Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d'infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament.
Bien qu'un certain nombre de médicaments anti-VIH ont été approuvés, il ya toujours des problèmes avec la toxicité et la résistance aux médicaments. Cela démontre la nécessité d'identifier de nouveaux composés qui peuvent inhiber l'infection par les résistants aux médicaments souches VIH-1 en commun avec une toxicité minimale. Nous décrivons ici un dosage efficace qui peut être utilisé pour déterminer rapidement la cytotoxicité cellulaire et de l'efficacité d'un composé contre les souches virales WT et mutantes.
La ligne souhaitée de la cellule cible est ensemencé dans une plaque à 96 puits et, après une incubation de 24 h, en série de dilutions des composés à tester sont ajoutés. Pas d'autres manipulations sont nécessaires pour les tests de cytotoxicité cellulaire; Dosages des anticorps anti VIH d'une quantité prédéterminée d'un ou l'autre médicament ou WT VIH-1 résistant vecteur qui exprime la luciférase est ajouté aux cellules. La cytotoxicité est mesurée en utilisant un dosage par luminescence dépendante de l'ATP et de l'impact des composés sur l'infectivité est mesurée en déterminant la quantité de luciferasez en présence ou en l'absence des inhibiteurs putatifs.
Ce test de dépistage prend 4 jours pour compléter et de multiples composés peuvent être criblés en parallèle. Les composés sont criblés en triple exemplaire et les données sont normalisées par rapport à des niveaux infectivité / ATP en absence de composés cibles. Cette technique permet une mesure rapide et précise de l'efficacité et de la toxicité des composés potentiels VIH anti-.
La disponibilité de médicaments ciblant plusieurs étapes essentielles du cycle de vie du virus VIH-1 a conduit à la thérapie de combinaison de médicaments (appelée thérapie antirétrovirale hautement active ou HAART) qui a grandement amélioré le traitement du VIH-1 infection, et la survie à long terme des patients. HAART, qui utilise typiquement des combinaisons de deux nucléosides de la transcriptase inverse (RT) et des inhibiteurs non plus un inhibiteur de la protéase ou un inhibiteur non nucléosidique de la RT, a converti une maladie mortelle dans un état de longue durée de vie de 1-5. Cependant, malgré les nombreux succès de la multithérapie dans suppression soutenue de la réplication virale, il a ses limites. HAART n'élimine pas le VIH, de sorte que les patients ne sont pas guéris et le traitement est long de la vie. Il existe des problèmes de toxicité des médicaments et à l'émergence de souches résistantes aux médicaments. Résistance peut se manifester à tous les médicaments contre le VIH anti-approuvés, y compris les médicaments nouvellement approuvés qui ciblent l'intégrase du VIH (EN). La résistance aux médicaments se pose probablement BECAutilisation des mutations spontanées qui se produisent au cours de la replication virale (taux de 3 x 10 -5 cycle de mutations / base / de réplication d'erreur) 6. Lorsque des mutations se produisent dans les gènes codant pour les cibles de médicaments anti-rétroviraux, un petit sous-ensemble de ces mutations se traduira par une réduction de la sensibilité de la souche virale à des médicaments. Pour éviter le développement de la résistance aux médicaments, les concentrations de médicaments doivent être maintenus à des niveaux qui suppriment totalement la réplication du VIH. Une mauvaise observance du régime thérapeutique aggrave le problème, et peut conduire à l'élaboration rapide d'une résistance 7-9. Bien que les concentrations de médicament peuvent varier d'un patient à cause de l'absorption différente, le métabolisme, la distribution et les niveaux d'excrétion, des concentrations élevées de médicaments peuvent conduire à une toxicité 10. Puisque la thérapie continue pour la vie du patient, il existe de graves préoccupations en matière de sécurité au sujet de la toxicité à long terme des anti rétroviraux. Les anti rétroviraux couramment utilisés dans HAART peuvent avoir des effets indésirables d'une il ya eu des cas où les effets secondaires ont été la vie en danger 11-15. Les problèmes rencontrés avec les patients du développement de la résistance et de la toxicité à la base de la nécessité de développer de nouveaux médicaments qui bloquent efficacement la replication des souches communes de médicaments résistantes du virus avec peu ou pas de toxicité à long terme.
Ainsi, il existe un besoin pour un dosage qui peut cribler des composés qui bloquent des étapes essentielles dans le cycle de vie viral rapidement. Nous décrivons ici un dosage efficace qui peut être utilisé pour évaluer la cytotoxicité d'un des composés et leur capacité à bloquer la replication à la fois de WT et des souches de VIH résistantes aux médicaments rapidement et efficacement. Le test que nous utilisons est semblable à un essai qui a été développé pour le dépistage de la résistance aux médicaments dans les virus isolés à partir de patients de 16 à 18.
Bien que le dosage peut être utilisé sans modification pour le dépistage de composés qui peuvent bloquer la transcription inverse du VIH, nous DescrBIE en utilisant le test pour évaluer inhibiteurs de l'IN. IN est une enzyme virale essentielle qui insère l'ADN viral dans le génome cellulaire 19. Bien qu'un certain nombre de promettre inhibiteurs de l'IN sont en cours d'élaboration, dont certains font actuellement l'objet d'essais cliniques, ne Isentress 20, 21 (aussi connu comme le raltégravir ou RAL) et, plus récemment, l'elvitegravir (EVG) 22 et dolutégravir (DTG) 23 ont été approuvé par la FDA. Ces composés sont actifs à la fois contre le VIH sous-types non B et B en culture cellulaire et chez les patients 24, 25. Cependant, le traitement avec RAL sélectionne les souches résistantes du VIH-1 chez les mutants, y compris Y143R, N155H, et G140S/Q148H 24, 26-31. N155H et G140S/Q148H réduisent également l'efficacité des IEV, qui met l'accent sur la nécessité de concevoir et de développer la deuxième génération DANS inhibiteurs de transfert de brin (INSTIs) qui sont efficaces contre ces mutations de résistance.
Nous décrivons un dosage rapide, efficace et reproductible qui peut être utilisé pour cribler des composés pour la cytotoxicité et pour leur capacité à inhiber la replication à la fois de WT et du VIH-1 résistant aux médicaments. La capacité d'identifier rapidement les composés et de tester leur efficacité et leur cytotoxicité est crucial dans le développement de médicaments nouveaux et améliorés contre le VIH-1. Une fois que les composés de plomb sont identifiés, des analogues du composé du plomb peuvent être préparés et testés en utilisant le même dosage. Le dosage est relativement simple. Il ya deux contrôles positifs et négatifs qui permettent à l'utilisateur de diagnostiquer les problèmes les plus courants (composés toxiques, des problèmes avec le vecteur stock). L'utilisation d'un ensemble de triple puits sans composé ajouté montre que l'infection virale s'est produite. Le fait que la cytotoxicité est mesurée dans un test indépendant permet d'éviter une mauvaise interprétation d'une réduction de la luciférase de la cytotoxicité provoquée par un effet spécifique sur la réplication virale.
Les étapes critiquesdans le protocole sont la préparation des plaques de sorte que les cellules sont uniformément réparties dans les puits, ce que les puits ont des concentrations appropriées des composés à tester, en ajoutant la même quantité de virus de chacun des puits, et la mesure de l'activité luciférase à déterminer la CC 50 et IC 50 valeurs.
Le test est sûr, quantitative et reproductible. Le test est sûr parce que le vecteur est déficient pour la replication. Le dosage est quantitatif et reproductible car il est basé sur un vecteur unique ronde qui exprime la luciférase, qui peut être dosé avec précision et commodément. Dans un dosage de réplication de virus tour multi, le CI 50 mesurée en fonction du nombre de cycles de vie viraux; il s'agit d'un problème particulier lorsque les dosages impliquent à la fois des virus WT et résistantes aux médicaments qui peuvent avoir des capacités différentes de façon significative de la réplication.
Il ya eu plusieurs dosages enzymatiques indiqué précédemment que possibleêtre utilisés pour cribler des inhibiteurs IN. Des essais qui impliquent une technologie de PCR en temps réel pour mesurer ADN intégré nécessitent des protéines recombinantes purifiées (s), et sont, en général, à la fois plus de main-d'oeuvre et onéreuse 36, 37. Bien qu'il soit possible d'utiliser des dosages enzymatiques pour mesurer l'impact des composés sur les autres enzymes virales (RT et la protéase), chaque enzyme nécessite son propre système de dosage. Le seul essai de tour vecteur, tel que décrit, peut être utilisé, sans modification, pour dépister les inhibiteurs de la RT. Un dosage similaire peut être utilisée pour cribler des inhibiteurs de la protéase; Cependant, dans un essai d'inhibiteur de la protéase, les composés doivent être ajoutés à des cellules utilisées pour produire les vecteurs. Un dosage liée, en utilisant différentes cellules et des vecteurs, peut également être utilisé pour le dépistage de l'enveloppe (env) et des inhibiteurs de fusion du VIH entrée. Enfin, le dosage peut être utilisé, à plus grande échelle, avec des distributeurs robotiques automatisés. Ainsi, le test peut être utilisé pour cribler de grandes banques de composés contre le WT et le mutant VIH. Toutefois, le fait le test peut détecter un inhibiteur de la réplication du VIH qui agit à différents stades de points de cycle de vie viral à une limitation dans l'interprétation des données. Par lui-même le dosage qui ne définit pas l'étape dans le cycle de vie est bloqué par un composé. Si cette question se pose, il peut être résolu en utilisant des dosages de temps d'addition 38, et en testant le composé contre des protéines virales recombinantes purifiées.
Malheureusement, malgré le succès des médicaments anti-VIH, il ya encore des problèmes à la fois la résistance et la toxicité. En l'absence d'un vaccin anti-VIH efficace, il est nécessaire non seulement pour développer de nouveaux médicaments thérapeutiques qui seront efficaces contre les mutants résistants aux médicaments existants, mais également de développer des médicaments prophylactiques qui peuvent réduire la propagation du virus. Si l'utilisation prophylactique de médicaments anti-VIH incudes le traitement des personnes non infectées, cette approche sera un fardeau spécial sur le développement de médicaments qui sont ont little ou pas de toxicité à long terme.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros du NCI.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |