Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Immunhistokemiske og Calcium Imaging Methods in whole- mount rotteretina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Immunhistokemi protokoller anvendt til at undersøge lokalisering af et specifikt protein i nethinden. Calcium billeddiagnostiske teknikker er ansat til at studere calcium dynamik i retina-ganglieceller og deres axoner.

Abstract

I denne artikel beskriver vi de redskaber, reagenser og de praktiske skridt, der er nødvendige for: 1) vellykket forberedelse af whole- mount nethinder for immunhistokemi og 2) calcium billeddannelse til undersøgelse af spænding gated calcium kanal (VGCC) medieret calcium signalering i retina ganglieceller. Calcium imaging metode beskriver vi omgår spørgsmål vedrørende ikke-specifik belastning af fordrevne amacrine celler i ganglion cellelag.

Introduction

Retina-ganglieceller (rGCS) udtrykker L-, N-, P / Q og T-typen VGCC som bestemt ved farmakologisk blokade af disse bestanddele af helcelle Ca kanalisere nuværende 1,2. VGCC er transmembrane multimere proteiner, der er involveret i transmitterfrigivelse, gentranskription, celle regulering og synaptisk plasticitet 3,4,5. Funktionelle VGCCs består af mindst tre særskilte klasser af underenheder: store, transmembrane α 1 poredannende underenheder, der etablerer kanalens biofysiske og farmakologiske egenskaber, primært ekstracellulære ekstra α 2 δ underenheder og intracellulære β underenheder. De to sidstnævnte formular heteromerkomplekser med forskellige α 1 underenheder og ændre gating kinetik og menneskehandel af kanalerne til plasmamembranen 6.

I de seneste årtier har mange teknikker blevet anvendt til at studere protein EXPREssion, såsom immunhistokemi, enzymkoblet immunosorbent-assay, western-analyse og flow-cytometri. Disse teknikker kræver anvendelse af specifikke antistoffer til påvisning af et givet protein af interesse og giver stærke værktøjer til lokalisering og fordeling af specifikke proteiner i forskellige væv. Teknikker, der anvendes til at påvise og kvantificere mRNA-ekspressionsniveauer af et bestemt protein, såsom Northern blot-analyse af RT-PCR, kvantitativ reel-tid RT-PCR, in situ-hybridisering, cDNA microarrays og ribonuklease beskyttelse assay tilvejebringe en alternativ fremgangsmåde, når antistoffer er ikke let til rådighed, eller hvis ekspressionsniveauer af et bestemt protein er lavt 7. Men en begrænsning i anvendelsen af ​​sådanne molekylære teknikker er den krævede identifikation af gensekvensen.

For at lokalisere proteiner i nethinden, kan immunhistokemi udføres på whole- mount nethinder. På grund af tilgængeligheden af ​​de rGCS, den whole- mountforberedelse giver en fremragende platform til at studere lokalisering af specifikke proteiner til RGC somata og deres axoner.

Ud over deres lokalisering kan visse funktionelle egenskaber VGCCs i rGCS påvises ved anvendelse af calcium billeddannende teknikker. Vi beskriver en calcium imaging protokol til selektivt at mærke rGCS med en calcium indikatorfarvestof til måling af intracellulær calcium dynamik. Bidraget af forskellige VGCCs til calcium signal i forskellige cellulære rum kan isoleres ved anvendelse af undertype-specifikke Ca-kanalblokkere.

Måske en af ​​de mest fordelagtige aspekter af calcium imaging her beskrevne teknik, er evnen til samtidigt og uafhængigt optage fra flere rGCS og deres axoner. Selvom mange fysiologiske teknikker, såsom hel celle patch clamp optagelse, giver høj tidslig optagelser Resolution af membranstrømme, det somatiske eller axonal kilde THESe strømme optaget, ikke kan diskrimineres og optagelser kan kun foretages fra en enkelt neuron ad gangen. Multielectrode arrays (MEA) er i stand til samtidigt at optage pigge fra mange celler, men kan hverken opdage eller diskriminere aktivering af for eksempel forskellige undertyper af calciumkanalerne. MEA fortrinsvis optage fra celler, der er placeret i umiddelbar nærhed af en given elektrode 8 og optage fra celler, der frembringer store pigge 9. Optiske billeddiagnostiske metoder giver en alternativ strategi, hvormed de samtidige og uafhængige optagelser af hele populationer af celler, der kan integreres med oplysningerne fra enkelt celle mikroelektrode og patch clamp optagelse og MEA optagelse. Selvom calcium billeddiagnostiske teknikker er beskrevet her var ansat til at studere calcium dynamik rGCS kan patch clamp og multilaterale miljøaftaler også anvendes parallelt med yderligere at belyse de ioniske strømme og standardtilsætningsforsøg egenskaber rGCS.

10, var vores mål at bruge en belastning teknik, der selektivt mærker rGCS med en syntetisk calcium indikatorfarvestof i en whole- mount præparat. Selv syntetiske calcium indikatorfarvestoffer giver en fremragende platform for studiet af intracellulære calcium dynamik, har den udbredte anvendelse blevet hæmmet af den manglende evne til effektivt at indlæse specifikke populationer af neuroner inden for et givet netværk. Mange teknikker såsom isætning 11 og elektroporation 8,12 er blevet udført for at indlæse hele populationer af celler imidlertid sådanne teknikker ikke diskriminerer mellem specifikke celletyper. Genetisk kodet calcium indikatorer giver evnen til selektivt at mærke specifikke populationer af celler imidlertid sådanne metoder kræver frembringelsen af transgene dyr 13. Vor teknik beskriver en method til selektivt at mærke rGCS i whole- mount forberedelse via synsnerven stub injektion af en calcium indikatorfarvestof.

Taget sammen, de strukturelle og fysiologiske teknikker beskrevet i denne artikel giver en platform for at studere lokalisering og bidrag VGCCs til calcium signal i rGCS og deres axoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for velfærd forsøgsdyr udstedt af US Public Health Service Politik om Human Care og brugen af ​​forsøgsdyr og udvalg Animal Forskning University of California-Los Angeles (UCLA). Mandlige og kvindelige voksne Sprague-Dawley rotter (Charles River Lab, Wilmington, MA) i alderen 3-5 uger blev anvendt.

1. Animalske og Tissue Forberedelse til whole- mount nethinden og Immunohistokemi protokol

  1. Forbered følgende materialer og redskaber: et dissektionsmikroskop, 2 pincet med meget fine tips, saks, cellulosefilterpapir, plast pipette og et objektglas.
  2. Aflive rotte i et lukket kammer ved dybt bedøve dyret med 1-3% isofluran efterfulgt af halshugning med en guillotine. Fjern øjnene med et par iris saks og sted i en petriskål indeholdende den ekstracellulære løsning. Dvale A, Ames Medium eller fysiologiske opløsninger anbefales.
  3. [Valgfrit trin, hvis der ønskes opfyldning af rGCS med Fluo-4]. Udfør Fluo-4 mærkning som beskrevet i trin 2,3-2,4.
  4. Brug dissektionsmikroskop (lysintensitet: 1.6 x 10 8 fotoner / mm 2 ⋅sec), fjern hornhinden ved at afskære den forreste del af øjeæblet. Fjern linsen og glaslegemet fra den indre nethinde overflade med en pincet. For at fjerne glaslegemet stabilisere øjeæblet ved at holde senehinden fast med én Forcep. Skræl forsigtigt glaslegemet bunden mod midten af ​​nethinden med den anden Forcep. Fremstillingen på dette tidspunkt kaldes okularet, som anvendes til kryosektioner. Flere detaljer om kryosektioner kan findes i referencer 14,15.
  5. Fjern nethinden fra øjestykket. Derefter lave fire snit til at tillade nethinden til at lægge fladt. Mount forsigtigt nethinden på et objektglas med fotoreceptorlaget op. Tilsæt en dråbe løsning på nethinden og sætte cellulose filterpapir på nethinden. Når nethinden tillægger filterpapir, placere nethinden tilbage i opløsning. Hvis det er nødvendigt, flade nethinden med en pensel eller en pincet.
  6. Placer wholemounted nethinder i 4% PFA i 10-15 min til fiksering.
  7. Vask wholemounted nethinder tre gange i 30 minutter i 0,1 M phosphatpuffer (PB), pH 7,4. Bloker nethinder med 5% normalt gedeserum eller æsel serum i 0,1 PB indeholdende 0,3% Triton-X 100 og 0,1% NaN3 ved 4 ° C natten over. Vi anbefaler et slutvolumen på 500 pi for alle trin for at gemme blokerende opløsninger og antistoffer.
  8. Næste dag, inkuberes de retinae wholemounts med det primære antistof 5-7 dage ved 4 ° C. Optimale fortyndinger skal bestemmes af brugeren.
  9. Vask nethinder 3 x 30 minutter i PB 0,1 M og inkuberes natten over ved 4 ° C i den tilsvarende fluorofor-konjugeret sekundært antistof, der er rettet mod arter af det primære antistof (koncentration 1: 1.000).
  10. Efter tre endelige vask på 30 min hver med PB, montere nethinder i montering medium. Forsegl dækglas med neglelak til længere tids opbevaring. Opbevar prøverne ved 4 ° C og beskyttet mod lys.

2. Mærkning af ganglieceller og Axoner i Rat whole- mount nethinder med et Calcium Indikator Dye

  1. Forbered 1.000 ml pattedyr Ringers indeholdende (i mM) 125 NaCI, 3 KCI, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 og 10 glucose gennemboblet med 95% O2 / 5% CO ­ 2.
  2. Udfør dissektion som beskrevet i trin 1,2-1,4.
  3. For at indlæse retina-ganglieceller (rGCS) og deres axoner med calcium indikatorfarvestof, injiceres 0.5 pi Fluo-4 pentakaliumsalt (40 mM stamopløsning i H2O) i synsnerven stub ca. 1 mm posteriort øjeæblet ved hjælp af en sprøjte . Til måling af dynamiske stigninger i ganglioncelle [Ca2 + Jeg en indikator med høj affinitet, såsom Fluo-4 med dens Kd på 345 nM, er optimal. Fluo-4 giver den yderligere fordel at have en meget høj kvanteeffektivitet resulterer i en stigning på> 100 gange emission når det er bundet til calcium.
  4. Placer øjestykket i pattedyr Ringers boblet med 95% O 2/5% CO ­ 2 til 1 time ved stuetemperatur i mørke.

3. Calcium Imaging Protokol for retina-ganglieceller og Axoner.

  1. Fjern øje, linse og glaslegemet som beskrevet i trin 1,1-1,4. Isoler nethinden fra øjestykket og opdele i kvadranter. Montér en kvadrant ganglioncelle opad på en glasplade og bruge en harpe skive gitter til at stabilisere den. Hold andre stykker mørk-tilpasset i pattedyr Ringers boblet med 95% O 2/5% CO ­ 2 på is til senere brug.
  2. Superfuse optagelsen kammer med pattedyr Ringers opløsning ogholde opløsningen boblende kontinuerligt med 95% O2 / 5% CO2.
  3. Billede vævet under mikroskop. Gennemføre eksperimenter ved stuetemperatur (~ 23 ° C) eller opnå fysiologiske temperaturer ved opvarmning scenen, opvarmning af vandet bad under prøven eller anvender varm luft på overfladen af ​​prøven.
    Bemærk: Det er vigtigt at bemærke, at mange cellulære funktioner reguleres af temperaturen, som spiller en central rolle i opretholdelsen af intracellulær homeostase 16. Indførelse af opvarmning foranstaltninger kan dog øge antallet af fotoblegning, fordampning af mediet og fokus afdrift forårsaget af termisk ekspansion 17. Brug af rumtemperaturen falder intracellulær opdeling af Fluo-4 18.
  4. Udfør en kontrol af to parrede høje K + impulser i fravær af narkotika. Depolarisere rGCS og RGC axoner ved at hæve [K +] o fra 3 mm til 60 mm for 33 sek under hver puls for at aktivereVGCCs med en otte-kanal tyngdekraft drevne superfusionssystem. Reducer Na + med 57 mM til opretholde isosmolarity i den forhøjede K +-opløsning.
  5. Vurdere bidraget fra forskellige VGCCs til calcium signal med brug af generelle eller specifikke Ca kanalblokkere. For eksempel reduktion i calcium-signal efter administration af en ikke-specifik calciumkanalblokker, cobalt, forudsat en semi-kvantitativ måling af bidrag VGCCs den høje K + -evoked calcium signal.
  6. Anskaf fluorescensintensitets værdier ved at placere et område af interesse (ROI) omkring rGCS af interesse (Figur 2).
  7. Normalisere ændringen i fluorescensintensitet produceret af den anden høj K + spids til ændringen produceret af den første high K + top. Så for afprøvning af bestemte calciumkanalblokkere, anvende narkotika kun i den anden høj K + puls af et par og normalisere denne top modden første spidsværdi. For at måle effekten af lægemidlet på den høje K + peak opdele amplituden af den anden K + top ved det første. Analyse skal udføres på disse værdier i forhold til deres matchende kontroller afledt fra parret høj K + toppe målt i fravær af lægemiddel.
  8. Anskaf billeder på 5 sec intervaller. For at undgå fotoblegning, holde laserexcitation så lavt som muligt. Giv excitation ved 488 nm linie af argonlaseren, mens fotomultiplikatorrør indsamler fluorescensemissionen gennem et 505 nm LP-filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunolabeling med specifikke antistoffer giver en platform for at studere lokaliseringen af ​​bestemte proteiner af interesse i nethinden og calcium imaging teknik tillader studiet af bidraget fra de VGCCs til calcium dynamik i de retinale ganglieceller og deres axoner.

Ved anvendelse af et antistof mod ganglioncelle protein RBPMS (RNA-bindende protein med flere splejsning), som selektivt mærker rGCS 19, var vi i stand til at vise, at Fluo-4 mærkningen er begrænset til ganglieceller (figur 1). Stump-injektion ikke fører til mærkning af alle ganglieceller, som det kunne forventes fra denne teknik.

Et kanin-polyklonalt antistof blev genereret mod den N-terminale ende af RBPMS polypeptid (RBPMS 4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR ved en kommerciel leverandør (tabel 1). RBPMS er stærkt konserveret blandt pattedyr og polypeptidsekvensen anvendes til immunisering er identisk i mus, rotte, abe og menneske (NCBI Protein Bank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Kanin-sera blev opsamlet efter immunisering og affinitetsoprenset ved hjælp af en RBPMS polypeptid affinitetssøjle. Det affinitetsoprensede antistof blev vist at immunfarve ganglieceller på mus og rotter nethinden. For at vurdere specificiteten af ​​RBPMS immunfarvning blev en præadsorption kontrol udført med kanin-antistof. Kort fortalt blev RBPMS antistof fortyndet i 0,1 M fosfatbuffer indeholdende 0,5% Triton X-100 og blandes med RBPMS polypeptid ved en endelig koncentration på 1 ug / ml i 2 timer ved stuetemperatur. Nr RBPMS immunfarvning var til stede i vævssnit inkuberet med præabsorberet kanin-antistoffer til RBPMS og behandles ved hjælp af standard immunohistokemiske teknikker.

s.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1: Post-hoc-immunfarvning med antistoffer mod de RGC protein RBPMS (rød) for at vise Fluo-4 (grøn) lokalisering til ganglieceller En Alexa 568 gede-anti-kanin sekundært antistof blev anvendt.. Målestokken: 20 mm.

Calcium imaging teknikker anvendes til at studere bidraget af VGCCs til calcium signal i rGCS og deres axoner. Fluorescensintensitet værdier blev erhvervet ved at placere ROI'er på rGCS af interesse (Figur 2).

Figur 2
Figur 2: For at erhverve fluorescensintensitet værdier blev ROIs placeret på ganglioncelle somata og / eller axoner Målestokken:. 50 mm.

Fluo-4 pentakaliumsalt blev anvendt til at mærke rGCS og deres axoner (figur 3).


Figur 3: VGCC undertyper, der bidrager til calcium signalering i ganglioncelle somata og deres axoner. (A) Konfokal billede af en whole- mount nethinden basislinieniveauer. RGCS og RGC axoner kan ses mærket med fluo-4. (B) fluorescerende signaler fra en enkelt RGC somata demonstrerer stigning i den gennemsnitlige fluorescensintensitet fremkaldt af parrede pulser af høj K + (60 mm) badopløsningen og den efterfølgende reduktion i fluorescens i nærvær af kobolt i anden puls. Målestokken for A: 20 mm.

Zeiss LM5 Pascal-systemet blev sat til at tage billeder på en frame rate på 5 sek, og hver full frame scanning tog 1,57 sekunder ved de indstillinger, der bruges. En samling område på 318 um x 318 um blev inkluderet i det scannede område på 512 x 512 pixel Ræk giver et areal på 0,385 um 2 per pixel. Disse indstillinger kan varieres afhængigt af den ønskede opløsning. Systemet anvender en 25 mW Argon laser til 488 nm excitation. Vi brugte denne linje på 3% effekt. Mætning blev minimeret ved først at vælge den laveste koncentration af calcium indikator farvestof, der gav de robuste svar på depolariserende stimuli og derefter ved at reducere produktionen gevinst. Reduktion af laser magt bidraget til at undgå blegning. Koncentration indikator blev ikke målt. Kalibrering af ikke-ratiometrisk billeddannelse er muligt med anvendelse af calciumionoforer, men opfyldning teknik kan arbejde med ratiometriske farvestoffer samt. For at bestemme den optimale koncentration indikator, sammenlignede vi depolarisering fremkaldte ændring i fluorescens med stump-injicerede koncentrationer af Fluo-4 spænder fra 1 til 40 mM. Cirkulære og ovale ROIs blev trukket rundt rGCS og deres axoner henholdsvis som udviste stabil fluorescens intensitet. RGCS og axoner, der drevet uden forfokus på grund af bevægelse forårsaget af superfusion ikke blev valgt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel har vi beskrevet to forskellige teknikker: 1) Immunohistokemi at vise Fluo-4 lokalisering til gangliecellerne i retinale wholemounts, og 2) Calcium billedbehandling til at analysere calcium dynamik i retina-ganglieceller og deres axoner.

Immunhistokemi under anvendelse wholemounts er blevet anvendt til at afsløre lokaliseringen af proteiner i gnaver nethinden 20-23. Der er dog nogle begrænsninger. Kvaliteten af ​​farvningen er stærkt afhængig af antistoffets evne til at genkende sit respektive antigen og dets evne til at trænge retinavæv den særlige lag af interesse. Disse spørgsmål kan forbedres ved at forøge inkubationsperioden i det primære antistof med op til syv dage, forøgelse af koncentrationen af ​​Triton-X og / eller inkubering af nethinden uden filtrerpapir for at tillade diffusion af antistoffet gennem ganglion cellelag og fotoreceptorerne. En anden begrænsning er de duratiom og koncentration af fiksering. Nogle antistoffer virker bedre, når væv fikseres i en time, mens andre antistoffer kræver en kortere rentebindingsperiode. Ligeledes mens visse antistoffer virker bedst i 4% PFA fiksering, andre arbejder bedre ved reducerede koncentrationer. Vi anbefaler, at brugeren bestemme den optimale varighed og koncentration af fiksering, varigheden af ​​inkubationen koncentrationen af ​​Triton-X, samt koncentrationen af ​​det primære antistof for at opnå optimale resultater.

Calcium imaging blev anvendt til at studere calcium dynamik i retina-ganglieceller og deres axoner. Superfusionssystem af VGCC blokerende midler tillod vurdering af den relative blokering effektiviteten af ​​narkotika og tilstedeværelsen af ​​forskellige Ca kanal undertyper. I tilfælde af at rGCS og axoner ikke reagerer på høj K +, prøve at reducere koncentrationen af calcium indikatorfarvestof, som høje koncentrationer kan føre til mætning. Ufuldstændig fjernelse af glaslegemetkan også fungere som en barriere, der forhindrer høj K + fra at nå rGCS og deres axoner. Desuden kan manglende korrekt montere Harpe oven på nethinden forårsage bevægelse, hvilket resulterer i en manglende evne til at erhverve fluorescensintensitet værdier. Hvis nethinden fortsætter med at bevæge sig, fjern forsigtigt harpe, tørre området omkring nethinden og genmontere harpen ved at tilføje mere fedt på sin omkreds. Fuldstændig fjernelse af glaslegemet og minimal bevægelse af retinal whole- mount er afgørende for succes af forsøget.

Agonister af calcium-gennemtrængelig glutamatreceptorer udtrykt af rGCS, såsom N-methyl-D-aspartat (NMDA), 24,25 α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionat (AMPA)-receptorer og kainattypen ionotropiske glutamatreceptorer 26-29, kan anvendes til at fremkalde direkte indtastning af calcium samt give et depolariserende stimuli, der aktiverer VGCCs. Udnyttelse af sådanne agonister kan føre til et ikkeEnsartede respons på grund af den differentielle ekspression af glutamatreceptorundertyper til de forskellige typer af rGCS. To-foton mikroskopi kan også anvendes til at undersøge lys fremkaldte calcium-signaler i rGCS 30 og deres dendritter 31.

Selektiv mærkning af rGCS blev opnået på grund af den membran impermeabel egenskaber Fluo-4 pentakaliumsalt calcium indikatorfarvestof. Dextran-konjugeret calcium indikatorfarvestoffer er også blevet anvendt til selektivt at mærke rGCS og deres axoner via intraretinal injektioner i kaniner 32 og rotte 33. I begge undersøgelser blev selektiv mærkning af rGCS og deres axoner opnås via intraretinal injektioner af dextran-konjugeret calcium indikatorfarvestof, efterfulgt af en 2 timers inkubation i kanin 32 eller en 7 timers inkubation i rotte 33. Trods yde et passende inkubationstid at sikre ensartet mærkning i nethinden, sådanne metoder resulterer i øget mærkning af rGCS og deresaxoner nærmeste injektionsstedet sammenlignet med sparsom mærkning i regioner distale til injektionsstedet. Som omtalt i Baldrige (1996), ikke-ensartet mærkning på injektionsstedet er blevet tilskrevet diffusionsmæssig mærkning af soma som følge af farvestofoptagelse på den udsatte (cut) dendritceller, mens sandsynligvis mærkning i distale regioner som følge af retrograd transport fra optagelse af farvestoffet på den udsatte Axon 32. Vores teknik giver forbedrede metoder til at øge en ensartet mærkning af rGCS og deres axoner og minimere den nødvendige inkubationstid.

Den foreliggende farvestof lastning fremgangsmåde tilvejebringer en alternativ strategi til traditionelle teknikker, såsom isætning og elektroporation, der resulterer i ikke-specifik belastning af fordrevet amacrine celler i ganglion cellelag. Med tilgængeligheden af transgene mus, der udtrykker tdTomato eller EGFP under kontrol af promotorer, der er i bestemte ganglion celle populationer 34-38, fremtidige applications af denne teknik kan omfatte calcium billeddiagnostiske undersøgelser af specifikke retinale ganglieceller undertyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Vi takker Dr. S. Stella og Helen Vuong for bidrag til calcium imaging-protokollen. Vi takker Dr. K. Ark til at filme interviewet scener. Vi takker Dr. Arlene Hirano for hendes kommentarer til manuskriptet. Denne forskning og udvikling projektet blev gennemført af forfatterne på David Geffen School of Medicine på UCLA og er gjort mulig ved en kontrakt aftale, der blev tildelt, og som administreres af US Army Medical Research & Materiel Kommando (USAMRMC) og Telemedicin & Advanced Technology Research Center (TATRC), ved Fort Detrick, MD under kontrakt Nummer: W81XWH-10-2-0077. Støtten til disse undersøgelser også kom fra NIH EY04067 og en VA Merit anmeldelse (NB). NCB er en VA Career Research Scientist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Neuroscience immunhistokemi antistof fluo-4 calcium billeddannelse ganglieceller nethinde rotte
Immunhistokemiske og Calcium Imaging Methods in whole- mount rotteretina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter