Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Abstract

Dans cet article, nous décrivons les outils, les réactifs et les mesures concrètes qui sont nécessaires pour: 1) la préparation réussie de rétines wholemount pour l'immunohistochimie et, 2) l'imagerie calcique pour l'étude de la tension fermée canal de calcium (CCAGV) signalisation médiée de calcium dans la rétine cellules ganglionnaires. Procédé de formation d'image de calcium, nous décrivons des questions relatives au chargement contourne non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires.

Introduction

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) expriment L, N, P / Q et T de type CCAGV tel que déterminé par le blocage pharmacologique de ces composants de la cellule entière canal Ca courant 1,2. CCAGV sont des protéines transmembranaires multimères qui sont impliqués dans la libération du transmetteur, la transcription des gènes, régulation cellulaire et la plasticité synaptique 3,4,5. VGCCs fonctionnels sont constitués d'au moins trois catégories distinctes de sous-unités: grandes, une α transmembranaires formant des pores sous-unités qui établissent des propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal, principalement extracellulaire auxiliaire α 2 δ de sous-unités et sous-unités β intracellulaires. Les deux derniers complexes sous forme de hétéromères avec différentes sous-unités α 1 et modifier la cinétique de déclenchement et le trafic des canaux à la membrane plasmique 6.

Au cours des dernières décennies, de nombreuses techniques ont été utilisées pour étudier la protéine expression, comme l'immunohistochimie, dosage immuno-enzymatique, une analyse Western et la cytométrie en flux. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'anticorps spécifiques pour la détection d'une protéine d'intérêt donnée et fournissent des outils puissants pour la localisation et la distribution des protéines spécifiques dans différents tissus. Les techniques utilisées pour détecter et quantifier des taux d'une protéine particulière d'expression d'ARNm telles que l'analyse par transfert de Northern, RT-PCR en temps réel quantitative RT-PCR, l'hybridation in situ, des puces à ADNc et essai de protection de ribonucléase offrent une approche alternative lorsque les anticorps ne sont pas facilement disponibles ou si les niveaux d'une protéine particulière d'expression est faible 7. Toutefois, une limitation de l'utilisation de ces techniques moléculaires est l'identification spécifique d'une séquence de gène.

Pour localiser les protéines de la rétine, l'immunohistochimie peut être effectuée sur les rétines wholemount. En raison de l'accessibilité des CGR, le wholemountpréparation fournit une excellente plateforme pour étudier la localisation des protéines spécifiques à la soma RGC et leurs axones.

En plus de leur localisation, des propriétés fonctionnelles des CGR dans VGCCs peuvent être démontrées par l'utilisation de techniques d'imagerie de calcium. Nous décrivons un protocole d'imagerie du calcium pour marquer sélectivement CGR avec un colorant indicateur du calcium à mesurer la dynamique du calcium intracellulaire. La contribution des différents VGCCs au signal de calcium dans différents compartiments cellulaires peut être isolé à l'aide de bloqueurs des canaux Ca-spécifique de sous-typage.

Peut-être l'un des aspects les plus bénéfiques de la technique d'imagerie de calcium décrite ici est la possibilité d'enregistrer en même temps et indépendamment l'un de plusieurs CGR et de leurs axones. Bien que de nombreuses techniques physiologiques, telles que l'enregistrement de l'ensemble de serrage de plaque de cellule, de fournir des enregistrements de haute résolution temporelle des courants membranaires, l'origine somatique ou axonale des thescourants électroniques enregistrées ne peuvent pas être victimes de discrimination et les enregistrements ne peuvent être faites à partir d'un seul neurone à la fois. matrices électrodes multiples (AME) sont capables d'enregistrer en même temps des pointes de nombreuses cellules, mais ne peuvent ni détecter ni discrimination de l'activation, par exemple, les différents sous-types de canaux calciques. Meas préférentiellement enregistrer à partir de cellules qui sont situées à proximité immédiate de l'électrode 8 et enregistrement donné à partir de cellules qui produisent des grandes pointes 9. Méthodes d'imagerie optique fournissent une stratégie alternative pour permettre aux enregistrements simultanés et indépendants des populations entières de cellules qui peuvent être intégrés avec les informations obtenues à partir de micro-électrodes d'une cellule unique et le patch enregistrement de serrage et l'enregistrement de la MEA. Bien que les techniques d'imagerie de calcium décrits ici ont été utilisées pour étudier la dynamique de calcium de CGR, patch clamp et AME peuvent aussi être utilisés en parallèle pour élucider les courants ioniques et les propriétés de dopage de CGR.

10, notre objectif était d'utiliser une technique de chargement qui marque sélectivement CGR avec un colorant indicateur de calcium synthétique dans un préparation wholemount. Bien synthétiques colorants indicateurs de calcium fournissent une excellente plate-forme pour l'étude de la dynamique de calcium intracellulaire, son utilisation généralisée a été entravée par l'impossibilité de charger efficacement les populations spécifiques de neurones dans un réseau donné. Beaucoup de techniques telles que le chargement en vrac 11 et l'électroporation 8,12 ont été réalisées pour charger des populations entières de cellules, cependant, ces techniques ne sont pas discriminatoires entre les différents types de cellules spécifiques. Génétiquement codés indicateurs de calcium offrent la possibilité de marquer sélectivement les populations spécifiques de cellules, cependant, de tels procédés exigent la production d'animaux transgéniques 13. Notre technique décrit une méthod étiqueter sélectivement CGR dans la préparation wholemount par fibre injection nerf de la souche d'un colorant indicateur de calcium.

Pris ensemble, les techniques structurelles et physiologiques décrites dans cet article fournissent une plate-forme pour étudier la localisation et la contribution des VGCCs au signal de calcium dans les CGR et leurs axones.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices pour le bien-être des animaux de laboratoire émises par la politique US Public Health Service sur Human Care et l'utilisation des animaux de laboratoire et l'Université de Californie-Los Angeles (UCLA) Comité de recherche animale. Mâle et femelle adultes rats Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre l'âge de 3-5 semaines ont été utilisés.

1. animaux et Préparation des tissus pour Wholemount Retina et le Protocole immunohistochimie

  1. Préparer les matériaux et outils suivants: Une loupe binoculaire, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope.
  2. Euthanasier le rat dans une chambre fermée par anesthésie profondément les animaux avec 1-3% d'isoflurane suivie par décapitation avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l'iris et les placer dans une boîte de Petri contenant la solution extracellulaire. Hibernate A, Ames moidium ou solutions physiologiques sont recommandés.
  3. [Étape facultative si le remblayage des CGR avec Fluo-4 est souhaitée]. Effectuer l'étiquetage Fluo-4 comme décrit dans les étapes 2.3-2.4.
  4. Utilisation du microscope à dissection (d'intensité lumineuse: 1,6 x 10 8 / mm 2 photons ⋅sec), retirer la cornée en coupant la face du globe oculaire. Retirez l'objectif et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince. Pour retirer le corps vitré, stabiliser le globe oculaire en maintenant la sclérotique fermement avec une pince. Retire la base du vitré vers le centre de la rétine de l'autre pince. La préparation à ce stade est appelé l'œilleton, qui est utilisé pour cryosections. Plus de détails sur cryosections peuvent être trouvés dans les références 14,15.
  5. Retirer la rétine de l'œilleton. Ensuite, faire quatre coupes pour permettre la rétine à plat. Monter doucement la rétine sur une lame de microscope avec le photorécepteur couche vers le haut. Ajouter une goutte de solution de la rétine et mettre CEpapier filtre llulose sur la rétine. Une fois la rétine attache au papier filtre, placer la rétine remise en solution. Si nécessaire, aplatir la rétine avec un pinceau ou une pince.
  6. Placez les rétines wholemounted dans 4% PFA pendant 10-15 min pour la fixation.
  7. Laver les rétines wholemounted trois fois pendant 30 minutes dans 0,1 M de tampon phosphate (PB), pH 7,4. Bloquer les rétines avec 5% de sérum normal de chèvre ou de sérum d'âne à 0,1 PB contenant 0,3% de Triton X-100 et 0,1% de NaN 3 à 4 ° C pendant une nuit. Nous recommandons un volume final de 500 pl pour toutes les étapes d'économiser de blocage des solutions et des anticorps.
  8. Le lendemain, incuber les échantillons entiers de la rétine avec les principaux anticorps 5-7 jours à 4 ° C. Des dilutions optimales doivent être déterminées par l'utilisateur.
  9. Laver les rétines 3 x 30 min dans 0,1 M de PB et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans l'anticorps secondaire conjugué à un fluorophore correspondant qui est dirigé contre l'espèce de l'anticorps primaire (concentration de 1: 1000).
  10. Après trois derniers lavages de 30 minutes chacun avec PB, monter les rétines dans un milieu de montage. Sceller les lamelles avec du vernis à ongles pour un stockage prolongé. Conserver les échantillons à 4 ° C et protéger de la lumière.

2. marquage des cellules ganglionnaires et des axones à Rat Wholemount rétines avec un colorant indicateur de calcium

  1. Préparer 1000 ml de Ringer de mammifère contenant (en mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 de CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, NaHCO 3 25, glucose 10 et barboter avec 95% O 2/5% CO ­ 2.
  2. Effectuer la dissection comme décrit dans les étapes 1.2-1.4.
  3. Pour charger les cellules rétiniennes ganglionnaires (CGR) et leurs axones avec un colorant indicateur de calcium, injecter 0,5 pi de Fluo-4 sel de pentapotassium (40 mM d'achat d'actions en H 2 O) dans le nerf souche optique d'environ 1 mm en arrière du globe oculaire à l'aide d'une seringue . Pour mesurer dynamique augmente dans la cellule de ganglion [Ca 2 + i un indicateur avec une forte affinité, tels que Fluo-4 avec sa valeur de Kd de 345 nM, est optimal. Fluo-4 offre l'avantage supplémentaire d'avoir une efficacité quantique très élevée résultant en une augmentation d'émission de> 100 fois lorsqu'il est lié au calcium.
  4. Placez l'œilleton dans barboter avec 95% de O 2/5% de CO mammifères Ringer ­ 2 pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.

Protocole d'imagerie 3 de calcium pour les cellules ganglionnaires de la rétine et des axones.

  1. Retirer l'œil, le cristallin et vitreux comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Isoler la rétine de l'œilleton et la diviser en quadrants. Mont côté des cellules ganglionnaires d'un quadrant sur une lame de verre et d'utiliser une grille harpe de tranche pour le stabiliser. Gardez les autres morceaux adaptés à l'obscurité dans barboter avec 95% de O 2/5% de CO mammifères Ringer ­ 2 sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
  2. Superfuse la chambre d'enregistrement avec la solution de Ringer et mammifèresmaintenir la solution en continu avec barbotage de 95% O 2/5% CO 2.
  3. L'image du tissu sous le microscope. Faire des expériences à température ambiante (~ 23 ° C) ou à atteindre des températures physiologiques en chauffant la phase, le chauffage du bain d'eau sous le spécimen ou l'application d'air chaud à la surface de l'échantillon.
    Remarque: Il est important de noter que de nombreuses fonctions cellulaires sont réglementés par la température, qui joue un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie intracellulaire 16. Cependant, l'introduction de mesures de réchauffement peut augmenter le taux de photoblanchiment, l'évaporation de la dérive de la moyenne et de concentration causée par la dilatation thermique 17. L'utilisation de la température ambiante diminue intracellulaire cloisonnement de Fluo-4, 18.
  4. Effectuer un contrôle de deux impulsions à haute K + appariés en l'absence de médicaments. Dépolariser CGR et RGC axones en augmentant la [K +] o de 3 à 60 mm pour 33 sec pendant chaque impulsion pour activerVGCCs avec un système de surfusion entraînée par gravité huit canaux. Réduire Na + par 57 mM de maintenir isosmolarity dans la solution élevée de K +.
  5. Évaluer la contribution des différents VGCCs au signal de calcium avec l'utilisation des inhibiteurs généraux ou spécifiques canaux Ca. Par exemple, la réduction du signal de calcium après l'administration d'un bloqueur du canal calcique non-spécifique, de cobalt, à condition d'une mesure semi-quantitative de la contribution des VGCCs au K + élevé du signal de calcium -evoked.
  6. Acquérir des valeurs d'intensité de fluorescence en plaçant une région d'intérêt (ROI) dans les CGR d'intérêt (Figure 2).
  7. Normaliser la variation de l'intensité de fluorescence produite par le second pic élevé de K + à la variation produite par le premier pic élevé de K +. Puis, pour tester des inhibiteurs spécifiques des canaux calciques, les médicaments uniquement appliquer pendant la seconde impulsion haute K + et une paire de normaliser cette pointe contrela première valeur de crête. Pour mesurer l'effet du médicament sur ​​le pic élevé de K +, de diviser l'amplitude du second pic K + par celle de la première. L'analyse doit être effectuée sur ces valeurs par rapport à leurs témoins correspondants dérivés de K + haute pics appariés mesurée en l'absence de médicament.
  8. Acquérir des images à intervalles de 5 secondes. Pour éviter photo-blanchiment, garder l'excitation laser aussi bas que possible. Fournir une excitation par la ligne 488 nm du laser à argon, tandis que le tube photomultiplicateur collecte l'émission de fluorescence au moyen d'un filtre LP 505 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunomarquage avec des anticorps spécifiques fournit une plate-forme pour étudier la localisation des protéines d'intérêt particulier dans la rétine et la technique d'imagerie de calcium permet l'étude de la contribution des VGCCs à la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

En utilisant un anticorps dirigé contre les RBPMS de protéines des cellules ganglionnaires (protéine de liaison de l'ARN avec le raccordement multiple) qui marque sélective CGR 19, nous avons pu montrer que l'étiquetage Fluo-4 est limitée aux cellules ganglionnaires (figure 1). Stump-injection ne conduit pas à l'étiquetage de toutes les cellules ganglionnaires comme on pouvait s'y attendre de cette technique.

Un anticorps polyclonal de lapin a été généré contre l'extrémité N-terminale du polypeptide RBPMS (RBPMS 24.4), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, par un fournisseur commercial (tableau 1). RBPMS est hautement conservée parmi les mammifères et la séquence du polypeptide utilisé pour l'immunisation est identique chez la souris, le rat, le singe et l'homme (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). sérums de lapin ont été recueillis après la vaccination et purifié par affinité en utilisant une colonne d'affinité polypeptide RBPMS. L'anticorps purifié par affinité a été montré que immunocoloration des cellules ganglionnaires dans la rétine de souris et de rat. Pour évaluer la spécificité de la coloration immunologique RBPMS, un contrôle de pré-absorption a été réalisée avec l'anticorps de lapin. En bref, l'anticorps RBPMS a été dilué dans 0,1 M de PB contenant 0,5% de Triton X-100 et on mélange avec le polypeptide RBPMS à une concentration finale de 1 pg / ml pendant 2 heures à température ambiante. Aucun immunomarquage RBPMS était présent dans des coupes de tissus incubées avec des anticorps de lapin à préabsorbé RBPMS et transformés par des techniques immunohistochimiques standard.

s.jpg "width =" 600 "/>
Figure 1: post-hoc immunocoloration avec des anticorps contre les protéines RBPMS RGC (rouge) pour afficher Fluo-4 (vert) pour la localisation des cellules ganglionnaires Alexa 568 Un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin a été utilisé.. Barre d'échelle: 20 mm.

techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la contribution des VGCCs au signal de calcium dans les CGR et leurs axones. Les valeurs de l'intensité de fluorescence ont été acquis en plaçant sur ​​les régions d'intérêt d'intérêt CGR (figure 2).

Figure 2
Figure 2: Afin d'obtenir des valeurs d'intensité de fluorescence, des ROI ont été placés sur le corps cellulaire et / ou des axones Barre d'échelle cellules ganglionnaires: 50. Mm.

Le sel de Fluo-4 a été utilisé pour marquer et leurs axones CGR (figure 3).


Figure 3: sous-types de CCAGV qui contribuent à la signalisation du calcium dans les corps cellulaires des cellules ganglionnaires et leurs axones. (A) de l'image confocale d'un wholemount rétine au niveau de base. CGR et RGC axones peuvent être vus étiquetés avec fluo-4. (B) Les signaux fluorescents provenant d'un seul soma RGC démontrer l'augmentation de l'intensité moyenne de fluorescence induite par impulsions paires de haut K + (60 mm) solution de bain et la réduction subséquente de fluorescence en présence de cobalt au cours de la seconde impulsion. La barre d'échelle A: 20 mm.

Le système Zeiss LM5 Pascal a été mis à capturer des images à un taux de 5 sec de cadre et chaque analyse complète du cadre a pris 1,57 secondes aux réglages utilisés. Une zone de collecte de 318 um x 318 um a été inclus dans la région balayée de 512 x 512 pixels donnant une superficie de 0,385 um 2 par pixel. Ces paramètres peuvent être modifiés en fonction de la résolution souhaitée. Le système utilise un laser de 25 mW argon pour l'excitation de 488 nm. Nous avons utilisé cette ligne à 3% de la puissance. La saturation a été minimisée en sélectionnant d'abord la concentration la plus faible du colorant indicateur de calcium qui a donné les réponses robustes au stimulus dépolarisant et ensuite en réduisant le gain de sortie. La réduction de la puissance du laser a permis d'éviter le blanchiment. concentration de l'indicateur n'a pas été mesuré. L'étalonnage de l'imagerie non-ratiométrique est possible avec l'utilisation d'ionophores calciques, mais la technique de remblayage peut travailler avec des colorants ainsi ratiométriques. Pour déterminer la concentration optimale de l'indicateur, nous avons comparé l'évolution de la dépolarisation de la fluorescence provoquée par les concentrations de souche injection de Fluo-4 allant de 1 à 40 mM. ROI circulaires et ovales ont été établis autour de CGR et de leurs axones, qui présentaient respectivement l'intensité de fluorescence stable. RGC et axones qui dérivaient surse concentrer en raison du mouvement causé par surfusion n'ont pas été retenues.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit deux techniques différentes: 1) L'immunohistochimie pour afficher Fluo-4 localisation des cellules ganglionnaires de la rétine dans des échantillons entiers, et 2) l'imagerie de calcium pour analyser la dynamique de calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

L'immunohistochimie en utilisant des échantillons entiers a été utilisé pour révéler la localisation des protéines dans la rétine 20-23 rongeur. Cependant, il ya quelques limitations. La qualité de la coloration dépend fortement de la capacité de l'anticorps à reconnaître son antigène respectif et sa capacité à pénétrer le tissu rétinien de la couche d'intérêt particulier. Ces problèmes peuvent être améliorées en augmentant la période d'incubation dans l'anticorps primaire par un maximum de sept jours, l'augmentation de la concentration de Triton-X et / ou l'incubation de la rétine sans le papier filtre afin de permettre la diffusion de l'anticorps à travers la couche des cellules ganglionnaires et les photorécepteurs. Une autre limite est le duratide concentration et de fixation. Certains anticorps fonctionnent mieux lorsque le tissu est fixé pendant une heure, tandis que d'autres anticorps besoin d'une période de fixation plus courte. De même, alors que certains anticorps qui fonctionnent le mieux dans 4% PFA fixation, d'autres fonctionnent mieux à des concentrations réduites. Il est recommandé que l'utilisateur de déterminer la durée optimale de la fixation et de la concentration, la durée d'incubation, la concentration de Triton-X, ainsi que la concentration de l'anticorps primaire pour des résultats optimaux.

Imagerie de calcium a été utilisé pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones. Surfusion des agents de blocage CCAGV évaluation de l'efficacité du blocage relatif des médicaments et la présence de différents sous-types de canaux Ca autorisé. Dans le cas où les axones CGR et ne répondent pas à haute K +, essayer de réduire la concentration de l'indicateur de calcium de pigment, de fortes concentrations peuvent conduire à saturation. Une élimination incomplète du vitrépeut également agir comme une barrière, en empêchant élevé de K + à partir de la réalisation des CGR et de leurs axones. En outre, le défaut de monter correctement la harpe au-dessus de la rétine peut entraîner le déplacement, entraînant une incapacité d'obtenir des valeurs d'intensité de fluorescence. Si la rétine continue à se déplacer, retirer délicatement la harpe, sécher la zone entourant la rétine et remonter la harpe en ajoutant plus de graisse sur son périmètre. L'élimination complète de la circulation du vitré et minimale de la rétine wholemount est cruciale pour le succès de l'expérience.

Les agonistes des récepteurs de glutamate de calcium perméable exprimées par CGR tels que la N-méthyl-D-aspartate (NMDA), 24,25 α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-propionate (AMPA) des récepteurs de type kaïnate et ionotropes récepteurs du glutamate 26-29, peuvent être utilisés pour évoquer l'entrée directe de calcium ainsi que de fournir un stimulus de dépolarisation qui active VGCCs. L'utilisation de tels agonistes peuvent conduire à une nonUniform réponse due à l'expression différentielle des sous-types de récepteurs de glutamate aux différents types de CGR. Microscopie à deux photons peut également être utilisé pour étudier les signaux lumineux de calcium évoqués dans CGR 30 et leurs dendrites 31.

Marquage sélectif des RGC a été obtenu en raison des propriétés de la membrane imperméants du sel pentapotassique colorant indicateur du calcium Fluo-4. Indicateur de calcium colorants dextrane conjugué ont également été utilisés pour marquer de manière sélective et leurs axones CGR par injections intrarétiniennes chez le lapin et le rat 32 33. Dans les deux études, le marquage sélectif des CGR et leurs axones a été obtenue par l'intermédiaire d'injections de intrarétiniennes le colorant indicateur de calcium de dextrane conjugué, suivie d'une incubation de 2 h à 32 lapin ou une incubation de 7 h à 33 rat. En dépit de fournir une période d'incubation suffisante pour assurer un étiquetage uniforme dans la rétine, ces procédés se traduisent par une augmentation de l'étiquetage et leur CGRaxones les plus proches du site d'injection par rapport à l'étiquetage clairsemé dans les régions distales du site d'injection. Comme on le verra dans Baldrige (1996), à l'étiquetage non uniforme au niveau du site d'injection a été attribuée à l'étiquetage par diffusion de la soma à la suite de l'absorption de colorant à la (réduction) dendrite exposé, tandis que l'étiquetage dans les régions distales est probablement dû à un transport rétrograde de l'absorption de la teinture à l'axone exposés 32. Notre technique des procédés améliorés pour accroître l'étiquetage uniforme des CGR et leurs axones et de réduire au minimum la période d'incubation nécessaire.

Procédé de chargement de colorant présent fournit une stratégie alternative aux techniques classiques telles que le chargement en vrac et qui se traduisent par électroporation chargement non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires. Avec la disponibilité de lignées de souris transgéniques exprimant tdTomato ou EGFP sous le contrôle de promoteurs qui sont des populations de cellules ganglionnaires, 34-38 spécifiques futurs applications de cette technique peut comporter des études d'imagerie de calcium de sous-types spécifiques de cellules ganglionnaires de la rétine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont aucune divulgation.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr S. Stella et Helen Vuong à contributions pour le protocole d'imagerie de calcium. Nous remercions le Dr K. Feuilles pour filmer les scènes d'entrevue. Nous remercions le Dr Arlene Hirano pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce projet de recherche et développement a été menée par les auteurs à la David Geffen School of Medicine à UCLA et est rendu possible par un accord de contrat qui a été attribué et géré par le Commandement de la recherche médicale et du matériel de l'armée américaine (USAMRMC) et la technologie de télémédecine et avancée Centre de recherche (TATRC), à Fort Detrick, dans le Maryland, sous le numéro de contrat: W81XWH-10-2-0077. Le soutien à ces études sont également venus de NIH EY04067 et un examen du mérite VA (NB). PNE est une carrière chercheur VA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Neuroscience Numéro 92 immunohistochimie anticorps fluo-4 imagerie calcique cellules ganglionnaires la rétine le rat
Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter