Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Abstract

Bu yazıda araçları, reaktifler ve için gerekli olan pratik adımları açıklar: imünohistokimya için Wholemount retina 1) başarılı bir hazırlık ve retinal kalsiyum sinyalini aracılı voltaj kapılı kalsiyum kanalı (VGCC) çalışmasında 2) kalsiyum görüntüleme ganglion hücrelerinin. Kalsiyum görüntüleme yöntemi biz ganglion hücre tabakası yerinden amacrine hücreleri olmayan spesifik yükü ile ilgili alt ettiği durumlar açıklanmaktadır.

Introduction

1,2 akım kanalı Ca tam hücrenin, bu bileşenlerin farmakolojik blokajı yoluyla belirlendiği gibi, retinal ganglion hücrelerinin (RGCs) L, N, P / Q-ve T-tipi VGCC ifade eder. VGCC verici sürümü, gen transkripsiyonu, hücre düzenleme ve sinaptik plastisite 3,4,5 katılan transmembran Multimerik proteinlerdir. 1 gözenek ve kanal biyo-fiziksel ve farmakolojik özellikler, esas olarak, hücre dışı yardımcı α 2 δ alt birimleri ve hücre içi β alt birimi tespit alt birimleri oluşturan α büyük, zar: Fonksiyonel VGCCs alt ünitelerinin en az üç farklı sınıflardan oluşur. Farklı α 1 alt birimleri ile son iki şekilde heteromerik kompleksleri ve plazma membranı 6 kanalların yolluk kinetik ve kaçakçılığı değiştirebilir.

Son on yılda, birçok teknik protein Expre incelemek için istihdam edilmiştirBu İmmünohistokimya, enzime bağlı immünosorbent deneyi batı analizi ve akış sitometresi olarak salgılanması. Bu teknikler, ilgi konusu bir proteinin tespit edilmesi için spesifik antikorların kullanılmasını gerektirir ve farklı dokular içindeki yerine ve özel proteinlerin dağıtılması için güçlü bir araç sağlar. Antikorları kolayca olmadığında bu tür kuzey leke analizi gibi özel bir proteinin mRNA ifade seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılan teknikler, RT-PCR, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR, in situ hibridizasyon, cDNA mikrodizileri ve ribonükleaz koruma deneyi için alternatif bir yaklaşım sağlar özel bir proteinin ya da eğer mevcut ekspresyon seviyeleri 7 düşüktür. Ancak, bu tür moleküler teknikler kullanılarak bir sınırlama gen dizisinin gerekli tanımlanmasıdır.

Retinada proteinleri lokalize etmek için immünohistokimya wholemount retina üzerinde gerçekleştirilebilir. RGCs erişilebilirlik, wholemount nedeniyleHazırlık RGC somata ve akson özel proteinlerin yerelleştirme incelemek için mükemmel bir platform sağlar.

Bulundukları bölgeye ek olarak, RGCs VGCCs bazı fonksiyonel özellikleri kalsiyum görüntüleme teknikleri kullanılarak ispat edilebilir. Biz seçici hücre içi kalsiyum dinamiklerini ölçmek için bir kalsiyum gösterge boya ile RGCs etiketlemek için bir kalsiyum görüntüleme protokol açıklar. Çeşitli hücre bölmesi içinde bulunan kalsiyum sinyaline farklı VGCCs katkısı alt tiplerine spesifik Ca kanal blokerlerinin kullanımı ile izole edilebilir.

