Summary
Vi beskriver hvordan implementere photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)-baserte studier av vesikler i anleggs, dyrkede nerveceller. Viktige deler av vår protokoll inkluderer merking vesikler med photoconvertible chimeras, samle spredte innsamlede råbilder med en super-oppløsning mikros system, og behandlingen de rå bildene for å produsere en super-oppløsning.
Abstract
Påvisning av fluorescens gir grunnlag for mange allment utnyttet og raskt fremme mikroskopi teknikker ansatt i moderne biologisk og medisinsk bruk. Sterke av fluorescens inkludere sin sensitivitet, spesifisitet, og kompatibilitet med levende avbildning. Dessverre, konvensjonelle former for fluorescens mikros lider av en stor svakhet, diffraksjon begrenset oppløsning i bildeplanet, noe som vanskeliggjør studier av strukturer med dimensjoner mindre enn ~ 250 nm. Nylig har denne begrensningen blitt overvunnet med innføringen av super-oppløsning fluorescens mikroskopi teknikker, for eksempel photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). I motsetning til sine konvensjonelle kolleger, kan PALM produsere bilder med en lateral oppløsning på titalls nanometer. Det er således nå mulig å bruke fluorescens, med sine utallige styrke, for å belyse et spektrum av tidligere utilgjengelige attributter av cellulær struktur og organisering.
_content "> Dessverre er PALM ikke trivielt å implementere, og vellykkede strategier ofte må tilpasses den type system som studeres. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan implementere ensfargede PALM studier av vesikulær strukturer i faste, dyrkede nerveceller. PALM er ideell til studiet av blemmer, som har dimensjoner som vanligvis spenner fra ~ 50-250 nm. Viktige skritt i vår tilnærming inkluderer merking nevroner med photoconvertible (grønn til rød) chimeras av vesikkel last, samle spredte innsamlede rå bilder med en super-oppløsning mikros system, og behandling av RAW-bilder for å produsere en høy oppløsning PALM image. Vi har også demonstrere effekten av vår tilnærming ved å presentere eksepsjonelt godt oppløste bilder av tett-core vesikler (DCVs) i dyrkede hippocampus nevroner, noe som gjendrive hypotesen om at extrasynaptic smugling av DCVs medieres hovedsakelig av DCV klynger.Introduction
En rekke cellulære prosesser avhenger av nøyaktig og effektiv vesikkel-mediert smugling av biomolekyler til bestemte subcellulære destinasjonene. En fremtredende eksempel er synaptic forsamlingen, som innledes med lang rekkevidde, vesikkel-mediert levering av synaptiske bestanddeler fra områder av biogenesis i nevronale soma til potensielt distal pre-og postsynaptiske områder en.
Fluorescens mikroskopi er en kraftfull og populær metode for å studere vesikkel menneskehandel. Sterke av teknikken inkludere sin sensitivitet, spesifisitet, og kompatibilitet med levende avbildning to. Dessverre, inntil ganske nylig, har teknikken lidd av en vesentlig svakhet, diffraksjon-begrenset oppløsning 2, som vanskeliggjør undersøkelser av strukturer med dimensjoner som er mindre enn ~ 250 nm. Nylig, lateral oppløsning i fluorescens mikrosgått diffraksjon barriere med innføringen av super-oppløsning fluorescens microscopy teknikker, for eksempel PALM tre. Den lateral oppløsning på PALM, titalls nanometer, er ideell til studiet av blemmer, som har dimensjoner som vanligvis spenner fra ~ 50-250 nm fire. Det er derfor nå mulig å bruke fluorescens, med sine utallige styrker, for å belyse et spekter av tidligere utilgjengelige attributter av vesikler, inkludert noen aspekter av deres menneskehandel til bestemte subcellulære nettsteder.
PALM er ikke trivielt å implementere, og vellykkede strategier ofte må tilpasses den type system som studeres. Her beskriver vi hvordan du implementerer PALM studier av vesikulær strukturer, og vi demonstrere effekten av vår tilnærming for tilfelle av DCVs i hippocampus nevroner. Spesielt bruker vi PALM å ta hypotesen om at smugling av DCVs til synapser i hippocampus nevroner er mediert av DCV klynger 5-8.
Cluster-mediert smugling av vesikler til synapser i utviklings neurons er en spennende mulighet, fordi det kan bidra til raske synaptiske stabilisering og montering 9,10. Tilhengere av klynget smugling av DCVs sitere den tilsynelatende store størrelsen på extrasynaptic fluorescerende puncta husing eksogene DCV last som bevis som støtter clustering seks. Men disse puncta vises i bilder generert ved hjelp av diffraksjon begrenset fluorescens mikroskopi teknikker, som ikke er egnet til å skille størrelseseffekter som følge av diffraksjon fra dem som skyldes clustering.
For å løse dette problemet, vi samlet konvensjonell widefield fluorescens og PALM bilder av hippocampus nevroner uttrykker chimeras målrettet mot DCVs. Analyse av disse bildene viste at> 92% av antatte extrasynaptic DCV klynger i konvensjonelle bildene er løst som 80 nm (individuell DCV-sized) 11 puncta i PALM bilder. Dermed disse dataene i stor grad oppheve clustering hypotese som gjaldt DCVs i å utvikle hippocampal nevroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Prøvepreparering
- Forbered DNA som koder for en photoconvertible eller photoactivatable chimera rettet mot DCVs, ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker.
Merk: En mulighet er DNA som koder for et vevs-plasminogenaktivator-Dendra2 chimera (tPA-Dendra2). Dendra2 er en photoconvertible protein som skifter fra grønn til rød emisjon ved eksponering for ultrafiolett lys 12.. - Kultur hippocampus nevroner på høy ytelse # 1,5 dekselet glipper for ~ 5-10 dager, etter standardprotokoller 13.
- Transfektere utvikle hippocampus nevroner bruker en kationiske lipid reagens.
Merk: Viral-mediert infeksjon er mer effektivt for modne nevroner. Denne alternative metode er blitt beskrevet i detalj et annet sted 14.- Tilbered en 1,5 ml rør inneholdende ~ 1 pg av DNA og 250 pl av minimalt essensielt medium (MEM), og et andre 1,5 ml rør inneholdende 4 ul av det kationiske lipid-reagens og 250 ulav MEM.
- Inkuber løsninger for 5 min.
- Kombiner de to oppløsninger, og inkubere den resulterende blanding i ytterligere 30 min.
- I løpet av inkubasjonen, forberede en skål som inneholder flere ml av kulturmedium oppvarmet til 37 ° C.
- Forsiktig overføre dekkglass som inneholder nerveceller til parabolen inneholder varm medium og tilsett transfeksjon blanding.
- Vipp fatet forsiktig og legg den i en inkubator ved 37 ° C i 90 min.
- Returner nevroner til deres "hjem fatet" og vent ~ 12-18 hr.
- Fiks celler for 45 min i 4% paraformaldehyd / 4% sukrose i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4), oppvarmet til 37 ° C.
Merk: I PALM eksperimenter, er det viktig å oppnå en god bevaring av ultrastruktur, og standardformaldehydfiksering protokollene som brukes for immunfluorescens farging vanligvis ikke er tilstrekkelig 15. En viktig årsak til dårlig strukturelle bevaring er utilstrekkelig fixation tid fordi formaldehydfiksering innebærer addukt-dannelse og proteintverrbinding, og den sistnevnte prosessen er ganske langsom 16.. En 45 min fiksering bidrar til å redusere dette problemet uten påvisbare overfixation-indusert tap av fluorescens. - Vask dekselet slips ~ 10x med filtrert PBS.
Merk: Dette reduserer fluorescerende forurensninger. Bildeeksempler relativt raskt etter fiksering. I mellomtiden lagre celler ved 4 ° C i filtrert PBS i en lystett container. - Mount dekkglass som inneholder nevroner i et kammer i filtrert PBS.
Merk: Prøven må være montert i et vandig medium, slik som PBS, med brytningsindeks lavere enn den til glass, for å gjennomføre total intern refleksjon fluorescens (TIRF)-baserte belysnings. TIRF-baserte belysnings er meget nyttig fordi bare dekkglass-proksimale fluoroforer er spent, og det er et stort fall i forbindelse bakgrunnsfluorescens 17..
2. Image Acquisition </ P>
- Slå på super-oppløsning imaging system.
- Slå på buelampe.
- Flip "systemet / pc" og "komponent" brytere (på strømfjernbryteren) til "på".
- Slå på datamaskinen (etter mikroskopet kontroll tablett / docking stasjon kommer på).
Merk: Dockingstasjonen kan brukes til å kontrollere og overvåke mange attributter av optikk og lysbanen, spesielt valg av objektiv og fokus. - Dobbeltklikk på programvareikonet og velg "start-system" i dialogboksen for pålogging.
- Undersøke prøven.
- Åpner front og topp tilgangspaneler på laser sikkerhetskabinett.
- Vipp overført lys arm for å få tilgang til scenen og målsettinger.
- Sett olje på alpha Plan-Apochromat 100X numerisk aperture / NA = 1,46 (TIRF) objektiv.
Merk: En 63X høy-NA målet kan brukes i stedet for 100X. - Monter prøven på scenen, og heve the målet mot prøven.
- Overvåk linsen posisjon ved hjelp av XYZ funksjon av dokkingstasjon. Stopp når objektivet er i ballpark av fokus (f.eks z ~ 2,50 mm).
- Fullt lukke tilgangspaneler.
Merk: For å engasjere laseren sikkerhet. - Finjustere fokus ved hjelp okulars og knapper i lokal kategorien.
Merk: finne fanen gir tilgang til knapper som produserer arc lampe-basert belysning og muliggjør direkte observasjon av prøven med okulars. Tilsvarende kategorien Oppkjøpet gir tilgang til verktøy som produserer laserbasert belysning og forenkler bildeopptak av kameraet.- Gå til lokal fanen, velg "Trans On".
- Klikk på okulær utvidelse symbol.
Merk: Dette bringer opp en skjematisk av lysbanen. Attributter av lysbanen kan endres ved å venstreklikke aktuelle ikonene i skjematisk eller ved å bruke berøringsskjermen på dockingstasjonen. For eksempel kan et filterpassende for visning av utslipp fra Dendra2 kan velges ved hjelp av reflektoren revolver ikonet. - Se inn i okularene, og bringe cellene i fokus med docking stasjon som en guide.
Merk: Prøven vil være svært tynt befolket med fluorescerende celler fordi hippocampus nevroner er vanskelig å transfektere, og det kan derfor være litt vanskelig å fokusere ved hjelp av reflektert lys. Hvis dette er tilfelle, bruker overførte belysning og z lesning av dockingstasjonen som en guide. - Veksle lyset "Off" etter fokusering.
- Identifisere en celle som er ganske lyse, viser punctate fluorescens, og har en klassisk morfologi som er et tegn på god helse.
- Velg reflektert lys og filteret er hensiktsmessig for visning av grønn emisjon fra Dendra2.
- Skann dekkglass for celler som uttrykker Dendra2 chimeras ved hjelp av lav intensitet eksitasjon lys.
- Bytt til ACQuisition kategorien.
- Bruk "eksperiment manager" for å laste inn en PALM oppkjøpet konfigurasjon som er hensiktsmessig utformet eller lett modifisert.
Merk: Hvis ingen slike eksperiment eksisterer, utforme en start eksperimentell konfigurasjon ved hjelp av følgende innstillinger som guide: Laser kraft glidere: 405 nm (~ 0,01% for en 50 mW laser); 488 nm (~ 3% i en 100 mW laser); 561 nm (~ 40% ved en 100 mW laser); Eksponeringstid: ~ 50 ms; Kamera gevinst: ~ 200; Flerdimensjonal oppkjøpet: tidsserier (sykluser = 30 000, intervall = 0); Løyper: 488 nm med epi-belysning, og 561 nm med TIRF-basert belysning (se trinn 2.5.1); Mål: 100X (NA = 1,46); TIRF vinkel slider: forekomsten vinkel ~ 67-72 °; Pikselstørrelse: 100 nm; Synsfelt: TIRF (de alternative valgene gi høyere laser intensiteter og brukes til fluoroforene som er vanskeligere å bleke). - Klikk på "ja" når en pop up meny vises med en spørring om å bytte på lasere.
- Bruk "eksperiment manager" for å laste inn en PALM oppkjøpet konfigurasjon som er hensiktsmessig utformet eller lett modifisert.
- Ta bildetav cellen i fokus på kameraplanet.
- Velg den 488 nm epi-belysning laser spor.
Merk: Spor er bjelke konfigurasjoner som brukes under bildebehandling. Her blir spornavn bestemt ved eksitasjon bølgelengde som gir utslipp som sendes til kameraet. For eksempel bruker 561 nm spor både 405 og 561 nm laserlinjer, men filteret kube passerer bare utslipp fra photoconverted Dendra2 opphisset av 561 nm lys til kameraet. - Fokuser bildet av cellen på kameraet ved hjelp av "kontinuerlig" oppkjøpet knappen.
- Velg den 488 nm epi-belysning laser spor.
- Samle en konvensjonell Widefield bilde.
- Bruk "Snap"-knappen.
- Lagre bildet ved å gå til "Fil"-menyen og velge "lagre / lagre som".
- Sett opp TIRF-basert belysning.
- Velg 488 spor og bytte til "TIRF" ved hjelp av EPI / TIRF knappen.
- Velg "kontinuerlig" oppkjøpet.
- Juster than TIRF-basert belysning slider.
Merk: TIRF oppnås når det er en plutselig mørkere bakgrunn og prøven kan være fokusert på ett plan 18. Dersom nye funksjoner bli tydelig via fokusere seg inn i prøven, er for lav innfallsvinkelen fordi i TIRF det bare er en fokusplanet. - Dobbeltsjekk TIRF vinkel med 561 spor med 405 nm laser "av".
- Snu 405 nm laser tilbake "på" før du starter en PALM eksperiment.
- Samle PALM data.
- Hit "start eksperiment."
Merk: Dersom det er ønskelig, åpner du "online behandlingsalternativer"-fanen og sjekk "online prosessering PALM" og "Fit Gauss2D" (før du starter eksperimentet) for å overvåke rekonstruert PALM bildet under rå datainnsamling. Dette vil lette vurderingen av kvaliteten av dataene, og dermed verdien av å fortsette den relativt tidkrevende datainnsamling. - Visueltovervåke photoconversion.
- Øk intensiteten på 405 nm (photoconverting) laser når Dendra2 photoconversion avtar (vanligvis etter oppkjøpet av ~ 10 000 RAW-bilder).
- Fortsett eksperimentet hvis photoconversion øker. Ellers stoppe eksperimentet (uten tap av data) ved å trykke på "stopp" nåværende trinn knappen.
- Lagre bildene når datainnsamlingen er ferdig (etter ~ 15 min).
- Hit "start eksperiment."
Tre. Bildebehandling, Display, og analyse
- I fravær av online prosessering, prosess rå bilder som ble lagret på disken.
- Klikk på fanen behandling, åpne kategorien metode, og velg "PALM."
- Velg "PALM" igjen fra de fire suboptions.
- Gå til filmenyen, åpne og vise filen av interesse, og trykk "velg".
- Hit "gjelder."
Merk: Dette vil starte peak / fluoroforen funn og peak lokalisering med standard options. Hvis det er nødvendig, topper også kan grupperes ved hjelp av "PAL-Group"-kategorien. Gruppering tildeler topper som vises i flere påfølgende rammer til et enkelt molekyl hvis peak koordinater er tilstrekkelig like. I tillegg kan dataene bli korrigert for prøve drift ved hjelp av programvaren modellbasert drift innretting alternativ.
- Filtrere ut dårlig lokaliserte og dårlig samplet komponenter i peak-lokaliserte data.
- Kast fluoroforene med lokaliserings presiseringer, σ,> 35 nm ved hjelp av "PAL-Filter"-verktøyet.
- Kast fluoroforene i områder der gjennomsnittlig avstand mellom toppene, d, er for stor til å løse vesikler av diameter, D.
- Ekstraher den midlere lokaliseringspresisjon, σ, fra lokaliseringspresisjon histogram.
- Beregn en maksimal akseptabel verdi for d basert på σ, og Shannon-Nyquist kjennemerke 19, som er nedfelt i oppløsning tilnærming 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
- Sett terskelen i "Fjern PALM uteliggere" verktøy for å slette toppene omgitt av færre enn πD 2 / (4d 2) naboer innenfor en sirkel med radius D / 2.
- Konverter behandlet PALM data inn i en PALM bildeposisjonen med "PAL-Rendering"-verktøyet; se figur 1.
- Kvantifisere størrelser og separasjoner ved å velge "Profil"-funksjonen.
- Sjekk den tilhørende linjen og bord alternativer, og trekke en linje langs den ønskede retning i bildet.
- Kvantifisere diameter ved å bestemme fulle bredder på halv maksimal intensitet.
- Kvantifisere separasjoner ved å bestemme peak-to-peak avstander av belastningsprofiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en sluttproduktet av avbildning og behandling. I denne PALM image, er lateral koordinatene lokaliserte fluoroforene vist ved hjelp av Tyngdepunktet visningsmodus, og den super-oppløsning av forbundet DCV er vist ved hjelp av Gaussian visningsmodus.
Figur 2A viser analogt widefield og PALM bilder av soma og proksimale prosesser av åtte dager i vitro hippocampus nevron uttrykker tPA-Dendra2. Viktige funksjoner av bilder inkluderer (1) omfattende, en-til-en-forhold, og overlapping, mellom puncta i de konvensjonelle og PALM bilder (2) betydelig mindre størrelsen på PALM puncta, og (3) sporadisk oppløsning på en enkelt widefield Punctum inn flere PALM puncta.
Figur 2B viser en PALM bilde av DCVs langs en del av en prosess med en andre hippocampus nevron uttrykker tPA-Dendra2. Viktigfunksjonene i denne bilde inkluderer (1) liten diameter, og homogen utseende, av puncta, og (2) sjeldne observasjon av tett apposed puncta / antatte DCV klynger.
Figur 3 skisserer et enkelt kvantitativ metode for å avgjøre om to eller flere DCVs er nær nok til å omfatte en klynge; i systemer hvor clustering er utbredt, mer sofistikerte metoder, basert på fordelingsfunksjoner, kan anvendes for kvantifisering 21.. Den enkle metoden er basert på å generere linje profiler av puncta intensiteter (vist i grafene), som kan brukes til å kvantifisere DCV separasjon og DCV bredde. Hvis separasjon vesentlig overstiger bredde (som diskutert i legenden), de DCVs ikke "kontakt", mens hvis separasjon er omtrent det samme som bredden, kan de DCVs kontakt. Basert på dette kriteriet, ble de DCVs i Panel A klassifisert som "ikke kontakt", mens de i Panel B ble klassifisert som i con takt. Ved hjelp av denne tilnærmingen, satte vi en øvre grense for ~ 8% på kontakt-forbundet clustering av extrasynaptic DCVs i utviklings hippocampus nevroner. Vår DCV størrelse og cluster data er oppsummert i tabell 1..
Figur 1. Overlegg av en Gaussian-rendret PALM bilde av en DCV (rød) og en Tyngdepunktet-visningsmodus PALM bilde som viser koordinatene til individuelle photoconverted fluoroforene (hvite prikker) som finnes i DCV. Den tidligere modus viser fluoroforene ytet Gaussisk funksjoner med bredder bestemmes av deres lokaliserings presiseringer, og sistnevnte viser fluoroforer / topper som prikker lokaliserte på sin (x, y)-koordinater. Bar = 0,1 mikrometer.t = "_blank"> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Overlay (A) av summert widefield (grønn) og Palm (rød) bilder av soma og proksimale prosesser i en utvikling av hippocampus nevron uttrykker tPA-Dendra2. Regions of overlapping vises gul / oransje. PALM bilde (B) av DCVs langs en subregion av en prosess i en annen celle som uttrykker tPA-Dendra2. Barer = 5 og 2 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Overlegg ( A og B) av summert widefield (grønn) og PALM (rød) bilder av puncta i et utviklings hippocampus nevron uttrykker tPA-Dendra2. I begge paneler, viser widefield bildet en eneste stor Punctum, mens den tilhørende PALM bildet løser dette enkelt Punctum i to mye smalere puncta. Grafene viser analogt fargekodede belastningsprofiler innhentet for puncta i panel A (venstre graf) og i panel B (høyre graf). Profilene avledet fra PALM bildet i panel A viser at puncta har full bredde på halv maksimal intensitet som er ~ 40% av deres topp-til-topp avstand; Således er disse to puncta ikke er i kontakt og ikke ble klassifisert som en antatt klynge. I kontrast til de profiler utledet fra PALM bilde i panel B, viser at puncta har en full bredde ved halv maksimal intensitet som er hovedsakelig den samme som deres topp-til-topp avstand; således, disse ble klassifisert som en antatt klynge. Bar = 0,2 mikrometer./ 51394fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
| Parameter | Resultat | Antall DCVs analysert |
| Øvre-bundet på klynge DCVs | 7.9 ± 5.9% | 618 |
| Mean DCV diameter | 77 ± 21 nm | 60 |
Tabell 1. DCV størrelse og cluster data sammendrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM og relaterte super-oppløsning fluorescens mikroskopi teknikker har nylig dukket opp som et verdifullt supplement til bedre etablerte former for optisk mikroskopi og elektronmikroskopi (EM) 22-24. Positive attributter for PALM inkluderer relativt enkel prøveopparbeidelse og minimal prøve forstyrrelse. I prinsippet PALM også kan brukes til å studere levende celler. Sannsynligvis den viktigste negative egenskap av PALM er tidkrevende datainnsamling, som i betydelig grad vanskeliggjør studier av raskere dynamiske prosesser i levende celler. I tillegg er PALM relativt ny, og dermed egnet, robuste fluoroforene og protokoller for prøveopparbeidelse og for datainnsamling og analyse er ikke fullt utviklet og / eller dokumentert tre.
Her har vi beskrevet en protokoll som er egnet for ensfargede, Palm-baserte studier av vesikler i faste, dyrkede celler. Protokollen er også et godt utgangspunkt for utvikling av tilsvarenderettet, dual-farge PALM studier. Effekten av vår protokollen støttes av to viktige egenskaper av våre PALM data. Først, er fordelingen av puncta i vår rekonstruert PALM, og utfyllende widefield, bilder svært lik. Den ene signifikant forskjell i fordelingen - sporadisk oppløsning på diffraksjon begrenset puncta inn flere puncta etter PALM - reflekterer markant forbedret oppløsning på PALM og ytterligere understreker den teknikken sin effekt og nytte.
For det andre håndflaten vår resultatene er i god avtale, og / eller konsekvent, med andre relevante resultater. For eksempel bilder av hippocampus nevroner innhentet ved hjelp av EM tidvis avsløre skiver gjennom DCVs, og DCV diameter utledet fra skivene er ~ 70-100 nm 11. Den bemerkelsesverdige avtale mellom vår PALM data og EM data er betryggende for begge tilnærminger. PALM fortsatt er under utprøving, og EM er generelt utsatt for bekymringer om nødvendig harde prøveopparbeidelse. Likeledesdiffraksjon begrenset filmer av levende hippocampus nevroner coexpressing grønne og røde chimeras målrettet mot DCVs viser at overlapp grønne og røde puncta gjennomgå vedvarende comovement 25. Den enkleste tolkningen av dette resultatet - de røde og grønne signaler oppstår fra samme DCV - er i samsvar med PALM, noe som viser at diffraksjon begrenset puncta overveldende representere individuelle DCVs. En mindre grei tolkning av comovement - de røde og grønne signaler oppstår fra grupperte DCVs - er i stor grad brutt av PALM.
Protokollen er beskrevet her har andre positive egenskaper. Spesielt er prøvepreparering relativt enkel og ganske lik den som er egnet for konvensjonelle fluorescens-mikroskopi, med to viktige unntak: (1) vesiklene må være merket med photoconvertible eller photoactivatable fluoroforer, og (2) faste celler er best montert i vandige media. Denne relative Simplicity gjenspeiler det faktum at forsøkene er korte, og dermed prøvene ikke behøver å være merket med fiducial kuler (for å lette glidningen korreksjon), noe som kan være vanskelig 26. I tillegg vesikler vanligvis er merket med mange fluoroforer; dermed oppnå tilstrekkelig fluoroforen merking tetthet er grei. I motsetning til andre strukturer, kan det være ganske vanskelig 3.. Image oppkjøpet er også relativt grei. Men gjør PALM krever elektroniske og optiske komponenter som er dyre og cutting-edge fordi PALM signaler er egentlig veldig svak.
Sannsynligvis den mest sofistikerte sidene ved PALM sentrum rundt behandling, analyse og visning av PALM bilder. Som fremhevet her, implementere disse aspektene av PALM krever en forståelse av flere subtile spørsmål, herunder forholdet mellom prøvetaking og oppløsning, og skillet mellom oppløsning og lokalisering presisjon. Dermed samlet, PALM studies alltid er ganske intrikat, men dette balanseres ved oppløsning ekstrautstyr som sannsynligvis vil være betydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir to R15 GM061539-02 (til BAS), 2 R15 NS40425-03 (til JEL), MH 66179 (til Dr. Gary Banker of Oregon Health & Science University / OHSU), og P30 NS061800 (til Dr. Sue Aicher av OHSU). Vi takker Barbara Smoody for omfattende støtte med kulturen i hippocampus nevroner, og legene. Brian Long and James Abney for en kritisk lesning av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
