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Neuroscience

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Abstract

En este trabajo se describen las herramientas, los reactivos y las medidas prácticas que se necesitan para: 1) preparación exitosa de retinas wholemount para inmunohistoquímica y, 2) imágenes de calcio para el estudio de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC) mediada por la señalización de calcio en la retina células ganglionares. El método de imagen de calcio describimos elude cuestiones relativas a la carga no específico de células amacrinas desplazadas en la capa de células ganglionares.

Introduction

Las células ganglionares de la retina (CGR) expresan L, N, P / Q y de tipo T VGCC como se determina a través del bloqueo farmacológico de estos componentes de la célula entera Ca canal actual 1,2. VGCC son proteínas multiméricas transmembrana que están implicados en la liberación del transmisor, la transcripción de genes, la regulación celular y 3,4,5 plasticidad sináptica. VGCCs funcionales se componen de al menos tres clases distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 formador de poros subunidades que establecen propiedades biofísicas y farmacológicas del canal, principalmente extracelular auxiliar α 2 δ subunidades y las subunidades β intracelulares. Los dos últimos complejos heteroméricos forma con diferentes subunidades α 1 y alterar la cinética de activación periódica y el tráfico de los canales a la membrana plasmática 6.

En las últimas décadas, muchas técnicas se han empleado para estudiar la proteína expresión, como la inmunohistoquímica, ensayo inmunoenzimático, el análisis occidental y citometría de flujo. Estas técnicas requieren el uso de anticuerpos específicos para la detección de una proteína dada de interés y proporcionan potentes herramientas para la localización y distribución de proteínas específicas en diferentes tejidos. Las técnicas utilizadas para detectar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de una proteína en particular, como el norte de blot, RT-PCR en tiempo real cuantitativa RT-PCR, hibridación in situ, microarrays de ADNc y ensayo de protección de ribonucleasa proporcionan un enfoque alternativo cuando los anticuerpos no son fácilmente los niveles de expresión disponible o si de una proteína particular son bajos 7. Sin embargo, una limitación al uso de tales técnicas moleculares es la identificación requerido de la secuencia del gen.

Para localizar proteínas en la retina, inmunohistoquímica se puede realizar en retinas wholemount. Debido a la accesibilidad de la CGR, la wholemountpreparación proporciona una excelente plataforma para el estudio de la localización de las proteínas específicas del somata RGC y sus axones.

Además de su localización, algunas propiedades funcionales de los VGCCs en CGR se pueden demostrar mediante el uso de técnicas de imagen de calcio. Se describe un protocolo de imágenes de calcio para etiquetar selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio para medir la dinámica del calcio intracelular. La contribución de las diferentes VGCCs a la señal de calcio en diferentes compartimentos celulares se puede aislar con el uso de bloqueadores de los canales de Ca subtipo específico.

Quizás uno de los aspectos más beneficiosos de la técnica de imagen de calcio descrito aquí es la capacidad de grabar simultáneamente y de forma independiente a partir de múltiples CGR y sus axones. Aunque muchas técnicas fisiológicas, como la grabación de patch clamp de célula entera, proporcionan altos grabaciones resolución temporal de las corrientes de membrana, la somática o fuente axonal de thescorrientes e grabados no pueden ser discriminados y grabaciones sólo se pueden hacer de una sola neurona a la vez. Arrays multielectrodo (AAM) son capaces de registrar simultáneamente picos de muchas células, pero tampoco pueden detectar ni discriminar la activación de, por ejemplo, los diferentes subtipos de canales de calcio. Meas preferentemente grabar a partir de células que se encuentran en las proximidades de un electrodo 8 y registro de las células que generan grandes picos 9. Métodos de imagen ópticos proporcionan una estrategia alternativa para que las grabaciones simultáneas e independientes de toda la población de células que se pueden integrar con la información obtenida a partir de una sola célula de microelectrodos y grabación de patch clamp y grabación MEA. Aunque se emplearon las técnicas de imagen de calcio descritos aquí para estudiar la dinámica de calcio de CGR, patch clamp y AAM también se pueden utilizar en paralelo a aclarar aún más las corrientes iónicas y propiedades enriquecidas de CGR.

10, nuestro objetivo era utilizar una técnica de carga que etiqueta selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio sintético en una preparación wholemount. Aunque colorantes indicadores de calcio sintéticos proporcionan una excelente plataforma para el estudio de la dinámica de calcio intracelular, su uso generalizado se ha visto obstaculizado por la incapacidad para cargar eficazmente poblaciones específicas de neuronas dentro de una red dada. Se han realizado muchas técnicas, tales como carga a granel 11 y 8,12 electroporación para cargar poblaciones enteras de células, sin embargo, estas técnicas no discriminan entre tipos de células específicos. Genéticamente codificados indicadores de calcio proporcionan la capacidad de etiquetar selectivamente poblaciones específicas de células, sin embargo, tales métodos requieren la generación de animales transgénicos 13. Nuestra técnica describe un method etiquetar selectivamente CGR en la preparación wholemount vía óptica inyección muñón del nervio de un colorante indicador de calcio.

En conjunto, las técnicas estructurales y fisiológicos descritos en este artículo proporcionan una plataforma para estudiar la localización y la contribución de los VGCCs a la señal de calcio en la CGR y sus axones.

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Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices para el bienestar de los animales de laboratorio emitidos por la Política de Servicio de Salud Pública en Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio y la Universidad de California-Los Ángeles (UCLA) Comité de Investigación Animal. Se utilizaron masculino y femenino adulto ratas Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre la edad de 3-5 semanas.

1. Animal y Tejidos Preparación para Wholemount Retina y Protocolo de inmunohistoquímica

  1. Prepare los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, 2 pinzas con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio.
  2. La eutanasia a la rata en una cámara cerrada por profundamente anestesiar al animal con 1-3% de isoflurano seguido por decapitación con una guillotina. Quitar los ojos con un par de tijeras de iris y el lugar en una placa de Petri que contiene la solución extracelular. Hibernate A, Ames míSe recomiendan Dium o soluciones fisiológicas.
  3. [Si se desea el relleno de la CGR con Fluo-4 Paso opcional]. Realizar el etiquetado Fluo-4 como se describe en el 2.3 a 2.4 pasos.
  4. Usando el microscopio de disección (intensidad de la luz: 1,6 x 10 8 fotones / mm 2 ⋅sec), retire la córnea mediante la reducción de la parte frontal del globo ocular. Retire el objetivo y el vítreo de la superficie de la retina interna con fórceps. Para quitar el vítreo, estabilizar el globo ocular sosteniendo firmemente la esclerótica con una pinza. Tienes que despegar la base del vítreo hacia el centro de la retina con la otra pinza. La preparación en esta etapa se llama el ocular, que se utiliza para cryosections. Más detalles sobre cryosections se pueden encontrar en las referencias 14,15.
  5. Retire la retina de la ojera. Luego, hacen cuatro cortes para permitir la retina para establecer planos. Montar suavemente la retina en un portaobjetos de microscopio con la capa de fotorreceptores arriba. Añadir una gota de solución a la retina y poner cepapel de filtro llulose en la retina. Una vez que la retina se adhiere al papel de filtro, colocar la retina en solución. Si es necesario, aplanar la retina con un cepillo o fórceps.
  6. Coloque las retinas wholemounted en PFA al 4% durante 10-15 minutos para la fijación.
  7. Lavar las retinas wholemounted tres veces durante 30 min en tampón fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4. Bloquear las retinas con 5% de suero de cabra normal o suero de burro en PB 0,1 que contiene 0,3% de Triton X-100 y 0,1% NaN 3 a 4 ° C durante la noche. Se recomienda un volumen final de 500 l para todos los pasos para guardar las soluciones de bloqueo y anticuerpos.
  8. Al día siguiente, se incuban los wholemounts retinae con los anticuerpos primarios 5-7 días a 4 ° C. Las diluciones óptimas deben ser determinadas por el usuario.
  9. Lavar el retinas 3 x 30 min en PB 0,1 M y se incuba durante la noche a 4 ° C en el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo correspondiente que se dirige contra la especie de anticuerpo primario (concentración 1: 1000).
  10. Después de tres lavados finales de 30 min cada uno con PB, montar las retinas en medio de montaje. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas para el almacenamiento prolongado. Guardar las muestras a 4 ° C y proteger de la luz.

2. Etiquetado de las células ganglionares y axones en Rata Wholemount retinas con un calcio Indicador Tinte

  1. Preparar 1000 ml de mamíferos de Ringer que contenía (en mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3 y 10 de la glucosa burbujeado con 95% O 2/5% de CO ­ 2.
  2. Realizar la disección como se describe en el 1.2 hasta 1.4 pasos.
  3. Para cargar las células ganglionares de la retina (CGR) y sus axones con un colorante indicador de calcio, inyectar 0,5 l de Fluo-4 sal pentapotásico (de stock 40 mM en H 2 O) en el muñón del nervio óptico de aproximadamente 1 mm posterior al globo ocular usando una jeringa . Para medir los aumentos dinámicos en células ganglionares de la [Ca 2 + i un indicador con alta afinidad, tales como Fluo-4 con su Kd de 345 nM, es óptima. Fluo-4 ofrece el beneficio adicional de tener una muy alta eficiencia cuántica que resulta en un incremento de las emisiones de> 100 veces cuando se une a calcio.
  4. Coloque el ocular en mamíferos de Ringer burbujeaba con 95% O 2/5% de CO ­ 2 durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

3. Calcio Protocolo Imaging para células ganglionares de la retina y los axones.

  1. Retire el ojo, cristalino y humor vítreo como se describe en los pasos 1.1 hasta 1.4. Aislar la retina de la ojera y se dividen en cuadrantes. Mount lado de células ganglionares de un cuadrante sobre un portaobjetos de vidrio y utilizar una rejilla rebanada arpa para estabilizarlo. Mantenga las otras piezas oscuro-adaptado de mamíferos de Ringer burbujeaba con 95% O 2/5% de CO ­ 2 en el hielo para un uso posterior.
  2. Superfuse la cámara de grabación con solución de Ringer y mamíferosmantener la solución burbujeando continuamente con 95% O2 / 5% de CO 2.
  3. Image el tejido bajo el microscopio. Realizar experimentos a temperatura ambiente (~ 23 ° C) o alcanzar temperaturas fisiológicas por el calentamiento de la etapa, calentar el baño de agua debajo de la muestra o la aplicación de aire caliente a la superficie de la muestra.
    Nota: Es importante tener en cuenta que muchas funciones celulares están regulados por la temperatura, que desempeña un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis intracelular 16. Sin embargo, la introducción de medidas de calentamiento puede aumentar la tasa de photobleaching, la evaporación del medio y el enfoque deriva causada por la expansión térmica 17. El uso de la temperatura ambiente disminuye intracelular compartimentación de Fluo-4 18.
  4. Realizar un control de dos de K + impulsos de alta pareadas en ausencia de fármacos. Despolarizar CGR axones de CGR y elevando la [K +] o de 3 mM a 60 mM durante 33 segundos durante cada pulso para activarVGCCs con un sistema de superfusión impulsado ocho gravedad canal. Reducir Na + por 57 mM de mantener isosmolarity en la solución elevada K +.
  5. Evaluar la contribución de las diferentes VGCCs a la señal de calcio con el uso de bloqueadores de los canales generales o específicas Ca. Por ejemplo, la reducción de la señal de calcio tras la administración de un bloqueador no específica del canal de calcio, cobalto, proporcionó una medida semi-cuantitativa de la contribución de los VGCCs a la alta K + señal de calcio -evoked.
  6. Adquirir valores de intensidad de fluorescencia mediante la colocación de una región de interés (ROI) en torno a la CGR de interés (Figura 2).
  7. Normalizar el cambio en la intensidad de fluorescencia producida por el segundo K + pico alto con el cambio producido por la primera alta K + pico. Entonces, para las pruebas de los bloqueadores de canales de calcio específicos, aplicar medicamentos sólo durante el segundo pulso de alta K + de un par y normalizar este pico contrael primer valor pico. Para medir el efecto del fármaco sobre el alto K + pico, dividir la amplitud de la segunda K + pico por el de la primera. El análisis debe ser realizado en estos valores con respecto a sus controles coincidentes derivados de alta emparejado K + picos medida en ausencia de fármaco.
  8. Adquirir imágenes a intervalos de 5 seg. Para evitar la foto-blanqueo, mantener la excitación láser tan bajo como sea posible. Proporcionar la excitación por la línea de 488 nm del láser de argón, mientras que el tubo fotomultiplicador recoge la emisión fluorescente a través de un filtro LP 505 nm.

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Representative Results

Inmunomarcaje con anticuerpos específicos proporciona una plataforma para estudiar la localización de proteínas particulares de interés en la retina y la técnica de imagen de calcio permite el estudio de la contribución de los VGCCs a la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Mediante el uso de un anticuerpo contra las células ganglionares RBPMS proteína (proteína de unión de ARN con múltiples empalme) que etiqueta selectivamente CGR 19, hemos sido capaces de demostrar que el etiquetado Fluo-4 se limita a las células ganglionares (Figura 1). Stump-inyección no conduce al etiquetado de todas las células ganglionares como podría ser anticipado a partir de esta técnica.

Un anticuerpo policlonal de conejo fue generado contra el N-terminal del polipéptido RBPMS (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, por un proveedor comercial (Tabla 1). RBPMS está altamente conservada entre los mamíferos y la secuencia de polipéptido utilizadas para la inmunización es idéntico en ratón, rata, mono y humano (NCBI proteína del Banco, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). El suero de conejo se recogió después de la inmunización y purificado por afinidad utilizando una columna de afinidad de polipéptido RBPMS. El anticuerpo purificado por afinidad se demostró que inmunotinción en las células ganglionares de la retina de ratón y de rata. Para evaluar la especificidad de la inmunotinción RBPMS, un control preabsorption se realizó con el anticuerpo de conejo. Brevemente, el anticuerpo se diluyó en RBPMS PB 0,1 M que contenía 0,5% de Triton X-100 y se mezcla con el polipéptido RBPMS a una concentración final de 1 mg / ml durante 2 horas a RT. No inmunotinción RBPMS estaba presente en secciones de tejido se incubaron con los anticuerpos de conejo preabsorbido a RBPMS y procesados ​​por técnicas inmunohistoquímicas estándar.

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Figura 1: Post-hoc inmunotinción con anticuerpos contra las proteínas RBPMS RGC (rojo) para mostrar Fluo-4 (verde) la localización de las células ganglionares Se utilizó un Alexa 568 cabra anti-conejo anticuerpo secundario.. Barra de escala: 20 mm.

Técnicas de imagen de calcio se utilizan para estudiar la contribución de VGCCs a la señal de calcio en la CGR y sus axones. Valores de intensidad de fluorescencia se adquirieron mediante la colocación de ROIs en las CGR de interés (Figura 2).

Figura 2
Figura 2: Con el fin de adquirir los valores de intensidad de fluorescencia, ROIs se colocaron en el somas de las células ganglionares y / o axones Barra de escala: 50. Mm.

Sal de Fluo-4 pentapotásico se utiliza para etiquetar CGR y sus axones (Figura 3).


Figura 3: subtipos VGCC que contribuyen a la señalización de calcio en los somas de las células ganglionares y sus axones. (A) Imagen confocal de una retina wholemount a niveles de línea de base. CGR y RGC axones pueden ser vistos etiquetados con fluo-4. (B) las señales fluorescentes de una sola somata RGC que demuestra el aumento de la intensidad media de fluorescencia inducida por pulsos pareados de alto K + (60 mM) de solución de baño y la consiguiente reducción en la fluorescencia en presencia de cobalto durante el segundo pulso. La barra de escala para A: 20 mm.

El sistema Zeiss LM5 Pascal se estableció para capturar imágenes a una velocidad de 5 segundos y cada exploración fotograma completo tomó 1,57 segundos en los valores utilizados. Un área de recogida de 318 m x 318 m se incluyó en la región escaneada de 512 x 512 pixels dando un área de 0,385 m 2 por píxel. Estos valores pueden variar dependiendo de la resolución deseada. El sistema utiliza un láser de 25 mW de argón para la excitación 488 nm. Utilizamos esta línea a la potencia 3%. La saturación se reduce al mínimo mediante la selección de primero la concentración más baja del colorante indicador de calcio que produjo las respuestas robustas a los estímulos despolarizantes y luego mediante la reducción de ganancia de salida. Reducción de la potencia del láser ayudó a evitar la decoloración. No se midió la concentración del indicador. Calibración de imagen no radiométrico es posible con el uso de ionóforos de calcio, pero la técnica de relleno puede trabajar con colorantes ratiometric también. Para determinar la concentración óptima indicador, se comparó la despolarización evocada por el cambio en la fluorescencia con concentraciones tocón con inyección de Fluo-4 que van desde 1 hasta 40 mM. ROIs circulares y ovalados se extrajeron alrededor de CGR y sus axones, respectivamente que exhiben intensidad de fluorescencia estable. CGR y axones que se desvió decentrarse debido al movimiento provocado por superfusion no fueron seleccionados.

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Discussion

En este artículo, hemos descrito dos técnicas diferentes: 1) La inmunohistoquímica para mostrar Fluo-4 a la localización de las células ganglionares de la retina en wholemounts, y 2) El calcio de imágenes para analizar la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

La inmunohistoquímica utilizando wholemounts se ha usado para revelar la localización de las proteínas en el roedor retina 20-23. Sin embargo, hay algunas limitaciones. La calidad de la tinción se basa en gran medida en la capacidad del anticuerpo para reconocer su respectivo antígeno y su capacidad para penetrar en el tejido de la retina a la capa particular de interés. Estos problemas pueden ser mejorados mediante el incremento del periodo de incubación en el anticuerpo primario por hasta siete días, el aumento de la concentración de Triton-X y / o la incubación de la retina sin el papel de filtro para permitir la difusión del anticuerpo a través de la capa de células ganglionares y los fotorreceptores. Otra limitación es la duratien y concentración de fijación. Algunos anticuerpos funcionan mejor cuando el tejido se fija durante una hora, mientras que otros anticuerpos requieren un período más corto de fijación. Del mismo modo, mientras que ciertos anticuerpos funcionan mejor en 4% PFA fijación, otros trabajan mejor en concentraciones reducidas. Se recomienda que el usuario a determinar la duración óptima de la fijación y la concentración, la duración de la incubación, la concentración de Triton-X, así como la concentración del anticuerpo primario para obtener resultados óptimos.

El calcio de imágenes se utilizó para estudiar la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones. Superfusión de agentes de bloqueo VGCC permitió la evaluación de la eficacia de bloqueo relativa de los fármacos y la presencia de diferentes subtipos de canales de Ca. En el caso de que CGR y axones no responden a alta K +, intentan reducir la concentración del colorante indicador de calcio, ya que altas concentraciones pueden conducir a la saturación. La eliminación incompleta del vítreoTambién puede actuar como barrera, impidiendo alto K + llegue a la CGR y sus axones. Además, el hecho de montar correctamente el arpa en la parte superior de la retina puede causar el movimiento, resultando en una incapacidad para adquirir los valores de intensidad de fluorescencia. Si la retina sigue avanzando, retire con cuidado el arpa, seque el área que rodea a la retina y volver a montar el arpa añadiendo más grasa a su perímetro. La eliminación completa del movimiento vítreo y mínima de la wholemount retina es crucial para el éxito del experimento.

Los agonistas de los receptores de glutamato permeables al calcio expresadas por CGR tales como N-metil-D-aspartato (NMDA), 24,25 α amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propionato (AMPA) y de tipo kainato receptores de glutamato ionotrópicos 26-29, se pueden utilizar para evocar la entrada directa de calcio, así como proporcionar un estímulo despolarizante que activa VGCCs. La utilización de tales agonistas puede conducir a una noUniform respuesta debido a la expresión diferencial de los subtipos de receptores de glutamato a los diferentes tipos de CGR. Microscopía de dos fotones también se puede utilizar para investigar las señales de calcio de luz evocado en RGC 30 y sus dendritas 31.

Etiquetado selectivo de CGR se logró debido a las propiedades impermeables a la membrana del indicador de calcio sal pentapotásico colorante Fluo-4. Indicador de calcio colorantes dextrano conjugado también se han utilizado para etiquetar selectivamente CGR y sus axones a través de inyecciones intrarretinianas en conejo y rata 32 33. En ambos estudios, el etiquetado selectivo de RGC y sus axones se logró a través de inyecciones intrarretinianas del colorante indicador de calcio-dextrano conjugado, seguido por una incubación de 2 h en conejo 32 o de una incubación de 7 horas en la rata 33. A pesar de ofrecer un período de incubación adecuado para garantizar un etiquetado uniforme en la retina, tales métodos resultan en un aumento de etiquetado de CGR y suaxones más cercanos al sitio de la inyección en comparación con el etiquetado escasa en las regiones distales al sitio de inyección. Como se discutió en Baldrige (1996), el etiquetado no uniforme en el sitio de la inyección se ha atribuido a etiquetado difusional del soma como resultado de la absorción de colorante en el (corte) dendrita expuesta, mientras que el etiquetado en las regiones distales es probablemente debido al transporte retrógrado de captación del colorante en el axón expuesta 32. Nuestra técnica proporciona métodos mejorados para aumentar etiquetado uniforme de la CGR y sus axones y reducir al mínimo el período de incubación requerido.

El presente método colorante de carga proporciona una estrategia alternativa a las técnicas convencionales, tales como carga a granel y la electroporación que resultan en la carga no específica de las células amacrinas desplazadas en la capa de células ganglionares. Con la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos que expresan tdTomato o EGFP bajo el control de promotores que son en poblaciones específicas de células ganglionares 34-38, Applicati futurasons de esta técnica pueden incluir estudios de imagen de calcio de los subtipos específicos de células ganglionares de la retina.

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Disclosures

Los autores no tienen revelaciones.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. S. Stella y Helen Vuong de contribuciones para el protocolo de imágenes de calcio. Agradecemos Hojas Dr. K. para el rodaje de las escenas de la entrevista. Agradecemos al Dr. Arlene Hirano por sus comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto de investigación y desarrollo se llevó a cabo por los autores en la Escuela David Geffen de Medicina en UCLA y es posible gracias a un acuerdo de contrato que se adjudicó y administrado por el Comando de Investigación y Material Médico del Ejército de EE.UU. (USAMRMC) y la tecnología de la telemedicina y Avanzado Centro de Investigación (TATRC), en Fort Detrick, MD con el Número de Contrato: W81XWH-10-2-0077. El apoyo a estos estudios también provino de NIH EY04067 y opiniones de Mérito VA (NB). BCN es un VA Carrera del Investigador Científico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina
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Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

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