Belki burada tarif kalsiyum görüntüleme tekniğinin en yararlı yönlerinden biri aynı anda ve birbirinden bağımsız birden fazla RGCs ve aksonlarından kaydetmek için yeteneğidir. Bu Tam hücre yama kenetleme kayıt gibi bir çok fizyolojik teknikleri, yüksek zamansal çözünürlüğü membran akımların kayıtları, somatik veya thes aksonal kaynağı sağlamak rağmenKaydedilen E akımları ayrımcılık olamaz ve kayıtları bir seferde sadece tek bir nöron yapılabilir. Multielectrode diziler (ölçüm) eş zamanlı olarak bir kısım hücrelerde ani kaydetme özelliğine sahiptir, fakat tespit veya aktivasyonunu ayırt, kalsiyum kanallarının, örneğin, farklı alt tipler kaldırılmaz. Tercihen büyük sivri 9 oluşturmak hücrelerinden belirli bir elektrot 8 ve kaydetmek için yakın bir yerde bulunduğu bir hücre kayıt ölç. Optik görüntüleme yöntemleri, tek hücreli mikro elektrot ve yama kelepçe kayıt ve MEA kayıt elde edilen bilgilerin entegre edilebilir hücrelerin bütün popülasyonlarının eşzamanlı ve bağımsız kayıtları etkinleştirmek için alternatif bir strateji sağlamak. Burada açıklanan kalsiyum görüntüleme teknikleri RGCs kalsiyum dinamiklerinin incelenmesi için kullanılmıştır, ancak, yama kelepçe ve ÇÇA daha da iyonik akımları ve RGCs spike özelliklerini açıklamak için paralel olarak kullanılabilir.

10 retina farede ganglion hücre tabakasında nöronal nüfusun yaklaşık% 60'ını oluşturan bizim amacımız isteğe bağlı olarak bir sentetik kalsiyum endikatör boyası ile RGCs etiketler bir yükleme yapmak için teknik wholemount hazırlanması. Sentetik kalsiyum göstergesi boyalar hücre içi kalsiyum dinamikleri çalışma için mükemmel bir platform sağlar rağmen, yaygın kullanımı etkili belirli bir ağ içinde nöronların belirli popülasyonlarının yüklemek için yetersizlik tarafından engellenmiştir. Bu tür dökme yükleme 11 ve elektroporasyon gibi birçok teknik 8,12 hücre popülasyonları bütün Bununla birlikte, bu tür teknikler, özel hücre tipleri arasında ayrım yapamaz ve yüklemek için yapılmıştır. Genetik olarak kalsiyum göstergeler seçici hücrelerinin spesifik popülasyonlarının etiket olanağı sağlar kodlanmış Bununla birlikte, bu yöntemler, transgenik hayvanların 13 üretilmesini gerektirir. Bizim teknik bir yöntemii açıklard seçici bir kalsiyum gösterge boyasının optik sinir güdük enjeksiyon yoluyla Wholemount hazırlanmasında RGCs etiketlemek için.

Birlikte ele alındığında, bu makalede özetlenen yapısal ve fizyolojik teknikleri RGCs ve akson olarak lokalizasyonu ve kalsiyum sinyali VGCCs katkısını incelemek için bir platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün deneyler İnsan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım ve Kaliforniya-Los Angeles Üniversitesi (UCLA) Hayvancılık Araştırma Komitesi ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri Politikası tarafından verilen deney hayvanlarının refahı için yönergelere uygun olarak yürütülmüştür. Erkek ve dişi Sprague-Davvley fareleri 3-5 haftalık yaş arasında (Charles River Laboratuarı, Wilmington, MA) kullanıldı.

Wholemount Retina ve İmmünhistokimya Protokolün 1. Hayvan ve Doku Hazırlama

  1. Bir diseksiyon mikroskobu, çok ince ipuçları, makas, selüloz filtre kağıdı, plastik pipet ve bir mikroskop lamı ile 2 forseps: Aşağıdaki malzemeleri ve araçları hazırlayın.
  2. Derin, bir giyotinle birlikte dekapitasyon% 1-3 izofluran ile anestezi hayvan tarafından kapalı bir odada sıçan öldürülür. Hücre dışı çözelti içeren bir Petri kabındaki iris makasları ve yerine bir çift gözleri çıkarın. Bir Ames Me Hazırdakireç, sodyum ya da fizyolojik çözeltiler tavsiye edilir.
  3. [İsteğe bağlı adım Flu-4 ile RGCs sepme isteniyorsa]. 2,3-2,4 adımları tarif edildiği gibi Fluo-4 etiketlenmesi.
  4. Mikroskop (ışık yoğunluğu: 1,6 x 10 8 fotonlar / mm 2 ⋅sec) kullanılarak, gözün ön keserek kornea çıkarın. Forseps ile retina iç yüzeyinden lens ve vitreus çıkarın. Vitreus kaldırmak için, bir forsepsi sıkıca sklerasına tutarak küresi stabilize. Yavaşça diğer forsepsi retinada merkezine doğru camsı baz soyun. Bu aşamada hazırlanması için kullanılan cryosections Göz yuvası olarak adlandırılır. Cryosections hakkında daha fazla ayrıntı referanslarda 14,15 bulunabilir.
  5. Göz yuvası gelen retina çıkarın. Sonra, dört keser retina düz koymak için izin yapmak. Yavaşça fotoreseptör kadar olan bir mikroskop lamı üzerine retinadaki. Retinaya çözümün bir damla ekleyin ve ce koymakretinaya llulose filtre kağıdı. Retina filtre kağıdı bağlanır başladığında, çözelti içinde retina yerleştirin. Gerekirse, bir fırça veya forseps ile retina düzleştirmek.
  6. Tespiti için 10-15 dakika boyunca% 4 PFA içine wholemounted retina yerleştirin.
  7. 0.1 M fosfat tamponu (PB), pH 7.4 içinde 30 dakika boyunca wholemounted retinalarında üç kez yıkayın. Gece boyunca 4 ° C 'de% 0.3 Triton X-100 ve% 0.1 NaN3 içeren 0.1 PB içinde% 5 normal keçi serumu ve eşek serumu ile retina bloke eder. Bu engelleme çözümler ve antikorları kurtarmak için tüm adımlar için 500 ul bir son hacme sahip önerilir.
  8. Bir sonraki gün, 4 ° C 'de primer antikor ile 5-7 gün retinae wholemounts inkübe edin. Optimal seyreltikleri kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
  9. PB 0.1 M retinaları 3 x 30 dakika yıkayınız ve primer antikor (konsantrasyon 1: 1000) ve türlerine karşı olan, ilgili fluorofor-konjuge sekonder antikor olarak 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
  10. PB ile 30 dakika her biri üç nihai yıkamadan sonra, orta montaj retina monte. Uzun süreli depolama için tırnak cilası ile lamelleri mühür. Mağaza numuneler, 4 ° C'de ve ışıktan korur.

Bir Kalsiyum Gösterge Boya ile Sıçan Wholemount retina ganglion hücrelerinin ve Aksonlar 2. Etiketleme

  1. % 95 O 2/5% CO ile fokurdatıldı memeli Ringer içeren 125 NaCl, 3 KCİ, 2 CaCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 (mM olarak) 1.000 ml ve 10 glükoz hazırlanması ­ 2.
  2. 1,2-1,4 adımları tarif edildiği gibi bir diseksiyon.
  3. Bir şırınga kullanılarak sırasında göz için yaklaşık 1 mm posterior optik sinir güdük içine Fluo-4 Pentapotassium tuzu (Y 2 O 40 mM stok), 0.5 ul, bir kalsiyum indikatör boyası ile, retinal bez hücrelerin (RGCs) ve aksonlar yük enjekte . [Ca gangliositi dinamik artışlarını ölçmek için 2+ böyle Flu-4 345 nM olan Kd ile yüksek afinite ile, bir gösterge, en uygunudur. Fluo-4 kalsiyum bağlandığmda> 100 kattan fazla bir emisyon artışı ile sonuçlanan çok yüksek kuantum verimi sahip olmanın sağladığı fazladan fayda sağlar.
  4. Memeli Ringer% 95 O kabarmış 2 /% 5 CO Göz yuvası yerleştirin ­ 2 karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.

Retina Ganglion Hücreleri ve Aksonlar 3. Kalsiyum Görüntüleme Protokolü.

  1. 1,1-1,4 adımda tarif edildiği gibi göz lens ve camsı çıkarın. Göz yuvası gelen retina yalıtmalı ve kadranlardan bölün. Dağı tek kadran ganglion hücre, bir cam slayt tarafı yukarı ve stabilize bir arp dilim ızgara kullanın. Koyu adapte diğer parçaları tutmak memeli Ringer% 95 O kabarmış 2 /% 5 CO ­ Daha sonra kullanmak için buz üzerinde 2.
  2. Memeli Ringer solüsyonu ile kayıt odasına Superfuse ve% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli köpüren çözüm tutmak.
  3. Görüntü mikroskop altında doku. Oda sıcaklığında (~ 23 ° C) ya da, deney yapma, sahne ısınma numunenin altında, su banyosu ısısı veya numunenin yüzeyine sıcak hava uygulanarak fizyolojik sıcaklıklar elde.
    Not: Bu, pek çok hücresel işlev, hücre içi homeostazın 16 sağlanması bakımından önemli bir rol oynar sıcaklığı ile düzenlenmiş olması dikkat etmek önemlidir. Ancak, ısınma önlemlerin tanıtımı, ısıl genleşme 17 neden orta ve odak kayması buharlaşmasını ışıkla oranını artırabilir. Oda sıcaklığında kullanımı Flu-4 18 hücre içi bölümlere ayrılmasını azaltır.
  4. Ilaçların yokluğunda iki eşleştirilmiş yüksek K + palslarının bir denetimi. Etkinleştirmek için her darbe sırasında 33 saniye için 60 mM 3 mM gelen o [K +] yükselterek RGCs ve RGH aksonlarını depolarizeSekiz kanal yer çekimi kontrolünde süperfüzyon sistemi VGCCs. Yükseltilmiş K + çözeltisi içinde isosmolarity korumak için 57 mM Na + azaltır.
  5. Genel ya da özel Ca kanal blokerlerinin kullanımı ile kalsiyum sinyaline farklı VGCCs katkısını değerlendirin. Örneğin, spesifik olmayan bir kalsiyum kanal tıkayıcı, kobalt verilmesinden sonra kalsiyum sinyal azalması, yüksek K + -evoked kalsiyum sinyali VGCCs katkısının bir yarı-nicel ölçümünü sağladı.
  6. (Şekil 2) ilgi RGCs çevresinde ilgi (ROI) bir bölge koyarak floresan yoğunluk değerlerini edinin.
  7. İlk, yüksek K + ile tepe tarafından üretilen değişiklik, ikinci yüksek K + doruğu tarafından üretilen floresan yoğunluğundaki değişim normalize. Sonra, belirli kalsiyum kanal blokerleri test için, sadece bir çiftinin ikinci yüksek K + darbesi sırasında ilaç uygulamak ve karşı tepe normalleştirmekilk tepe değeri. Yüksek K + ile bir tepe üzerinde ilacın etkisini ölçmek için, birinci ile ikinci bu K + tepe genliğinin, bölün. Analiz ilacın yokluğunda ölçülen eşleştirilmiş yüksek K + tepe elde ettikleri uygun kontrollere göre, bu değerler üzerinde yapılmalıdır.
  8. 5 sn aralıklarla görüntü kazanır. Foto-ağartma önlemek için, mümkün olduğu kadar düşük tutmak lazer uyarma. Photomultiplier tüp 505 nm LP filtresi aracılığıyla floresan emisyon toplarken, argon lazer 488 nm hattı ile uyarma sağlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spesifik antikorlar ile immün retina ve kalsiyum görüntüleme tekniği ilgi belirli proteinlerin lokalizasyonu incelemek için bir platform sağlar retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson olarak kalsiyum dinamiklerine VGCCs katkısının çalışmasına izin verir.

Ganglion hücre proteini RBPMS karşı selektif RGCs 19 etiketler (çoklu ekleme ile RNA bağlayıcı protein) bir antikor kullanarak, Fluo-4 etiketleme ganglion hücrelerinde (Şekil 1) ile sınırlı olduğunu gösterebilmişlerdir. Güdük-enjeksiyon bu tekniğin beklenen olabilir gibi tüm ganglion hücrelerinin etiketlenmesine yol açmaz.

Bir tavşan poliklonal antikor, bir ticari bir satıcıdan (Tablo 1), RBPMS polipeptit (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR N-terminal ile elde edilmiştir. RBPMS yüksek memeliler arasında muhafaza edilir ve polipeptit dizisi ise ikinci immünizasyon için, fare, sıçan, maymun ve insan (NCBI protein Bank özdeştir http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Tavşan serumları, bir polipeptid RBPMS eğim sütunu kullanılarak saf hale aşılama ve afinite aşağıdaki toplanmıştır. Eğilim saf hale getirilmiş antikor, fare ve sıçan retinasındaki ganglion hücresi immunostain gösterilmiştir. RBPMS immunosteyn özgüllüğünün değerlendirilmesi için, bir kontrol preabsorption tavşan antikoru ile gerçekleştirilmiştir. Kısaca, RBPMS antikor, oda sıcaklığında 2 saat süreyle 1 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda RBPMS polipeptid ile% 0.5 Triton X-100 ve karışık ihtiva eden 0.1 M, PB içerisinde seyreltildi. Resim RBPMS immun RBPMS standart immünohistokimyasal teknikler ile işleme tabi absorplanmış tavşan antikorları ile inkübe doku kesitlerinde mevcuttu.

s.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 1: RGC proteini RBPMS (kırmızı) karşı antikorlar ile post hoc immun ganglion hücrelerine Fluo-4 (yeşil) dağılımını gösteren hiç bir Alexa 568 keçi anti-tavşan ikincil antikoru kullanılmıştır.. Ölçek çubuğu: 20 mm.

Kalsiyum görüntüleme teknikleri RGCs ve akson kalsiyum sinyale VGCCs katkısını incelemek için kullanılır. Floresan şiddeti değerleri ilgi RGCs (Şekil 2) üzerine İB'leri yerleştirerek tarafından satın alındı.

Şekil 2
Şekil 2:. 50 mm floresan yoğunluk değerlerini elde etmek için, ROI ganglion hücre somata ve / veya akson Ölçek çubuğu üzerine yerleştirilmiştir.

Flu-4'in Pentapotassium tuz RGCs ve akson (Şekil 3) etiketlemek için kullanıldı.


Şekil 3: ganglion hücre somata ve akson kalsiyum sinyal katkıda VGCC alt tipler. (A) temel düzeyde bir Wholemount retinanın Konfokal görüntü. RGCs ve RGC aksonlar Fluo-4 ile etiketlenmiş görülebilir. (B), yüksek K + eşleştirilmiş nabız (60 mM) ile banyo çözeltisi ve ardından da indirgeme tarafından ortaya olarak ortalama floresan yoğunluğundaki artışı gösteren tek bir RGC somata floresan sinyalleri ikinci puls esnasında kobalt varlığında ışık vermiştir. A Ölçek çubuğu: 20 mm.

Zeiss LM5 Pascal sistemi 5 saniyelik bir kare hızında görüntü yakalamak için ayarlanmış ve her tam kare tarama kullanılan ayarlarla 1.57 sn aldı. 318 mikron x 318 mikron bir koleksiyon alanı 512 x 512 pi taranan bölgeye dahil edildipiksel başına 0.385 mikron 2 bir alanı veren xels. Bu ayarlar, istenen çözünürlüğe bağlı olarak değiştirilebilir. Sistem 488 nm uyarma için 25 mW Argon lazer kullanır. Biz 3% güçte bu satırı kullanılır. Doygunluk ilk kutupsalhk giderme uyarısı ile güçlü bir yanıt vermiştir ve daha sonra çıkış kazancını azaltarak kalsiyum endikatörü boyada en düşük konsantrasyonu seçerek azaltılmıştır. Lazer güç azaltılması beyazlatma önlemek için yardımcı oldu. Gösterge konsantrasyonu ölçülmüştür değildi. Olmayan rasyometrik görüntüleme Kalibrasyon kalsiyum ionofor kullanımı ile mümkündür, ancak dolgu tekniği yanı rasyometrik boyalarla birlikte çalışabilir. Uygun gösterge konsantrasyonunu belirlemek için, 1-40 mM arasında değişen Flu-4 stump enjekte konsantrasyonları ile floresanstaki depolarizasyon uyarılmış değişikliği karşılaştırdık. Dairesel ve oval ROI'ler istikrarlı floresan yoğunluğu sergiledi sırasıyla RGCs ve akson, etrafında çizildi. RGCs ve dışına sürüklendi aksonnedeniyle süperfüzyomu neden hareket odak seçilmemiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1) İmmünhistokimya retina wholemounts içinde ganglion hücrelerine Flu-4 yerelleştirme göstermek için, ve 2) Kalsiyum görüntüleme retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamikleri analiz etmek: Bu makalede, iki farklı teknikler tarif var.

Wholemounts kullanılarak immünohistokimya 20-23 retina kemirgen proteinlerin lokalizasyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Ancak, birkaç sınırlamalar vardır. Boyanma kalitesi, ilgili antijen ve ilgilenilen özel tabakasına nüfuz retina dokusunun kabiliyetini tanıyan antikorun yeteneğine dayanır. Bu sorunlar, ganglion hücre tabakası ile antikorun difüzyonuna olanak sağlamak üzere, filtre kağıdı olmadan yedi güne kadar bu primer antikor kuluçka süresinin belirgin Triton X konsantrasyonunu artırmak için ve / veya retina inkübe edilmesi ile geliştirilebilir ve fotoreseptör. Başka bir sınırlama durati olduğunuve tespit konsantrasyonu. Doku bir saat için sabit zaman diğer antikorlar kısa bir sabitleme dönemi gerektiren Bazı antikorlar, daha iyi çalışır. Bazı antikorlar% 4 PFA tespitte iyi çalışırken Benzer şekilde, diğerleri düşük konsantrasyonlarda daha iyi çalışır. Bu, kullanıcı için optimal süre ve tespit konsantrasyonu, inkübasyon süresi, Triton X konsantrasyonunun yanı sıra, en iyi sonuçlar için birincil antikor konsantrasyonunu belirlemek önerilir.

Kalsiyum görüntüleme retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson olarak kalsiyum dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır. VGCC bloke edici maddelerinin süperfüzyon ilaçların nispi engelleme etkinliği ve farklı Ca kanal alt tiplerinin varlığı değerlendirmesini sağladı. RGCs ve aksonlar, yüksek K + 'dan cevap vermeyen olması durumunda, yüksek konsantrasyonlar doymaya neden olabilir, kalsiyum endikatörü boya konsantrasyonunun azaltılması deneyin. Vitreus eksik çıkarılmasıAyrıca RGCs ve aksonlar ulaşan yüksek K + engelleyen bir bariyer olarak hareket edebilir. Buna ek olarak, uygun retina üzerinde durmak yapmamasıyla floresan yoğunluk değerlerini elde etmek için bir yetersizlik sonuçlanan hareket etmesine neden olabilir. Retina taşımaya devam ederse, dikkatlice retina çevresindeki bölgeyi kuru, arp kaldırmak ve çevresine daha fazla yağ ekleyerek harp yeniden monte edin. Retina wholemount bir vitreus ve minimal hareketin tamamen çıkarılması deney başarısı için çok önemlidir.

Örneğin N-metil-D-aspartat (NMDA) ve RGCs ifade kalsiyum geçirgen glutamat reseptörleri, 24,25 α-amino-3-hidroksi-5-metilizoksazol-4-propionat (AMPA) ve kainat reseptörleri tip agonistlerinin iyonotropik glutamat reseptörleri 26-29, kalsiyum girişini doğrudan uyandırmak gibi VGCCs aktive eden bir kutupsalhk giderme uyarısı temin etmek üzere kullanılabilir. Bu agonistlerinin kullanımı olmayan bir yol açabilirRGCs farklı tipte glutamat reseptör alt türleri ayırıcı ifade edilmesine bağlı -uniform yanıt. İki foton mikroskopi de RGCs 30 ve dendritler 31 ışık-uyarılmış kalsiyum sinyallerini araştırmak için kullanılabilir.

RGCs seçici etiketleme Fluo-4 Pentapotassium tuzu kalsiyum endikatörü boyada membran geçirgen olmayan özellikleri nedeniyle elde edildi. Dekstran-bağlı kalsiyum göstergesi boyalar da Tavşan 32 sıçan ve 33 olarak retina enjeksiyon yoluyla RGCs ve aksonlar etiketlemek için kullanılmıştır. Her iki çalışmada da RGCs ve akson seçici etiketleme tavşan 32 2 saatlik bir kuluçkadan veya sıçanın 33 bir 7 saat enkübasyonu takiben, dekstran-bağlı kalsiyum indikatör boyası retina enjeksiyonlar yoluyla elde edilmiştir. Retinada üniforma etiketleme sağlamak için yeterli bir kuluçka dönemi sağlayarak rağmen, bu tür yöntemleri RGCs ve artan etiketleme neden onlarınenjeksiyon yerinde yakın aksonlar enjeksiyon yerinde uzak bölgelerde seyrek etiketleme ile karşılaştırıldığında. Baldrige (1996), enjeksiyon bölgesinde muntazam olmayan etiketleme tartışıldığı gibi uzak bölgelerde markalama ise muhtemelen nedeni retrograd taşımaya, açıktaki (montaj) dendrit bir boya alımı sonucu soma difüzyon etiketleme atfedilmiştir maruz kalan akson 32 boya alımından itibaren. Bizim teknik geliştirilmiş yöntemler RGCs ve akson üniforma etiketleme artırmak ve gerekli kuluçka süresini en aza indirmek için sağlar.

Mevcut Boya yükleme yöntem olup, ganglion hücre tabakasında yerinden amacrine hücreleri spesifik olmayan yüklenmesi ile sonuçlanır, bu gibi hacimli yükleme ve elektroporasyon gibi bilinen tekniklerle farklı bir strateji sağlar. Belirli ganglion hücre popülasyonlarının 34-38 gelecek Uyg olan promoterlerin kontrolü altında ya da tdTomato EGFP ifade eden transjenik fare hatları olarak kullanılması ile,Bu tekniğin ons özel retina ganglion hücre alt tiplerinin kalsiyum görüntüleme çalışmaları içerebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir açıklama yok.

Acknowledgments

Biz kalsiyum görüntüleme protokole katkılarından dolayı Dr S. Stella ve Helen Vuong teşekkür ederiz. Biz röportaj sahneleri filme Dr K. Sheets teşekkür ederim. Biz el yazması onu yorumlar için Dr Arlene Hirano teşekkür ederim. Bu araştırma ve geliştirme projesi Teletıp ve İleri Teknoloji UCLA Tıp, David Geffen School yazarlar tarafından yürütülen ve US Army Medical Research & Levazım Komutanlığı (USAMRMC) tarafından verilen ve uygulanan bir sözleşme anlaşması ile mümkün yapılır ve Sözleşme Numarası altında MD Fort Detrick'te Araştırma Merkezi (TATRC),: W81XWH-10-2-0077. Bu çalışmalar için destek de NIH EY04067 ve VA Merit Şu (NB) geldi. NCB Bir VA Kariyer Araştırmacı olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Nörobilim Sayı 92 immünhistokimya antikor fluo-4 kalsiyum görüntüleme ganglion hücrelerinin retina sıçan
Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter