Summary
Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.
Abstract
A detecção de fluorescência fornece a base para muitas técnicas de microscopia amplamente utilizados e rápido avanço empregados em aplicações biológicas e médicas modernas. Forças de fluorescência incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo. Infelizmente, as formas convencionais de microscopia de fluorescência sofrem de uma grande fraqueza, a resolução de difração limitada no plano de imagem, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, essa limitação foi superada com a introdução de técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, como a microscopia localização fotoativados (PALM). Ao contrário de suas contrapartes convencionais, PALM pode produzir imagens com uma resolução lateral de dezenas de nanômetros. É, portanto, agora possível a utilização de fluorescência, com os seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis da estrutura celular e organização.
_content "> Infelizmente, PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Neste artigo, vamos mostrar como implementar estudos PALM uma única cor de estruturas vesiculares, em neurônios cultivados fixos. PALM é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm. As principais etapas da nossa abordagem incluem a rotulagem de neurônios com photoconvertible (verde para vermelho) quimeras de carga vesícula, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia super-resolução e processamento de imagens RAW para produzir imagem PALM de alta resolução. Nós também demonstrar a eficácia da nossa abordagem, apresentando imagens excepcionalmente bem-resolvidos de vesículas densa-core (DCVS) em neurônios do hipocampo em cultura, que refutam a hipótese de que o tráfico de DCV são extrasynaptic é mediado em grande parte por grupos DCV.Introduction
Um número de processos celulares dependem de tráfico de vesículas mediada preciso e eficiente de biomoléculas a destinos específicos subcelulares. Um exemplo proeminente é a montagem sináptica, que é precedida de longo alcance, a entrega mediada por vesículas sinápticas de eleitores a partir de sites de biogênese na soma neuronal para pré e pós-sinápticos locais potencialmente distais 1.
A microscopia de fluorescência é um método poderoso e popular de estudar tráfico vesícula. Pontos fortes da técnica incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo 2. Infelizmente, até há relativamente pouco tempo, a técnica tem sofrido com uma grande fraqueza, resolução de difração limitada 2, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, a resolução lateral em microscopia de fluorescência ultrapassou a barreira de difração com a introdução de super-resolução mi de fluorescênciatécnicas croscopy, como PALM 3. A resolução lateral do PALM, dezenas de nanômetros, é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm 4. Assim, é agora possível a utilização de fluorescência, com seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis de vesículas, incluindo alguns aspectos de seu tráfico para sites subcelulares específicos.
PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Aqui nós descrevemos como implementar estudos palma da estruturas vesiculares, e demonstrar a eficácia da nossa abordagem para o caso de as DCV são em neurônios do hipocampo. Em particular, podemos usar PALM para tratar a hipótese de que o tráfico de DCV são de sinapses em neurónios do hipocampo é mediada por grupos DCV 5-8.
Tráfico mediada pelo Cluster de vesículas de sinapses no desenvolvimento de neurons é uma possibilidade intrigante, pois pode facilitar a rápida estabilização sináptica e montagem 9,10. Os defensores do tráfico em cluster do DCV são citar o grande tamanho aparente de puncta fluorescente extrasynaptic abrigar carga DCV exógena como provas agrupamento 6. No entanto, estes pontos lacrimais aparecem em imagens geradas utilizando técnicas de microscopia de fluorescência limitada de difração, que não são adequados para os efeitos do tamanho de distinção decorrentes da difracção dos que resultem do agrupamento.
Para resolver esse problema, foram coletadas fluorescência widefield convencional e imagens palma da neurônios que expressam quimeras direcionados para as DCV são. A análise destas imagens revelaram que> 92% dos clusters DCV extrasynaptic putativos em imagens convencionais são resolvidos como 80 nm (individual porte DCV-) 11 puncta em imagens de palma. Assim, estes dados largamente invalida a hipótese de agrupamento aplicado a DCV são no desenvolvimento hippocaMpal neurônios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Exemplo de Preparação
- Preparar ADN que codifica para uma quimera photoconvertible ou fotoactivável alvo para DCV são, utilizando-se técnicas de biologia molecular convencionais.
Nota: Uma possibilidade é o ADN que codifica um activador do plasminogénio tissular-Dendra2 quimera (tPA-Dendra2). Dendra2 é uma proteína photoconvertible que muda de verde para vermelho emissão após a exposição à luz ultravioleta 12. - Neurônios do hipocampo em cultura de alta performance # 1.5 tampa desliza para ~ 5-10 dias, seguindo protocolos padrão 13.
- Transfectar desenvolvimento neurónios do hipocampo utilizando um reagente lipídico catiónico.
Nota: A infecção viral mediada é mais eficaz para os neurónios maduros. Esta abordagem alternativa tem sido descrito em detalhe noutro local 14.- Preparar um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 1 ug de ADN e 250 ul de meio mínimo essencial (MEM) e um segundo tubo de 1,5 mL contendo 4 mL de reagente de lípido catiónico e 250 ulde MEM.
- Incubar as soluções durante 5 min.
- Combina-se as duas soluções e incuba-se a mistura resultante durante mais 30 min.
- Durante a incubação, preparar um prato contendo alguns mililitros de meio de cultura aquecido a 37 ° C.
- Gentilmente transferir lamínulas contendo neurônios para o prato contendo meio quente e adicione a mistura de transfecção.
- Incline o prato delicadamente e, em seguida, colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 90 min.
- Retornar neurônios ao seu "prato casa" e esperar ~ 12-18 horas.
- Fixar as células durante 45 minutos em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) aquecido a 37 ° C.
Nota: Em experimentos de palma, que é importante para conseguir uma boa preservação da ultra-estrutura, e os protocolos de fixação formaldeído padrão utilizados para imunofluorescência normalmente não são suficientes 15. Uma razão importante para a preservação estrutural pobres é insuficiente ftempo ixation porque fixação de formaldeído envolve a formação de aduto e reticulação de proteínas, e este último processo é bastante lento 16. A fixação de 45 min ajuda a mitigar este problema, sem perda induzida pela excessiva fixação detectável de fluorescência. - Cobertura Wash desliza ~ 10x com filtrada PBS.
Nota: Isto reduz contaminantes fluorescentes. Amostras de imagem de forma relativamente rápida após a fixação. Nas células de armazenagem intermédia a 4 ° C em PBS, filtrado em um recipiente à prova de luz. - Lamínulas montagem contendo neurônios em uma câmara em filtrada PBS.
Nota: A amostra tem de ser montado em um meio aquoso, tal como PBS, com índice de refracção mais baixo do que a do vidro, para implementar fluorescência total reflexão interna (TIRF) à base de iluminação. Iluminação baseadas em TIRF é muito útil porque apenas cobertura fluoróforos deslizamento proximal está animado, e há uma grande queda associada na fluorescência de fundo 17.
2. Aquisição de Imagem </ P>
- Ligue o sistema de imagem super-resolução.
- Ligue a lâmpada de arco.
- Virar o "sistema / pc" e interruptores "componentes" (no interruptor remoto de energia) para "on".
- Ligue o computador (após o posto de tablet / encaixe controle microscópio acende).
Nota: A estação de base pode ser usado para controlar e monitorar muitos atributos dos óptica e caminho da luz, nomeadamente escolha de objetivo e foco. - Clique duas vezes no ícone do software e escolha a opção "Sistema start" na caixa de diálogo de login.
- Examine a amostra.
- Abra a parte frontal e painéis de acesso no topo da cabine de segurança laser.
- Incline o braço de luz transmitida para acessar o palco e objetivos.
- Coloque óleo no alfa Plan-Apochromat 100X abertura numérica / NA = 1,46 (TIRF) objetiva.
Nota: A maior 63X NA objectivo pode ser utilizado em vez do 100X. - Monte a amostra no palco, e elevar ªe objetivo em direção à amostra.
- Monitorar a posição da lente usando a função XYZ da estação de ancoragem. Pare quando a lente está no estádio de foco (por exemplo, z ~ 2,50 milímetros).
- Totalmente fechar os painéis de acesso.
Nota: Para ativar a segurança do laser. - Afinar o foco usando as oculares e os botões na guia localizar.
Nota: A guia localizar fornece acesso aos botões que produzem iluminação baseados em lâmpada de arco e facilita a observação direta da amostra com as oculares. Da mesma forma, a guia aquisição fornece acesso a ferramentas que produzem iluminação a laser e facilita a captura da imagem pela câmera.- Vá até a aba localizar, escolha "Trans On".
- Clique no símbolo de expansão ocular.
Nota: Isso traz um esquema do caminho da luz. Atributos do caminho da luz pode ser alterada clicando esquerda ícones apropriados no esquema ou usando a tela sensível ao toque na docking station. Por exemplo, um filtroapropriada para visualização de emissão de Dendra2 pode ser escolhido usando o ícone refletor revólver. - Olhe pelas oculares, e trazer as células para o foco usando a estação de ancoragem como um guia.
Nota: A amostra será muito pouco povoada com células fluorescentes porque neurônios do hipocampo são difíceis de transfecção, e, portanto, pode ser um pouco complicado de se concentrar com uma iluminação refletida. Se este for o caso, usam iluminação transmitida e a leitura Z da estação de base como um guia. - Alterne a luz "Off" depois de focar.
- Identificar uma célula que é bastante brilhante, apresenta ponteada fluorescência, e tem uma morfologia clássico que é indicativo de uma boa saúde.
- Escolha a luz refletida eo filtro apropriado para a visualização de emissão verde Dendra2.
- Digitalize a lamínula para células expressando quimeras Dendra2 utilizando luz baixa excitação intensidade.
- Mude para o ACQguia uisition.
- Use o "gerente experimento" para carregar uma configuração de aquisição PALM que adequadamente concebido ou modificado facilmente.
Nota: Se tais experiências não existir, criar uma configuração experimental começar usando as seguintes configurações como um guia: sliders potência do laser: 405 nm (~ 0,01% para um laser mW 50); 488 nm (~ 3% de um laser de 100 mW); 561 nm (~ 40%, para um laser de 100 mW); Tempo de exposição: ~ 50 ms; Ganho Camera: ~ 200; Aquisição Multidimensional: séries temporais (ciclos = 30.000, interval = 0); Faixas: 488 nm com epi-iluminação, e 561 nm com iluminação baseada em TIRF (veja o passo 2.5.1); Objetivo: 100X (NA = 1,46); Deslizante ângulo TIRF: ângulo de incidência ~ 67-72 °; O tamanho do pixel: 100 nm; Campo de visão: TIRF (as escolhas alternativas produzir intensidades superiores a laser e são utilizados para fluoróforos que são mais difíceis de lixívia). - Clique em "sim" quando um menu pop-up aparece com uma consulta sobre a mudança em lasers.
- Use o "gerente experimento" para carregar uma configuração de aquisição PALM que adequadamente concebido ou modificado facilmente.
- Traga a imagemda célula para o foco no plano da câmara.
- Escolha a 488 nm epi-iluminação pista laser.
Nota: As faixas são configurações de feixe utilizados durante o exame. Aqui, os nomes das faixas são determinadas pelo comprimento de onda de excitação que produz a emissão que é passado para a câmara. Por exemplo, a faixa de 561 nm usa tanto o 405 e 561 linhas de laser nm, mas o cubo de filtro passa apenas emissão de photoconverted Dendra2 animado com 561 nm de luz para a câmera. - Foque a imagem da célula na câmara usando o botão de aquisição "contínuo".
- Escolha a 488 nm epi-iluminação pista laser.
- Coletar uma imagem de campo amplo convencional.
- Use o botão "Ajustar".
- Salve a imagem, indo para o menu "Arquivo" e escolha "Salvar / Salvar como."
- Configure a iluminação à base de TIRF.
- Escolha a faixa de 488 e mudar para "TIRF" utilizando o botão EPI / TIRF.
- Escolha aquisição "contínuo".
- Ajuste tele TIRF baseada iluminação slider.
Nota: TIRF é conseguido quando existe um escurecimento súbita de fundo E a amostra pode ser focada num plano 18. Se novas características tornam-se aparentes através focando-se na amostra, o ângulo de incidência é muito baixa, porque em TIRF existe apenas um plano de foco. - Duplo verificar o ângulo TIRF usando a faixa 561 com o laser de 405 nm "off".
- Ligue o laser de 405 nm de volta "on" antes de iniciar um experimento PALM.
- Coletar dados de palma.
- Hit "start experimento."
Nota: Se desejar, abra a aba "opções de processamento on-line" e marque "PALM linha de processamento" e "Fit Gauss2D" (antes do início do experimento) para monitorar a imagem PALM reconstruído durante a coleta de dados brutos. Isto irá facilitar a avaliação da qualidade dos dados e, consequentemente, o valor de continuar o processo de recolha de dados relativamente demorada. - Visualmentemonitorar fotoconversão.
- Aumente a intensidade do laser de 405 nm (photoconverting) quando diminui fotoconversão Dendra2 (normalmente após a aquisição de ~ 10.000 imagens RAW).
- Continue o experimento se fotoconversão aumenta. Caso contrário, parar o experimento (sem perda de dados) clicando no botão "stop" atual etapa.
- Salve as imagens quando a coleta de dados seja concluída (após ~ 15 min).
- Hit "start experimento."
3. Processamento de Imagem, Exibição e Análise
- Na ausência de tratamento, processar imagens RAW online que foram salvos em disco.
- Clique na aba processamento, abra a guia método, e selecione "PALM".
- Escolha "PALM" novamente a partir dos quatro sub-opções.
- Vá para o menu arquivo, abrir e visualizar o arquivo de interesse, e clique em "selecionar".
- Hit "aplicar".
Nota: Isto irá iniciar pico / constatação fluoróforo e pico localização com opti padrãoons. Se necessário, os picos também podem ser agrupados usando a guia "PAL-grupo". Agrupamento atribui picos que aparecem em várias estruturas consecutivas a uma única molécula, se as coordenadas de pico são suficientemente semelhantes. Além disso, os dados podem ser corrigidos para desvio de amostra usando opção de alinhamento deriva baseado no modelo do software.
- Filtre componentes mal localizada e mal incluídos na amostra os dados localizados de pico.
- Descarte fluoróforos com precisões de localização, σ,> 35 nm usando a função "PAL-Filter".
- Descarte fluoróforos em áreas onde a distância média entre os picos, d, é muito grande para resolver vesículas de diâmetro, D.
- Extraia a precisão média de localização, σ, a partir do histograma de precisão de localização.
- Calcule o valor máximo aceitável para d baseado em σ, ea Criterion Shannon-Nyquist 19, tal como consagrado na resolução aproximação 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2-D) 2] 1/2.
- Definir o limite do "Remover discrepantes PALM" ferramenta para eliminar picos cercados por menos de πD 2 / (4d 2) vizinhos dentro de um círculo de raio D / 2.
- Converta os dados PALM transformado em uma imagem PALM usando a função "PAL-Rendering"; veja a Figura 1.
- Quantificar os tamanhos e separações, escolhendo a função "Perfil".
- Verifique a linha de associado e opções de tabela, e desenhar uma linha ao longo da direção desejada na imagem.
- Quantificar diâmetros, determinando medida da largura à meia máxima intensidade.
- Quantificar separações determinando pico-a-pico espaçamentos de perfis de intensidade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 mostra um produto final de imagem e processamento. Nesta imagem PALM, coordenadas laterais fluorophores localizados são mostrados usando o modo de exibição centróide, ea imagem de super-resolução da DCV associado é mostrado usando o modo de exibição de Gauss.
Figura 2A mostra widefield análogo e imagens palma da soma e processos proximais de oito dias em neurônio hipocampo vitro expressando tPA-Dendra2. Características importantes das imagens incluem o (1) extensa, one-to-one correspondência, e se sobrepõem, entre puncta nas imagens convencionais e de palma, (2) tamanho significativamente menor do puncta PALM, e (3) ocasional resolução de um único punctum widefield em vários puncta PALM.
A Figura 2B mostra uma imagem PALM de DCV são ao longo de parte de um processo de um segundo neurônio hipocampo expressar tPA-Dendra2. Importantecaracterísticas desta imagem incluem o diâmetro (1) pequeno e aparência homogênea, do puncta, e (2) a observação frequente de puncta / agrupamentos DCV putativos intimamente apostos.
A Figura 3 descreve um método quantitativo simples de determinar se duas ou mais as DCV são estão perto o suficiente para compor um cluster; em sistemas em que o agrupamento é predominante, os métodos mais sofisticados, baseados em funções de distribuição, pode ser utilizada para a quantificação 21. O método simples baseia-se na geração de perfis de linha de intensidades puncta (mostradas nos gráficos), que podem ser utilizados para quantificar a separação DCV e largura DCV. Se a separação for superior a largura significativamente (como discutido na legenda), as DCV são não fazer "contato", enquanto que, se a separação é aproximadamente a mesma largura, as DCV são pode entrar em contato. Com base neste critério, as DCV são em painel A foram classificados como "sem contato", enquanto aqueles no Painel B foram classificadas como em con tato. Usando essa abordagem, vamos colocar um limite superior de ~ 8% no agrupamento associada ao contato de DCV são extrasynaptic no desenvolvimento de neurônios do hipocampo. Nosso tamanho DCV e dados de fragmentação estão resumidos na Tabela 1.
Figura 1. Sobreposição de uma imagem PALM Gaussian-renderizados de DCV (vermelho) e uma imagem PALM modo centróide-display mostrando coordenadas de fluoróforos photoconverted individuais (pontos brancos) contidos no DCV. O modo antigo exibe fluorophores prestados às funções de Gauss com larguras determinadas por suas precisões de localização, e este último apresenta fluoróforos / picos como pontos localizados em sua (x, y) as coordenadas. Barra = 0,1 um.t = "_blank"> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Overlay (A) de widefield somados (verde) e Palm (vermelho) imagens da soma e processos proximais de um neurônio do hipocampo em desenvolvimento expressando tPA-Dendra2. Regiões de sobreposição aparecem amarelo / laranja. Imagem PALM (B) de DCV são revestem uma sub-região de um processo de outra célula expressando tPA-Dendra2. Barras = 5 e 2 mM. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Sobreposições ( A e B) de widefield somados (verde) e PALM (vermelho) imagens de puncta em um neurônio do hipocampo em desenvolvimento expressando tPA-Dendra2. Em ambos os painéis, a imagem mostra um campo amplo único grande punctum, ao passo que a imagem associada PALM resolve este único punctum em duas puncta muito mais estreitos. Os gráficos mostram perfis de intensidade de forma análoga codificados por cor obtidos para o ponto lacrimal no painel A (gráfico da esquerda) e no painel B (gráfico da direita). Os perfis obtidos a partir da imagem PALM no painel A mostram que a puncta ter uma largura total a meia intensidade máxima que é de aproximadamente 40% do seu espaçamento pico-a-pico; assim, estes dois pontos lacrimais não estão em contacto e não foram classificados como um grupo putativo. Em contraste, os perfis obtidos a partir da imagem de palma no painel B mostra que o ponto lacrimal têm uma largura total a meia intensidade máxima que é essencialmente o mesmo que o espaçamento de pico-a-pico; assim, estes foram classificados como um grupo putativo. Barra = 0,2 um./ 51394fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
| Parâmetro | Resultado | Número de DCV são analisados |
| Limite superior sobre as DCV são agrupados | 7,9 ± 5,9% | 618 |
| DCV diâmetro médio | 77 ± 21 nm | 60 |
Tamanho da tabela 1. DCV e aglomerado resumo de dados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM e técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução relacionados surgiram recentemente como um complemento valioso para as formas mais bem estabelecidos da microscopia óptica e microscopia eletrônica (EM) 22-24. Atributos positivos da PALM incluem a preparação da amostra relativamente simples e mínima perturbação da amostra. Em princípio, PALM também pode ser usado para estudar as células vivas. Provavelmente, o principal atributo negativo da Palm é a aquisição de dados demorada, o que dificulta significativamente estudos de processos dinâmicos mais rápida em células vivas. Além disso, PALM é relativamente novo, e, assim, apropriados, fluoróforos e protocolos para a preparação de amostras e para aquisição e análise de dados robustos não estão totalmente desenvolvidos e / ou documentado 3.
Aqui nós descrevemos um protocolo que é adequado para uma única cor, estudos baseados em palma de vesículas em células fixas, de cultura. O protocolo também é um bom ponto de partida para o desenvolvimento da mesma formadirigidos, estudos PALM dual-cores. A eficácia do nosso protocolo é suportado por dois atributos-chave de nossos dados Palm. Em primeiro lugar, a distribuição dos pontos lacrimais na nossa PALM reconstruído, e widefield complementar, imagens é muito semelhante. A única diferença significativa na distribuição - ocasional resolução de puncta de difração limitada em vários puncta por PALM - reflete o realçada resolução de PALM e ainda ressalta a eficácia ea utilidade da técnica.
Em segundo lugar, nossos resultados PALM estão em bom acordo, e / ou consistente, com outros resultados relevantes. Por exemplo, imagens de neurónios do hipocampo obtidos utilizando EM ocasionalmente revelar fatias através de DCV são, e o diâmetro DCV deduzido a partir das fatias é de aproximadamente 70-100 nm, 11. O acordo notável entre nossos dados e os dados PALM EM é reconfortante para ambas as abordagens. PALM ainda está sendo testado, e EM geralmente está sujeito a preocupações sobre a preparação necessária amostra dura. Da mesma forma,filmes limitada de difração de viver neurônios do hipocampo co-expressam quimeras verde e vermelho alvo para as DCV são sobrepostos mostram que puncta verde e vermelho sofrer comovimento persistente 25. A interpretação mais simples deste resultado - os sinais vermelho e verde surgem a partir do mesmo DCV - é consistente com a palma da mão, o que demonstra que puncta de difração limitada representam esmagadoramente as DCV são individuais. Uma interpretação menos direta de co-movimento - os sinais vermelho e verde surgem as DCV são agrupados - é em grande parte invalidada por PALM.
O protocolo aqui descrito tem outras características positivas. Em particular, a preparação da amostra é relativamente simples e bastante semelhante ao adequado para a microscopia de fluorescência convencional, com duas notáveis exceções: (1) vesículas devem ser marcadas com fluoróforos photoconvertible ou fotoactiváveis, e (2) células fixas são mais bem montados em meio aquoso. Este simplici relativaty reflecte o facto de que as experiências são curtas, e, assim, as amostras não precisa de ser marcada com grânulos fiduciais (para facilitar a correcção de desvio), o que pode ser complicado 26. Além disso, as vesículas são normalmente marcados com diversos fluoróforos; assim, alcançar densidade adequada rotulagem fluoróforo é simples. Em contraste, outras estruturas, o que pode ser bastante difícil 3. A aquisição de imagens também é relativamente simples. No entanto, PALM exige componentes eletrônicos e ópticos, que são caros e de vanguarda, pois os sinais da Palm são intrinsecamente muito fraco.
Provavelmente os aspectos mais sofisticados de centro PALM em todo o processamento, análise e visualização de imagens de palma. Conforme destacado aqui, implementar estes aspectos da PALM requer uma compreensão de várias questões sutis, incluindo a relação entre a amostragem ea resolução, ea distinção entre a resolução e precisão de localização. Assim, em geral, PALM sSTUDOS invariavelmente são bastante complicado, mas isso é compensado pelo aprimoramento de resolução que é provável que seja significativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (para JEL), MH 66179 (com o Dr. Gary Banker da Oregon Health & Science University / OHSU) e P30 NS061800 (o Dr. Sue Aicher de OHSU). Agradecemos Barbara Smoody para amplo suporte com a cultura de neurônios do hipocampo, e as Dras. Brian Long e James Abney para uma leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
