Summary
免疫组化协议，用于研究在视网膜特定蛋白质的定位。钙成像技术被用来研究视网膜神经节细胞及其轴突钙的动态。
Abstract
在本文中，我们描述了工具，试剂，并且需要的实际步骤：1）成功制备wholemount视网膜的免疫组化和，2）钙成像的电压门控性钙通道（VGCC）在视网膜介导的钙信号研究神经节细胞。钙成像方法，我们描述关于位移的无长突细胞在神经节细胞层的非特异性加载规避问题。
Introduction
视网膜神经节细胞（RGC的）表达L，N，P / Q-和T-型VGCC通过整个细胞的这些成分的药理学阻断测定Ca通道电流1,2。 VGCC是涉及递质释放，基因转录，细胞调节和突触可塑性3,4,5该跨膜多聚体蛋白。官能VGCCs是由至少三种不同类的亚基组成：大，跨膜α1孔形成在建立通道的生物物理和药理性质，主要是细胞外的辅助α2δ亚基和胞内β亚基的亚基。后两种形式的异配合不同的α 亚单位和改变门控动力学的渠道质膜6和贩运。
在最近的几十年中，许多技术已被用于研究蛋白质expre裂变，如免疫组织化学，酶联免疫吸附测定法，western分析和流式细胞术。这些技术需要使用特定的抗体对于感兴趣的给定的蛋白质的检测，并提供本地化和特异性蛋白质的分布在不同组织中的有力工具。用于检测和定量特定蛋白质的mRNA表达水平的技术，例如Northern印迹分析，RT-PCR，实时定量RT-PCR， 原位杂交，cDNA芯片和核糖核酸酶保护测定法提供了另一种方法，当抗体是不容易特定的蛋白质可用，或者表达水平低7。然而，一个限制，以使用这样的分子生物学技术是基因序列的所需鉴定。
在视网膜本地化蛋白，免疫组织化学可wholemount视网膜进行。由于视网膜神经节细胞的可及性，wholemount准备提供给特定蛋白质的本土化研究，以研资局胞体和轴突一个很好的平台。
除了其定位，VGCCs在视网膜神经节细胞的一些功能特性可以通过使用钙成像技术来证明。我们描述了钙成像协议选择性标记视网膜神经节细胞与钙指示剂染料测量细胞内钙离子动态。不同VGCCs来在不同的细胞区室中的钙信号的贡献可以分离与使用亚型特异性钙通道阻滞剂。
也许这里描述的钙成像技术的最有利的方面之一是，从多个视网膜神经节细胞和其轴突同时和独立地记录的能力。虽然许多生理技术，如全细胞膜片钳记录，提供膜电流的高时间分辨率的录音，躯体或采取这些轴突源记录ê电流不能歧视和录音只能从每次的单个神经元的进行。多电极阵列（MEAs）中能够从许多细胞同时记录的尖峰，但既不能检测或识别的激活，例如，不同的钙离子通道的亚型。 MEAS从细胞位于接近该给定的电极8和记录从细胞中产生大的尖峰9优先记录。光学成像方法提供了一种替代的策略，使细胞的整个种群可与从单细胞微电极和膜片钳记录和MEA记录中获得的信息结合起来的同时和独立记录。虽然这里所描述的钙成像技术被用于研究视网膜神经节细胞的钙动力学，膜片钳和多边环境也可使用在平行于进一步阐明离子电流和视网膜神经节细胞的动作电位发放。
综上所述，本文中介绍的结构和生理技术提供研究视网膜神经节细胞和其轴突的定位和VGCCs的钙信号的作用的平台。
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Protocol
所有实验均进行了按照由人类善待实验动物和加州大学洛杉矶分校（UCLA）的动物研究委员会，美国公共卫生服务政策颁布实验动物福利的准则。雄性和雌性的成年Sprague-Dawley大鼠的3-5周龄之间（查尔斯河实验室，威尔明顿，马萨诸塞州）被使用。
1，动物和组织准备Wholemount视网膜和免疫组化协议
- 准备以下的材料和工具：解剖显微镜，镊子2用很细的技巧，剪刀，纤维素滤纸，塑料吸管和一个显微镜载玻片。
- 深深地麻醉用1-3％的异氟醚后斩首了断头台动物安乐死在一个封闭的腔室中的老鼠。一对虹膜剪刀和地点在包含外液的培养皿中取出的眼睛。冬眠，艾姆斯我dium或生理的解决方案建议。
- [可选步骤，如果视网膜神经节细胞具有荧光4回填需要。在步骤2.3-2.4描述进行荧光4标签。
- 使用解剖显微镜（光强度：1.6×10 8光子/毫米2⋅sec），切断的眼球前部取出角膜。取出晶状体和玻璃体从视网膜内表面用钳子。要删除的玻璃体，通过举办巩膜坚定一个钳子稳定的眼球。轻轻剥离朝向与其他钳子的视网膜中心的玻璃基底。的制备在这个阶段被称为眼罩，其用于冷冻切片。关于冰冻切片的更多细节可以参考文献[14,15]中找到。
- 取下眼罩视网膜。然后，提出四切让视网膜平躺着。轻轻地安装在与感光层一个显微镜载玻片视网膜。添加一滴地解决了视网膜，把CE在视网膜上llulose滤纸。一旦视网膜附着在滤纸上，放置在视网膜后面的溶液。如果需要的话，压平，用刷子或镊子视网膜。
- 将wholemounted视网膜到4％PFA 10-15分钟进行固定。
- 为30分钟，在0.1M磷酸缓冲液（PB），pH值7.4洗wholemounted视网膜三次。方框，用5％正常山羊血清或驴血清视网膜在0.1 PB含0.3％的Triton-X 100和0.1％NaN 3的在4℃下过夜。我们推荐的500微升最终体积的所有步骤，以节省封闭液和抗体。
- 第二天，孵育视网膜wholemounts与第一抗体5-7天，在4℃。最佳稀释度必须由用户来确定。
- 在PB中的0.1M洗视网膜3×30分钟，并在其针对第一抗体（浓度为1:1000）的种类对应的荧光团标记的二抗孵育过夜，在4℃。
- 之后每30分钟用PB最后三洗，安装在安装介质中的视网膜。轴封采用指甲油长时间存放盖玻片。商店的样品在4℃下并避光。
2，贴标神经节细胞轴突与大鼠Wholemount视网膜与钙指示剂染料
- 制备的1000ml哺乳动物林格氏含有（以mM计）125氯化钠，氯化钾3，2的CaCl 2，1.25和NaH 2 PO 4，1的MgCl 2，25的NaHCO 3和10葡萄糖通入95％O 2/5％CO 2。
- 在步骤1.2-1.4描述进行清扫。
- 要使用注射器装载视网膜神经节细胞（RGC的）和其轴突与钙指示剂染料，注入0.5μL荧光4 pentapotassium盐（40毫米的股票在H 2 O）进入视神经断端约1mm后的眼球。为了测量动态增加神经节细胞内[Ca 2 + SUP>] i的高亲和力，如荧光4与345纳米的杀敌的指标，是最佳的。的Fluo-4提供具有非常高的量子效率造成的> 100倍的排放量增加的时候结合到钙的额外好处。
- 将眼罩在哺乳动物林格入95％O2 / 5％CO2 2为1小时，在室温下在黑暗中。
3，钙成像协议的视网膜神经节细胞和轴突。
- 按照步骤1.1-1.4描述取下眼，晶状体和玻璃体。隔离眼罩视网膜，分成象限。安装一个象限神经节细胞的一面朝上载玻片上，用竖琴片网格，以稳定它。保持其他部分暗适应在哺乳动物林格入95％O2 / 5％CO2 2在冰上以供以后使用。
- Superfuse哺乳动物林格氏液在记录室和保持该溶液用95％O 2/5％CO 2的连续鼓泡。
- 图像在显微镜下的组织。行为实验在室温（〜23℃）或温热的阶段，试样下加热该水浴或施加暖空气在试样的表面达到生理温度。
注意：需要注意的是许多细胞功能是由温度，这对于维持细胞内稳态16关键作用调节是很重要的。然而，引进变暖措施可提高漂白，由热膨胀引起17的介质和焦点偏移的蒸发速率。利用室内温度降低荧光4 18细胞内隔离。 - 在不存在药物进行的两个成对的高K +的脉冲的控制。视网膜神经节细胞去极化和轴突研资局由每个脉冲期间提高K +Ø从3毫米到60毫米，33秒钟即可激活VGCCs同一个八信道的重力驱动的表面灌流系统。减少钠离子通过57毫米，以保持isosmolarity在高架K +的解决方案。
- 评估不同VGCCs的与使用一般或特定的钙通道阻滞剂钙信号的贡献。例如，一种非特异性钙离子通道阻断剂，钴施用以下中的钙信号的减少，提供的VGCCs的高K + -evoked钙信号的贡献的半定量测量。
- 通过将感兴趣区域（ROI）围绕感兴趣的视网膜神经节细胞的区域（ 图2）获得的荧光强度值。
- 正常化在由所述第二高K +峰由第一高K +峰产生的变化所产生的荧光强度的变化。然后，对于具体的钙通道阻滞剂的测试，只有在第二高的K +脉冲对用药和规范针对此峰第一峰值。以测量在高K +峰的药物的影响，由该第一对分割所述第二K +峰的幅度。分析应该对这些值就被执行以从在不存在药物的测定配对高K +的峰来自他们的匹配对照。
- 获得5秒的间隔图像。以避免光致漂白，保持激光激发尽可能低。提供激励的氩激光488nm的线，而光电倍增管通过505纳米LP滤波器收集荧光发射。
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Representative Results
用特异性抗体免疫标记，为研究在视网膜和钙成像技术感兴趣的特定蛋白质的定位平台允许的VGCCs在视网膜神经节细胞和它们的轴突的钙动力学的贡献的研究。
通过用抗体对神经节细胞蛋白RBPMS（RNA具有多个剪接结合蛋白），该选择性标记的RGC 19，我们能够显示，荧光4标记限定为神经节细胞（ 图1）。残端注射不会导致所有的神经节细胞的如可预期的，从这种技术的标签。
对RBPMS多肽（RBPMS 4-24），GGKAEKENTPSEANLQEEEVR的N端生成兔多克隆抗体，由商业供应商（ 表1）。 RBPMS是高度保守的哺乳动物中和多肽序列用于免疫是在小鼠，大鼠，猴和人（NCBI蛋白银行，相同的http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ）。兔血清收集下列免疫亲和使用RBPMS多肽亲和层析柱纯化。亲和纯化的抗体被证明免疫染色的神经节细胞在小鼠和大鼠的视网膜。评估RBPMS免疫染色的特异性，与兔抗体进行预吸附控制。简言之，RBPMS抗体稀释在含0.5％的Triton X-100并混合与RBPMS多肽在1微克/毫升2小时，在室温的最终浓度0.1M的PB。没有RBPMS免疫染色存在于组织切片一起孵育的预吸附的兔抗体RBPMS，并通过标准免疫组织化学技术处理。
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图1：事后免疫染色的抗体对RGC蛋白RBPMS（红色）来显示的Fluo-4（绿色）定位到神经节细胞的的Alexa 568山羊抗兔第二抗体进行。比例尺：20毫米。
钙成像技术被用来研究VGCCs的在视网膜神经节细胞和它们的轴突的钙信号的贡献。通过将感兴趣区域上的感兴趣的视网膜神经节细胞（ 图2）中获得的荧光强度值。
图2：为了获得荧光强度值，感兴趣区被放置在神经节细胞胞体和/或轴突比例尺：50毫米。
荧光4 pentapotassium盐用于标记的RGC和它们的轴突（ 图3）。
图3：VGCC亚型在神经节细胞的胞体和轴突有助于钙信号。 （A）一种 wholemount视网膜在基准水平的共聚焦图像。视网膜神经节细胞和RGC轴突可以看到标记的Fluo-4（B）从单一RGC胞体展现的增加由高-K的成对脉冲+（60毫摩尔）浴溶液和随后的减少引起的平均荧光强度的荧光信号荧光中钴的第二脉冲期间的存在。比例尺对于A：20毫米。
蔡司LM5的Pascal系统设定为5秒的帧频拍摄图像和每个完整帧扫描耗时1.57秒，使用的设置。 318微米×318微米的集合区被列入512×512 PI的扫描区域xels给出0.385μm2以下每个像素的区域。这些设置可以根据所希望的分辨率被改变。该系统采用了25 mW的氩激光为488 nm激发。我们用这条线，在3％的功率。饱和度被最小化由第一选择钙指示剂染料产生的强大的反应的去极化刺激，然后通过降低输出增益的最低浓度。减少激光能量的帮助，以避免脱色。指示剂的浓度没有测定。非比例成像校准是可能的使用钙离子载体，但回填技术可以与比率染料正常工作。确定最佳指标浓度，我们比较了荧光去极化诱发的变化与荧光4的树桩注射浓度为1-40毫米。圆形和椭圆形的投资回报是吸引周围视网膜神经节细胞及其轴突，分别是表现出稳定的荧光强度。视网膜神经节细胞和轴突的飘了出来的集中而引起的表面灌流运动未选中。
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Discussion
在这篇文章中，我们描述了两种不同的方法：1）免疫组化染色显示荧光4定位于神经节细胞的视网膜wholemounts，和2）钙成像分析钙动力学的视网膜神经节细胞及其轴突。
使用wholemounts免疫组已被用于揭示蛋白质的定位在啮齿动物视网膜20-23。不过，也有一些限制。染色的质量在很大程度上依赖于该抗体的识别其相应的抗原和其穿透视网膜组织对感兴趣的特定层的能力的能力。这些问题可通过增加在第一抗体孵育期由多达七天，增加的Triton-X的浓度和/或孵育视网膜无滤纸，以允许抗体通过在神经节细胞层中的扩散得到改善和光感受器。另一个限制是durati并固定浓度。一些抗体更好地工作，当组织被固定为1小时，而其他的抗体需要一个较短的固定期限。同样，虽然某些抗体工作最好在4％PFA固定，其他工作在降低的浓度更好。我们建议，用户确定最佳的持续时间和固定的浓度，孵育的时间，加入Triton-X的浓度，以及一抗以获得最佳效果的浓度。
钙成像法研究在视网膜神经节细胞和它们的轴突的钙动力学。 VGCC粘连剂的表面灌流允许药物的相对阻挡功效和不同钙通道亚型的存在的评估。在于视网膜神经节细胞和轴突不高K +响应的情况下，尽量减少对钙指示剂染料的浓度，高浓度可导致饱和。不完全切除玻璃体还可以充当一个屏障，防止高K +到达视网膜神经节细胞和它们的轴突。另外，不正确安装的竖琴在视网膜上的顶端可引起运动，从而无法获得的荧光强度值。如果视网膜继续前进，小心地取出竖琴，干区周边视网膜，并通过添加更多的油脂其周边重新安装竖琴。完全除去视网膜wholemount的玻璃体和最小的运动是非常重要的实验的成功。
由视网膜神经节细胞， 如N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）表示的钙可渗透的谷氨酸受体，24,25α -氨基-3-羟基-5 -甲基异恶唑-4 -丙酸（AMPA）受体和红藻氨酸盐型的激动剂离子型谷氨酸受体26-29，可以用来唤起钙的直接输入，并提供去极化刺激激活VGCCs。这种兴奋剂的利用率可能会导致非由于谷氨酸受体亚型的不同类型的视网膜神经节细胞的差异表达-uniform响应。双光子显微镜，也可利用来研究光诱发的钙信号中的RGC 30和其树突31。
视网膜神经节细胞的选择性标记是由于荧光4 pentapotassium盐钙指示剂染料的膜透性属性来实现的。葡聚糖-缀合的钙指示剂染料也已被用于通过视网膜内注射于家兔32和鼠33，以选择性标记的RGC和它们的轴突。在这两项研究中，视网膜神经节细胞和它们的轴突的选择性标记经由葡聚糖共轭钙指示剂染料的视网膜内注射，随后是2小时温育在兔32或大鼠33 7小时孵育来实现。尽管提供了足够的潜伏期，以确保均匀的标记在视网膜上，这样的方法会导致视网膜神经节细胞和增加的标签的最近的注射部位轴突相比于区域远离注射部位的稀疏标签。如德里奇（1996），在注射部位的非均匀标记讨论已被归因于细胞体作为染料吸收在暴露的（剪切）枝晶的结果的扩散标签，而在远侧区标记可能是由于逆向转运从染料的在暴露的轴突32摄取。我们的技术提供了改进的方法，以提高视网膜神经节细胞和它们的轴突的均匀标记，并减少所需的潜伏期。
本染料加载的方法提供了一种替代的策略，如批量加载和电穿孔的常规技术而导致在移动无长突细胞在神经节细胞层的非特异性加载。同的启动子的控制下表达tdTomato或EGFP转基因小鼠品系是在特定的神经节细胞群34-38，将来APPLICATI的可用性这种技术的组件可能包括特定的视网膜神经节细胞亚型钙成像研究。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
我们感谢博士学Stella和海伦VUONG向钙成像协议的贡献。我们感谢K.医生表拍戏面试场景。我们感谢阿琳平野博士，她对稿件的意见。该研发项目是由作者在医学大卫格芬医学院在加州大学洛杉矶分校进行的，是可能由被授予和管理由美国陆军医学研究与装备司令部（USAMRMC）的合同协议，远程医疗与先进技术研究中心（TATRC），在德特里克堡，下合同编号MD：W81XWH-10-2-0077。支持这些研究也来自美国国立卫生研究院EY04067和VA价值评议（NB）。 NCB是弗吉尼亚州职业研究科学家。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
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