Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Abstract

In dit artikel beschrijven we de instrumenten, reagentia, en de praktische stappen die nodig zijn voor: 1) succesvol bereiding van wholemount netvliezen voor immunohistochemie en 2) calcium imaging voor de studie van spanningsgevoelige calciumkanalen (VACK) gemedieerde calcium signalering in retinale ganglioncellen. De calcium imaging methode beschrijven we omzeilt kwesties met betrekking tot niet-specifieke belasting van ontheemd amacrine cellen in het ganglion cellaag.

Introduction

Retinale ganglioncellen (RGC's) tot expressie L, N, P / Q en T-type VGCC bepaald door farmacologische blokkade van deze onderdelen van de gehele cel Ca kanaalstroom 1,2. VGCC zijn transmembraan multimerische eiwitten die betrokken zijn bij de zender release, gen-transcriptie, cel regulatie en synaptische plasticiteit 3,4,5. Functionele VGCCs bestaan ​​uit ten minste drie onderscheiden subeenheden: grote, α 1 transmembraan porie vormende subeenheden die biofysische en farmacologische eigenschappen van het kanaal, voornamelijk extracellulair hulpstoffen α 2 δ subeenheden en intracellulaire β subeenheden vastgesteld. De laatste twee vormen heteromere complexen met verschillende α 1 subeenheden en verandert de kinetische eigenschappen van en handel van de kanalen naar de plasmamembraan 6.

In de afgelopen decennia zijn vele technieken zijn gebruikt om eiwit expre studerensie, zoals immunohistochemie, enzymgekoppelde immunosorbent assay, western analyse en flowcytometrie. Deze technieken vereisen het gebruik van specifieke antilichamen voor de detectie van een bepaald eiwit van interesse en bieden krachtige gereedschappen voor de lokalisatie en verdeling van specifieke eiwitten in verschillende weefsels. Technieken voor mRNA expressieniveaus van een bepaald eiwit detecteren en kwantificeren zoals Northern-blot-analyse, RT-PCR, real-time kwantitatieve RT-PCR, in situ hybridisatie, cDNA microarrays en bescherming ribonuclease assay een alternatieve benadering als antilichamen niet gemakkelijk beschikbaar zijn of expressie van een bepaald eiwit laag 7. Echter, een beperking van het gebruik van dergelijke moleculaire technieken is de vereiste identificatie van de gensequentie.

Om eiwitten in het netvlies lokaliseren, immunohistochemie kan worden uitgevoerd op wholemount netvlies. Door de toegankelijkheid van de RGC de wholemountvoorbereiding biedt een uitstekend platform om de lokalisatie van specifieke eiwitten te bestuderen om het RGC somata en hun axonen.

Naast hun lokalisatie, kunnen enkele functionele eigenschappen van de VGCCs in RGC worden aangetoond door het gebruik van calcium beeldvormingstechnieken. We beschrijven een calcium imaging protocol selectief labelen RGC met een calcium indicator kleurstof intracellulaire calcium dynamiek meten. De bijdrage van de verschillende VGCCs de calcium signaal in verschillende cellulaire compartimenten kunnen worden geïsoleerd met gebruik van subtype-specifieke Ca-antagonisten.

Misschien is een van de meest voordelige aspecten van de calcium beeldvormende techniek die hier beschreven is het vermogen om gelijktijdig en onafhankelijk opnemen van meerdere RGC en hun axonen. Hoewel veel fysiologische technieken, zoals whole cell patch clamp opname, een hoge tijdsresolutie opnames membraan stromen, somatische of axonale bron van these stromen opgenomen kunnen niet worden onderscheiden en opnamen kunnen alleen worden gemaakt uit een neuron tegelijk. Multielectrode (MEA) kunnen gelijktijdig opnemen pieken van vele cellen, maar kan niet detecteren of discrimineren de activatie van, bijvoorbeeld, verschillende subtypen van calciumkanalen. Meas voorkeur opnemen van cellen die zich bevinden in de nabijheid van een bepaalde elektrode 8 en opnemen van cellen die grote spikes 9 genereren. Optical imaging methoden geven een alternatieve strategie voor de gelijktijdige en onafhankelijke opnamen van hele populaties van cellen die kunnen worden geïntegreerd met de resultaten van eencellige micro-elektrode en patch clamp opname en MEA opname informatie mogelijk. Hoewel calcium beeldvormingstechnieken hier beschreven werden gebruikt om de calciumdynamiek RGC bestuderen, kunnen patch clamp en MEA worden gebruikt parallel aan de opheldering van de ionische stromen en additie eigenschappen van RGC.

10, ons doel was om een laad-techniek die selectief etiketten RGC met een synthetische calcium indicator kleurstof in een gebruiken wholemount bereiding. Hoewel synthetische calcium indicator kleurstoffen uitstekend platform voor de studie van intracellulaire calcium dynamiek heeft het wijdverbreide gebruik belemmerd door het onvermogen om effectief ladingsspecifiek populaties van neuronen in een bepaald netwerk. Veel technieken zoals bulkbelading 11 en elektroporatie 8,12 uitgevoerd laden gehele celpopulaties zijn dergelijke technieken geen onderscheid tussen specifieke celtypen. Genetisch gecodeerde calcium indicatoren de mogelijkheid om specifieke celpopulaties selectief labelen, maar dergelijke werkwijzen vereisen het genereren van transgene dieren 13. De techniek beschrijft een method om selectief labelen RGC in de wholemount voorbereiding via oogzenuw stomp injectie van een calcium indicator kleurstof.

Samen genomen, de structurele en fysiologische technieken die in dit artikel geven een platform om de lokalisatie en de bijdrage van de VGCCs om de calcium signaal in RGC en hun axonen te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het welzijn van de proefdieren, uitgegeven door de US Public Health Service Policy on Human Care en gebruik van proefdieren en de Universiteit van Californië-Los Angeles (UCLA) Commissie Animal Research. Mannelijke en vrouwelijke volwassen Sprague-Dawley ratten (Charles River Lab, Wilmington, MA) in de leeftijd van 3-5 weken gebruikt.

1 Animal and Tissue Voorbereiding voor Wholemount Retina en Immunohistochemistry Protocol

  1. Bereid de volgende materialen en gereedschappen: Een dissectiemicroscoop, 2 tangen met zeer fijne tips, schaar, cellulose filter papier, plastic pipet en een microscoop glijbaan.
  2. Euthanaseren de rat in een gesloten kamer door diep verdoven van het dier met 1-3% isofluraan waarna zij werden onthoofd met een guillotine. Verwijder de ogen met een paar iris schaar en in een petrischaal met de extracellulaire oplossing. Hibernate A, Ames Medium of fysiologische oplossingen worden aanbevolen.
  3. [Optioneel stap als opvulling van RGC met Fluo-4 is gewenst]. Voer de Fluo-4 labeling zoals beschreven in stappen 2.3-2.4.
  4. Met behulp van de dissectiemicroscoop (lichtintensiteit: 1,6 x 10 8 fotonen / mm 2 ⋅sec), verwijder het hoornvlies door het afsnijden van de voorkant van de oogbol. Verwijder de lens en glasvocht van het binnenoppervlak netvliesoppervlak met een pincet. Om het glasvocht te verwijderen, het stabiliseren van de oogbol door die de sclera stevig vast met een pincet. Haal voorzichtig het glasvocht basisstation naar het midden van het netvlies met de andere pincet. Het preparaat in deze fase wordt de oogschelp, die wordt gebruikt voor vriescoupes. Meer details over vriescoupes zijn te vinden in referenties 14,15.
  5. Verwijder het netvlies van de oogschelp. Maak dan vier sneden om het netvlies te plat. Voorzichtig monteren het netvlies op een microscoop dia met de fotoreceptor laag boven. Voeg een druppel van oplossing van het netvlies en zet cellulose filtreerpapier op het netvlies. Zodra de retina hecht aan het filterpapier, plaatst het netvlies opnieuw in oplossing. Indien nodig, plat het netvlies met een borstel of een tang.
  6. Plaats de wholemounted netvliezen in 4% PFA gedurende 10-15 min voor fixatie.
  7. Was de wholemounted netvlies drie maal gedurende 30 min in 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7.4. Blokkeer het netvlies met 5% normaal geit serum of ezel serum in 0,1 PB die 0,3% Triton X-100 en 0,1% NaN3 bij 4 ° C overnacht. We raden een eindvolume van 500 pi voor alle stappen aan blokkerende oplossingen en antilichamen slaan.
  8. De volgende dag, incubeer de retinae wholemounts met het primaire antilichaam 5-7 dagen bij 4 ° C. Optimale verdunningen moeten worden bepaald door de gebruiker.
  9. Was de retina 3 x 30 min in 0,1 M PB en incubeer overnacht bij 4 ° C in de overeenkomstige fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichaam dat is gericht tegen de species van het primaire antilichaam (concentratie 1: 1.000).
  10. Na drie laatste wasbeurten van 30 minuten elk met PB, monteer het netvlies in montage medium. Dicht de dekglaasjes met nagellak voor langdurige opslag. WINKEL monsters bij 4 ° C en beschermd tegen licht.

2 Labeling van ganglioncellen en axonen in Rat Wholemount netvliezen met een Calcium Indicator Dye

  1. Bereid 1000 ml zoogdieren Ringer's bevattende (in mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 en 10 glucose geborreld met 95% O 2/5% CO ­ 2.
  2. Voer de dissectie zoals beschreven in stappen 1.2-1.4.
  3. Retinale ganglioncellen (RGC's) en hun axonen vullen met een calcium indicator kleurstof, injecteer 0,5 gl Fluo-4 Pentakaliumtrifosfaat zout (40 mM voorraad in H 2 O) in de oogzenuw stomp ongeveer 1 mm achter de oogbol met een injectiespuit . Om de dynamische verhoging van de ganglion cel meten [Ca 2 + i indicator met hoge affiniteit, zoals Fluo-4 met een Kd van 345 nM, optimaal. Fluo-4 biedt het extra voordeel van een zeer hoge quantum efficiency resulteert in een emissie toename van> 100-voudig wanneer gebonden aan calcium.
  4. Plaats de oogschelp in zoogdiercellen Ringers borrelen met 95% O 2/5% CO ­ 2 voor 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.

3 Calcium Imaging Protocol voor retinale ganglioncellen en axonen.

  1. Verwijder het oog, lens en het glasvocht, zoals beschreven in de stappen 1,1-1,4. Isoleer het netvlies van de oogschelp en verdeel het in kwadranten. Mount een kwadrant ganglion cel side up op een glasplaatje en gebruik een harp slice raster om het te stabiliseren. Houd de andere stukken donker aangepaste in zoogdiercellen Ringers borrelen met 95% O 2/5% CO ­ 2 op ijs voor later gebruik.
  2. Superfuse de opname kamer met zoogdier Ringer-oplossing enbewaar de oplossing continu doorborrelen met 95% O 2/5% CO 2.
  3. Afbeelding het weefsel onder de microscoop. Conduct experimenten bij kamertemperatuur (~ 23 ° C) of bereiken fysiologische temperaturen door verwarmen de fase verwarmen van het waterbad onder het monster of het toepassen van warme lucht op het oppervlak van het monster.
    Opmerking: Het is belangrijk om op te merken dat veel cellulaire functies worden geregeld door de temperatuur, die een belangrijke rol bij het ​​handhaven van de intracellulaire homeostase 16 speelt. Echter, kan introductie van de aarde meet de snelheid van fotobleken, verdamping van het medium en de focus drift veroorzaakt door thermische uitzetting 17 te verhogen. Gebruik van de ruimte temperatuur daalt intracellulaire compartimentering van Fluo-4 18.
  4. Een controlemeting van twee gekoppelde hoge K + pulsen in afwezigheid van drugs. Depolariseren RGC en RGC axonen door het verhogen van de [K +] o van 3 mm tot 60 mm voor 33 sec tijdens elke puls te activerenVGCCs met een acht kanaals zwaartekracht gedreven superfusie systeem. Verminder Na + door 57 mM tot isosmolarity in de verhoogde K + oplossing leidt.
  5. Beoordeel de bijdrage van verschillende VGCCs de calcium signaal met gebruik van algemene of specifieke Ca kanaal blokkers. Bijvoorbeeld, de vermindering van calcium signaal na toediening van een niet-specifieke calciumantagonist, kobalt, voorzien in een semi-kwantitatieve maat van de bijdrage van de VGCCs de hoge K + -evoked calcium signaal.
  6. Verwerven fluorescentie-intensiteitswaarden door een gebied van belang (ROI) rond de RGC plaats (figuur 2).
  7. Normaliseren van de verandering in fluorescentie-intensiteit door de tweede hoge K + piek tot de verandering door de eerste hoge K + piek. Dan, voor het testen van bepaalde calciumkanaalblokkers toepassing drugs alleen tijdens de tweede hoge K + puls een paar en normaliseren deze piek tegende eerste piekwaarde. Het meten van de invloed van het geneesmiddel op de hoge K + piek, verdelen de amplitude van de tweede K + piek bij die van de eerste. Analyse worden uitgevoerd op deze waarden ten opzichte van hun bijpassende controles verkregen uit gepaarde hoge K + pieken gemeten in afwezigheid van geneesmiddel.
  8. Acquire beelden op 5 sec intervallen. Om foto-bleken voorkomen, zo laag mogelijk te houden de laser excitatie. Geef excitatie door 488 nm lijn van de argon laser, terwijl de fotovermenigvuldigerbuis verzamelt de fluorescente emissie door een 505 nm LP filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunokleuring met specifieke antilichamen verschaft een platform voor de lokalisatie van bepaalde eiwitten van belang in de retina en calcium beeldvormingstechniek Studentenvisums de studie van de bijdrage van de VGCCs de calcium dynamiek in de retinale ganglioncellen en hun axonen.

Door een antilichaam tegen het eiwit RBPMS ganglioncellen (RNA bindend eiwit met meerdere splicing) die selectief etiketten RGC 19, konden we aantonen dat de Fluo-4 labeling beperkt tot ganglioncellen (figuur 1). Stump-injectie leidt niet tot de etikettering van alle ganglioncellen zoals verwacht mag worden van deze techniek.

Een konijnen polyklonaal antilichaam werd opgewekt tegen de N-terminus van het polypeptide RBPMS (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR door een commerciële leverancier (tabel 1). RBPMS is sterk geconserveerd onder zoogdieren en polypeptidesequentie gebruikt voor immunisatie is identiek in de muis, rat, aap en mens (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Konijnenserum werd verzameld na immunisatie en affiniteit gezuiverd met een RBPMS polypeptide affiniteitskolom. De affiniteit gezuiverde antilichaam werd aangetoond ganglioncellen immunostain in muis en rat retina. Om de specificiteit van de RBPMS immunostaining evalueren, werd een pre-absorptie controle uitgevoerd met het konijn antilichaam. In het kort werd de RBPMS antilichaam verdund in 0,1 M PB bevattende 0,5% Triton X-100 en gemengd met de RBPMS polypeptide in een eindconcentratie van 1 ug / ml gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Geen RBPMS immunokleuring was aanwezig in weefselcoupes geïncubeerd met vooraf geabsorbeerd konijn antilichamen RBPMS en verwerkt door standaard immunohistochemische technieken.

s.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 1: Post-hoc immunokleuring met antilichamen tegen de proteïne RGC RBPMS (rood) Fluo-4 (groen) lokalisatie tonen de ganglioncellen een Alexa 568 geit anti-konijn secundair antilichaam gebruikt.. Schaal bar: 20 mm.

Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om de bijdrage van VGCCs de calcium signaal in de RGC en hun axonen bestuderen. Fluorescentie intensiteit waarden werden verkregen door het plaatsen van ROI op de RGC plaats (figuur 2).

Figuur 2
Figuur 2:. 50 mm: Om fluorescentie-intensiteit zijn opgehaald, werden ROI op de ganglioncellen somata en / of axons Schaal bar gebracht.

Fluo-4 Pentakaliumtrifosfaat zout werd gebruikt om RGC en hun axonen (figuur 3) label.


Figuur 3: VACK subtypes die bijdragen aan calcium signalering in somata ganglioncellen en hun axonen. (A) confocale beeld van een wholemount netvlies aan de uitgangswaarden. RGC en RGC axonen kunnen worden gezien gelabeld met fluo-4. (B) fluorescentiesignalen van een RGC somata tonen de toename van gemiddelde fluorescentie-intensiteit veroorzaakt door gepaarde pulsen van hoge-K + (60 mM) badoplossing en de daaropvolgende daling fluorescentie in aanwezigheid van kobalt tijdens de tweede puls. Schaal bar voor A: 20 mm.

De Zeiss LM5 Pascal systeem is ingesteld om beelden vast te leggen met een beeldsnelheid van 5 sec en elke full frame scan duurde 1,57 sec bij de gebruikte instellingen. Een verzamelgebied van 318 urn x 318 urn in het gescande gebied van 512 x 512 pixels die een gebied van 0.385 pm2 per pixel. Deze instellingen kunnen worden gevarieerd afhankelijk van de gewenste resolutie. Het systeem gebruikt een 25 mW Argon laser voor 488 nm excitatie. We gebruikten deze lijn op 3% vermogen. Verzadiging werd geminimaliseerd door eerst de laagste concentratie van het calcium indicator kleurstof die de robuuste reacties op de depolariserende stimulus opgeleverd en vervolgens door het verminderen van output gain. Vermindering van laservermogen geholpen bleken te vermijden. Indicator concentratie werd niet gemeten. Kalibratie van niet-ratiometrische imaging is mogelijk met het gebruik van calcium ionoforen, maar het afdekken techniek kan met ratiometrische kleurstoffen ook. Om de optimale indicator concentratie bepalen vergeleken we de depolarisatie opgewekte verandering in fluorescentie met stomp geïnjecteerde concentraties van Fluo-4 variërend 1-40 mM. Circulaire en ovaal ROI's werden getrokken rond RGC en hun axonen, respectievelijk dat stabiele fluorescentie-intensiteit tentoongesteld. RGC en axonen die dreef uitrichten als gevolg van beweging veroorzaakt door superfusie werden niet geselecteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1) Immunohistochemistry tot Fluo-4 lokalisatie naar het ganglion cellen in het netvlies wholemounts tonen, en 2) Calcium beeldvorming aan calcium dynamiek analyseren in retinale ganglioncellen en hun axonen: In dit artikel hebben we twee verschillende technieken beschreven.

Immunohistochemie met wholemounts is gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in de retina knaagdier 20-23 onthullen. Er zijn echter een aantal beperkingen. De kwaliteit van de kleuring is sterk afhankelijk van het vermogen van het antilichaam om het betreffende antigeen en het vermogen om het retinale weefsel doordringen tot de bepaalde laag van belang herkennen. Deze problemen kunnen worden verbeterd door de incubatieperiode in het primaire antilichaam door tot zeven dagen, het verhogen van de concentratie van Triton-X en / of incuberen van het netvlies zonder filterpapier de verspreiding van het antilichaam door het ganglion cellaag toestaan ​​en de fotoreceptoren. Een andere beperking is de duratiop en concentratie van fixatie. Sommige antilichamen werken beter wanneer het weefsel wordt vastgesteld voor een uur, terwijl andere antilichamen een kortere fixatie periode. Evenzo, terwijl bepaalde antilichamen werken het beste in 4% PFA fixatie, anderen werken beter bij lage concentraties. We raden dat de gebruiker de optimale duur en concentratie van fixatie, de incubatieduur, de concentratie van Triton-X, en de concentratie van het primaire antilichaam voor een optimaal resultaat bepalen.

Calcium beeldvorming werd gebruikt om de calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen bestuderen. Superfusieapparaat van VACK blokkers toegelaten evaluatie van de relatieve blokkering effectiviteit van de geneesmiddelen en de aanwezigheid van verschillende Ca kanaal subtypes. Indien RGC axonen en reageren niet hoog K +, verlaag de concentratie van het calcium indicator kleurstof, zoals hoge concentraties kan leiden tot verzadiging. Onvolledige verwijdering van het glasachtigekan ook fungeren als een barrière, het voorkomen van een hoge K + van het bereiken van de RGC en hun axonen. Bovendien kan het niet goed monteren harp bovenop de retina beweging veroorzaken, resulterend in een onvermogen om fluorescentie-intensiteitswaarden verkrijgen. Als het netvlies blijft bewegen, verwijder voorzichtig de harp Droog het gebied rond de retina en opnieuw monteren harp door meer vet aan de omtrek. Volledige verwijdering van het glasachtige lichaam en minimale beweging van de retinale wholemount is cruciaal voor het succes van het experiment.

Agonisten van de calcium-permeabele glutamaatreceptoren van RGC zoals N-methyl-D-aspartaat (NMDA) uitgedrukt, 24,25 α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazool-4-propionaat (AMPA) receptoren en kaïnaat type ionotrope glutamaatreceptoren 26-29, kunnen worden gebruikt voor directe invoer van calcium roepen en verstrekt een depolariserende stimulus die VGCCs activeert. Gebruik van dergelijke agonisten kan leiden tot een nietEenvormige reactie vanwege de differentiële expressie van de glutamaat receptor subtypes de verschillende RGC. Twee-foton microscopie kan worden gebruikt om licht opgewekte calciumsignalen onderzoeken RGC 30 en de dendrieten 31.

Selectieve labeling van RGC werd gerealiseerd door het membraan impermeant eigenschappen van de Fluo-4 Pentakaliumtrifosfaat zout calcium indicatorkleurstof. Dextran-geconjugeerde calcium indicator kleurstoffen zijn ook gebruikt om selectief labelen RGC en hun axonen via intraretinale injectie in konijnen en ratten 32 33. In beide studies selectieve labeling van RGC en hun axonen werd bereikt door intraretinale injecties van het dextran-geconjugeerde calcium indicator kleurstof, gevolgd door 2 uur incubatie bij konijnen 32 of 7 uur incubatie in rat 33. Ondanks een adequaat incubatieperiode uniforme etikettering te waarborgen in de retina, die methoden resulteren in verhoogde etikettering van RGC en hunaxons dichtstbijzijnde de injectieplaats tegenover sparse etikettering gebieden distaal van de injectieplaats. Zoals in Baldrige (1996), niet-uniforme labeling op de injectieplaats is toegeschreven aan diffusie etikettering van de soma als gevolg van kleurstofopname op de blootgestelde (cut) dendriet, terwijl etikettering in distale gebieden waarschijnlijk door retrograde transport van opname van de kleurstof in de belichte axon 32. De techniek verschaft verbeterde werkwijzen uniforme etikettering van RGC en hun axonen te verhogen en de vereiste incubatietijd minimaliseren.

De onderhavige kleurstof laadmethode verschaft een alternatieve strategie conventionele technieken zoals bulk laden en elektroporatie die leiden tot niet-specifieke loading verplaatste amacrine cellen in de ganglion cellaag. Met de beschikbaarheid van transgene muizenlijnen expressie tdTomato of EGFP onder de controle van promoters die in specifieke ganglion cel populaties 34-38, toekomstige applications van deze techniek kunnen onder meer calcium imaging studies van specifieke retinale ganglion cel subtypes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen onthullingen.

Acknowledgments

Wij danken Dr S. Stella en Helen Vuong voor bijdragen aan het calcium imaging protocol. Wij danken Dr K. Sheets voor het filmen van het interview scènes. Wij danken Dr Arlene Hirano voor haar commentaar op het manuscript. Dit onderzoek en ontwikkeling project werd uitgevoerd door de auteurs aan de David Geffen School of Medicine aan de UCLA en wordt mogelijk gemaakt door een overeenkomst van opdracht die werd toegekend en beheerd door de US Army Medical Research en Materieel Command (USAMRMC) en de Telemedicine & Advanced Technology Research Center (TATRC), in Fort Detrick, MD onder Contract Number: W81XWH-10-2-0077. Ondersteuningsmaatregelen voor deze studies kwam ook uit NIH EY04067 en een VA Merit Beoordeling (NB). NCB is een VA Career Research Scientist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Neurowetenschappen immunohistochemie antilichaam fluo-4 calcium imaging ganglioncellen netvlies rat
Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter