaylaştırır araçlara erişim sağlar.- Seçin, bulmak sekmesine gidin "Trans On."
- Oküler genişleme sembolünü tıklatın.
Not: Bu ışık yolu bir şemasını getirir. Işık yolu Özellikler sol şematik uygun simgeleri tıklatarak veya docking istasyonunun üzerindeki dokunmatik ekran kullanılarak değiştirilebilir. Örneğin, bir filtreDendra2 gelen emisyon görüntüleme için uygun reflektör tabanca simgesini kullanarak seçilebilir. - Okülerler içine bak ve bir rehber olarak docking istasyonunu kullanarak odak noktası haline hücreleri getirmek.
Not: hipokampal nöronlar transfect zordur, ve böylece yansıyan aydınlatma kullanarak odaklanmak için biraz zor olabilir, çünkü örnek çok seyrek floresan hücreleri ile doldurulur olacaktır. Bu durumda, bir rehber olarak iletilen aydınlatma ve yerleştirme istasyonunun z okuma kullanın. - Odaklama sonra "Off" ışık geçiş.
- , Oldukça parlak noktasal floresan sergiler ve iyi bir sağlık göstergesidir klasik bir morfolojiye sahip bir hücre belirleyin.
- Yansıyan ışık ve Dendra2 yeşil emisyon görüntüleme için filtre uygun olanı seçin.
- Düşük yoğunluklu uyarma ışık kullanarak Dendra2 kuruntulardan sentezleyen hücrelerin kapak kayma tarayın.
- ACQ geçinuisition sekmesi.
- Uygun tasarlanmış ya da kolayca değiştirilebilir bir PALM edinim yapılandırmayı yüklemek için "deneme yöneticisini" kullanın.
Not: Lazer güç kaydırıcıları: yok böyle bir deney varsa, bir kılavuz olarak aşağıdaki ayarları kullanarak bir başlangıç deneysel tasarım yapılandırmasından 405 nm (~ 50 mW lazer için% 0,01); 488 nm (~ 100 mW lazer için% 3); 561 nm (~ 100 mW lazer için 40%); Pozlama süresi: ~ 50 msn; Kamera kazanç: ~ 200; Çok boyutlu edinimi: zaman serisi (çevrim = 30.000, interval = 0); Tracks: epi-aydınlatma ile 488 nm ve TIRF-tabanlı aydınlatma (adım 2.5.1 bakınız) ile 561 nm; Amaç: 100X (NA 1,46 =); TIRF açı kaydırıcı: zaviyesi ~ 67-72 °; Piksel boyutu: 100 nm; Görüş alanı: TIRF (alternatif seçenekler yüksek lazer yoğunluklarını verim ve ağartmak için daha zor floroforlar için kullanılır). - Bir pop-up menü lazerler açıldıktan yaklaşık bir sorgu ile göründüğünde "evet" tıklayın.
- Uygun tasarlanmış ya da kolayca değiştirilebilir bir PALM edinim yapılandırmayı yüklemek için "deneme yöneticisini" kullanın.
- Görüntü getirinKamera düzlemde odak noktası haline hücre.
- 488 nm epi-aydınlatma lazer parçayı seçin.
Not: Parçalar görüntüleme sırasında kullanılan ışın yapılandırmalar. Burada, parça adları kameraya geçirilen emisyon üretir uyarım dalga boyu ile belirlenir. Örneğin, 561 nm parça 405 ve 561 nm lazer çizgileri hem de kullanır, ancak filtre küp kameraya 561 nm ışık heyecanlı photoconverted Dendra2 sadece emisyon geçer. - "Sürekli" toplama düğmesini kullanarak kamera hücrenin görüntüsünü odaklanın.
- 488 nm epi-aydınlatma lazer parçayı seçin.
- Geleneksel geniş açılı görüntü toplamak.
- "Yakala" düğmesini kullanın.
- "Dosya" menüsünden gidiyor ve seçerek görüntüyü kurtarmak "olarak kaydetmek / kaydedin."
- TIRF-tabanlı aydınlatma ayarlayın.
- 488 parça seçin ve EPI / TIRF düğmesini kullanarak "TIRF" geçmek.
- "Sürekli" satın seçin.
- T ayarlayınO TIRF-tabanlı aydınlatma kaymak.
Not: Orada arka ani yitirmesidir VE numune BİR düzlemde 18 odaklı olabilir zaman TIRF elde edilir. Yeni özellikler numune içine odaklanarak yoluyla belirgin hale gelirse TIRF odak tek bir uçak olduğundan, geliş açısı çok düşük. - Çift 405 nm lazer ile 561 parçayı kullanarak TIRF açısını kontrol "kapalı."
- Bir PALM deney başlamadan önce "on" Geri 405 nm lazer çevirin.
- PALM verileri toplayın.
- "Deney başlar." Hit
Not: İstenirse, "online işlem seçenekleri" sekmesini açın ve ham veri toplama sırasında yeniden PALM görüntüyü izlemek için (deney başlamadan önce) "online işlem PALM" ve "Fit Gauss2D" kontrol edin. Bu, verilerin kalitesi ve nispeten zaman alan bir veri toplama işlemi devam böylece değerinin değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. - GörmeFotoçevrim monitör.
- 405 nm (photoconverting) lazer yoğunluğunu artırın zaman Dendra2 Fotoçevrim azalıyor (genelde ~ 10.000 ham görüntülerin kazanılmasından sonra).
- Fotoçevrim artar eğer denemelerimiz devam ediyor. Aksi takdirde, "dur" Geçerli adım düğmesine basarak (veri kaybı olmadan) Denemeyi durdurmak.
- Veri toplama (~ 15 dakika sonra) tamamlandığında kaydedin.
- "Deney başlar." Hit
3.. Görüntü İşleme, Görüntü ve Analiz
- Diske kaydedildiği online işlem, süreç ham görüntülerin yokluğunda.
- , Işlem sekmesine tıklayın yöntem sekmesini açın ve "PALM."
- Dört suboptions tekrar "PALM" seçiniz.
- Açık, dosya menüsüne gidin ve ilgi dosyasını görüntülemek ve hit "seçeneğini seçin."
- Hit "uygulanır."
Not: Bu varsayılan opti tepe / fluoroforun bulgu ve zirve lokalizasyonu başlatacaktırons. Gerekirse, zirveleri de "PAL-Grubu" sekmesi kullanılarak toplanabilir. Gruplama zirve koordinatlar yeterince benzer olup olmadığını tek bir molekülün birkaç ardışık kare görünür zirveleri atar. Buna ek olarak, veri yazılımın model tabanlı sürüklenme hizalama seçeneğini kullanarak örnek sürüklenme için düzeltilebilir.
- Tepe-lokalize veri kötü lokalize ve kötü örnek bileşenleri filtre.
- Yerelleştirme kesinleşmemiş ile floroforları atmak, σ,> "PAL-Filter" aracını kullanarak 35 nm.
- Zirveleri, d arasındaki ortalama mesafe, çap, D. kabarcıklarına çözmek için çok büyük olduğu alanlarda florosforlar atın
- Yerelleştirme hassas histogramdan, σ, ortalama yerelleştirme hassasiyet ayıklayın.
- Σ dayalı d için kabul edilebilir maksimum değeri ve Shannon-Nyquist criteron 19 hesaplayın, çözünürlük yaklaşım 20 R somutlaşan gibi = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
- Yarıçapı D / 2 bir daire içinde / (4d 2) πD 2 daha az çevrili zirveleri silmek için "PALM aykırı Kaldır" aracı komşular eşik ayarlayın.
- "PAL-Rendering" aracını kullanarak bir PALM görüntü içine işlenmiş PALM verileri dönüştürmek; Şekil 1'e bakınız.
- "Profil" fonksiyonunu seçerek boyutlarını ve ayrımları ölçmek.
- Ilişkili hat ve masa seçenekleri kontrol ve görüntüde istenilen yöne boyunca bir çizgi çizin.
- Yarı-maksimum yoğunlukta tam genişlikler saptanmasıyla çapları ölçmek.
- Yoğunluk profilleri tepe-tepe aralıkları belirleyerek ayrımları niceliğini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, görüntüleme ve işlem bir son ürünü göstermektedir. Bu PALM görüntüde, lokalize Flüoroforlann yanal koordinatları sentroidinin görüntü modunu kullanarak gösterilir ve ilişkili DCV süper çözünürlüklü görüntü Gauss görüntüleme modu kullanılarak gösterilir.
Şekil 2A benzer geniş açılı ve tPA-Dendra2 vitro ifade eden hipokampal nöron içinde sekiz gün soma ve proksimal süreçlerin PALM görüntüleri gösterir. Görüntülerin önemli özellikleri, geleneksel ve PALM görüntülerde puncta arasında (1) geniş, bire bir haberleşme ve örtüşme arasında, PALM puncta (2) önemli ölçüde daha küçük boyutlu ve (3) ara sıra çözünürlüğü Birden PALM puncta içine tek widefield punktum.
Şekil 2B, tPA-Dendra2 eksprese eden bir ikinci hipokampal nöronun bir işlemin bir kısmı boyunca DCVs bir PALM görüntüsünü gösterir. ÖnemliBu görüntünün özellikleri (1) küçük bir çapa ve homojen bir görünüm, puncta bölgesinin yakından kapatılan puncta / putatif DCV kümelerinin (2) kesintili bir gözlem içerir.
Şekil 3, iki veya daha fazla DCVs bir küme oluşturan yeterince yakın olmadığını belirleyen basit bir kantitatif bir yöntem özetliyor; Kümelenme yaygın olduğu sistemlerde, dağılım fonksiyonları göre daha gelişmiş yöntemler, miktar 21 için kullanılabilir. Basit bir yöntem DCV ayırma ve DCV genişliğini ölçmek için kullanılabilir (grafiklerde gösterildiği gibi) puncta yoğunlukları, hat profillerinin dayanmaktadır. Ayrılması önemli ölçüde (efsane tartışıldığı gibi) genişliğini aşarsa ayrılık yaklaşık genişlik olarak aynı ise, DCVs temas olabilir, oysa DCVs "temas" yok. Bu kritere dayanarak, Panel A DCVs "değil temas" olarak sınıflandırıldı Panel B'de bu con olarak sınıflandırıldı ise inceliğini. Bu yaklaşımı kullanarak, hipokampal nöronların gelişmekte extrasynaptic DCVs temas ilişkili kümelenme konusunda ~% 8 bir üst sınır koydu. Bizim DCV boyut ve küme verileri Tablo 1'de özetlenmiştir.
Şekil 1. Bir DCV (kırmızı) bir Gauss-render PALM görüntünün Yerleşimi ve DCV içerdiği bireysel photoconverted floroforlar (beyaz noktalar) koordinatlarını gösteren bir sentroid-ekran modu PALM görüntü. Eski modu ile Gauss fonksiyonları render florosforlar görüntüler kendi yerelleştirme kesinleşmemiş tarafından belirlenen genişlikleri ve (x, y) lokalize nokta olarak son görüntüler flüoroforlar / zirveleri koordinatları. Bar = 0.1 um.t = "_blank"> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2,. Yerleşimi toplanır Widefield (yeşil) ve tPA-Dendra2 eksprese eden bir geliştirme hipokampal nöronun soma ve proksimal süreçlerin PALM (kırmızı) görüntülerin (A). Örtüşme bölgeler sarı / turuncu bir görünür. TPA-Dendra2 eksprese eden başka bir hücre içinde bir işlemin bir alt bölgeyi astar DCVs PALM görüntüsü (B). Barlar = 5 ve 2 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3.. Bindirme ( Ilişkili PALM görüntü bu tek punctum'unu giderir ise şöyle özetledi Widefield (yeşil) ve PALM (kırmızı) tPA-Dendra2 ifade gelişmekte hipokampal nöron punktumlarda görüntüleri A ve B). Her iki panelde de, widefield görüntü, tek bir büyük punctum'unu gösterir İki çok dar puncta içine. Grafikler Panel A (sol grafik) ve panel B (sağ grafik) olarak puncta için elde benzer renk kodlu yoğunluk profilleri göstermektedir. , Puncta olduğunu ~ onların tepe-tepe aralığı% 40 yarı maksimal yoğunlukta tam genişliğe sahip bir gösteri panelinde PALM görüntüden elde edilen profiller Bu şekilde, bu iki puncta temas halinde değildir ve farazi bir küme olarak sınıflandırılmış değildi. Bunun aksine, puncta esasen tepe-tepe aralığı ile aynı yarı maksimal yoğunlukta tam bir genişliğe sahip panel B göstermek PALM görüntüden elde edilen profiller; Bu nedenle, bu varsayımsal bir küme olarak sınıflandırıldı. Bar = 0.2 um./ 51394fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
| Parametre | Sonuç | Analiz DCVs sayısı |
| Kümelenmiş DCVs Upper-bağlı | 7.9 ± 5.9% | 618 |
| DCV çapı demek | 77 ± 21 nm | 60 |
Tablo 1. AEOV boyutu ve küme veri özeti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM ve ilgili süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri son zamanlarda optik ve elektron mikroskopi (EM) 22-24 daha iyi yerleşmiş biçimlerine değerli bir tamamlayıcısı olarak ortaya çıkmıştır. PALM olumlu nitelikleri nispeten basit örnek hazırlama ve minimal örnek sarsımına içerir. İlke olarak, aynı zamanda oturma PALM hücreleri incelemek için kullanılabilir. Muhtemelen PALM temel olumsuz özelliği belirgin canlı hücreler daha hızlı dinamik süreçlerin çalışmalarını engellemektedir zaman alıcı veri toplama, olduğunu. Buna ek olarak, PALM nispeten yeni olduğunu ve bu nedenle uygun, sağlam flüoroforlar ve numune hazırlama ve veri toplama ve analiz için protokolleri tam olarak gelişmiş ve / veya 3 belgelenmiş değildir.
Burada sabit, kültür hücrelerinde kesecikler tek renk, PALM-temelli çalışmalar için uygun bir protokol tanımlanmıştır. Protokol da benzer şekilde geliştirilmesi için iyi bir başlangıç noktasıdıryönlendirilmiş, çift renkli PALM çalışmaları. Bizim protokol etkinliği bizim PALM verilerin iki temel nitelikleri tarafından desteklenmektedir. Birincisi, bizim yeniden PALM, ve tamamlayıcı Widefield, görüntülerde punktumlarda dağılımı çok benzer. Dağılımında önemli bir fark - PALM tarafından birden puncta içine kırınım-sınırlı punktumlarda arada çözünürlük - PALM belirgin gelişmiş çözünürlük yansıtır ve daha fazla tekniğin etkinliğini ve yarar altını çiziyor.
İkincisi, bizim PALM sonuçlar diğer ilgili sonuçları ile tutarlı iyi bir uyum içindedir, ve / veya. Örneğin, EM kullanılarak elde edilen hippokampal nöronların görsel DCVs zaman dilimleri boyunca ortaya ve dilim çıkarsanan DCV çap ~ 70-100 nm 11'dir. Bizim PALM veri ve EM veri arasındaki dikkat çekici anlaşma her iki yaklaşım için güven vericidir. PALM hala test ediliyor, ve EM genellikle gerekli sert numune hazırlama konusunda kaygılar tabidir. Benzer şekilde,DCVs hedefleyen yeşil ve kırmızı kuruntulardan coexpressing hipokampal nöronların yaşam kırınım-sınırlı filmler örtüşen, yeşil ve kırmızı puncta kalıcı comovement 25 tabi olduğunu göstermektedir. Bu sonucun en basit yorumu - kırmızı ve yeşil sinyaller aynı DCV kaynaklanan - kırınım-sınırlı puncta ezici bireysel DCVs temsil ettiğini gösterir PALM ile uyumludur. Comovement bir az basit yorumlama - kırmızı ve yeşil sinyaller kümelenmiş DCVs kaynaklanabilecek - büyük ölçüde PALM tarafından geçersiz.
Burada açıklanan protokol, diğer olumlu özellikleri vardır. (1) kesecikler photoconvertible veya fotoaktıfleştırılebılır floroforlar ile etiketlenmiş olması gerekir, ve (2) sabit hücreler iyi sulu ortamda monte edilmiştir: Özellikle, numune hazırlama, nispeten basit ve iki önemli istisna ile, geleneksel floresan mikroskopi için bu uygun oldukça benzer. Bu göreceli Simplicity deneyler kısa ve böylece numuneler 26 zor olabilir ki, (sürüklenme düzeltme kolaylaştırmak için) referans boncuklar ile etiketlenmiş olması gerekmez gerçeğini yansıtmaktadır. Buna ek olarak, veziküller genellikle birçok floroforlar ile etiketlenmiş; Bu şekilde, yeterli bir florofor işaretleme yoğunluğu elde basittir. Buna karşılık, diğer yapılar için, bu 3 oldukça zor olabilir. Görüntü edinimi de oldukça basittir. Ancak, PALM PALM sinyaller özünde çok zayıf çünkü pahalı ve ileri elektronik ve optik bileşenleri gerektirir.
Muhtemelen en gelişmiş işleme, analiz ve PALM görüntülerin ekranın etrafında PALM merkezi yönleri. Burada vurgulandığı gibi, PALM bu yönlerini uygulanması çözünürlük ve yerelleştirme hassasiyet arasında örnekleme çözünürlük arasındaki ilişki ve ayrım dahil olmak üzere birçok ince konularda bir anlayış gerektirir. Bu nedenle, genel olarak, s PALMtudies her zaman oldukça karmaşık, ama bu önemli olması muhtemeldir çözünürlük iyileştirmesi dengelenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, (BAS) 2 R15 GM061539-02 hibe (JEL) 2. R15 NS40425-03, MH 66179 (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi / OHSU Dr Gary Banker) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve P30 edildi NS061800 (OHSU Dr Sue Aicher için). Biz hipokampalinden kültürü ile geniş destek için Barbara Smoody teşekkür ve Dr. Bu yazının bir eleştirel okuma Brian Uzun ve James Abney.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
