Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Published: April 9, 2014 doi: 10.3791/51400
Automatic Translation
1, 1
1HIV Drug Resistance Program, National Cancer Institute

Summary

نحن هنا وصف السمسة الخلوية واحد المقايسات العدوى الجولة التي تتيح لفحص سريع ودقيق من المركبات لتحديد السمسة الخلوية الخاصة بهم (CC 50) وIC 50 ضد القيم WT ومقاومة HIV-1 المخدرات.

Abstract

على الرغم من أن تم الموافقة على عدد من العقاقير المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية، لا تزال هناك مشاكل مع سمية والمقاومة للعقاقير. هذا يدل على الحاجة إلى تحديد المركبات الجديدة التي يمكن أن تمنع الإصابة من قبل المقاومة للأدوية الشائعة HIV-1 مع الحد الأدنى من السلالات السمية. نحن هنا تصف مقايسة كفاءة التي يمكن استخدامها لتحديد بسرعة السمسة الخلوية وفعالية من مركب ضد سلالات فيروسية WT ومتحولة.

والمصنفة خط الخلية الهدف المنشود في لوحة 96 جيدا، وبعد الحضانة 24 ساعة، تضاف متسلسل التخفيفات من المركبات لفحصها. لا مزيد من التلاعب ضرورية لفحوصات السمسة الخلوية؛ لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية المقايسات كمية محددة سلفا إما WT أو المخدرات مقاومة HIV-1 النواقل التي تعبر يضاف luciferase المراسل إلى الخلايا. يتم قياس سمية الخلايا باستخدام ATP تعتمد مقايسة التألق وتأثير المركبات على العدوى تقاس تحديد مبلغ lucifeRASE في وجود أو غياب مثبطات المفترضة.

هذا الاختبار فحص يستغرق 4 أيام لاستكمال والمركبات متعددة يمكن فرزهم في نفس الوقت. يتم فحص المركبات في ثلاث نسخ والبيانات هي تطبيع لمستويات العدوى / ATP في غياب المركبات المستهدفة. توفر هذه التقنية لقياس سريع ودقيق للفعالية وسمية من المركبات المضادة المحتملة بفيروس نقص المناعة البشرية.

Introduction

وقد أدى توافر العقاقير تستهدف عدة خطوات أساسية في دورة الحياة الفيروسية HIV-1 إلى الجمع بين العلاج المخدرات (وتسمى العلاج نشطة للغاية المضادة للفيروسات الرجعية، أو خليط عقاقير هارت) الذي تحسن كبير في علاج HIV-1 والالتهابات، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من المرضى. خليط عقاقير هارت، والذي يستخدم عادة مزيج من اثنين نوكليوزيد الناسخ العكسي (RT) مثبطات وإما مثبط البروتياز أو مثبط غير نوكليوزيد RT، حولت الآن المرض الفتاك في حياة طويلة حالة 1-5. ومع ذلك، على الرغم من العديد من النجاحات من خليط عقاقير هارت في قمع متواصلة من تكاثر الفيروس، له حدود. HAART لا قضاء على فيروس نقص المناعة البشرية، لذلك لا يشفى المرضى والعلاج هو حياة طويلة. هناك مشاكل مع سمية الدواء ومع ظهور سلالات مقاومة للأدوية. المقاومة يمكن أن تنشأ لجميع من وافق الأدوية المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية، بما في ذلك الأدوية المعتمدة حديثا والتي تستهدف integrase فيروس نقص المناعة البشرية (IN). مقاومة العقاقير المرجح تنشأ بيكااستخدام الطفرات العفوية التي تحدث أثناء تكاثر الفيروس (نسبة الخطأ 3 × 10 -5 الطفرات دورة / القاعدة / النسخ المتماثل) 6. عندما تنشأ طفرات في الجينات الترميز لأهداف العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية، ومجموعة فرعية صغيرة من هذه الطفرات تؤدي إلى انخفاض في قابلية السلالة الفيروسية للعقاقير. لتجنب نشوء مقاومة للعقاقير، لا بد من الحفاظ على مستويات تركيزات المخدرات التي تقمع بشكل كامل تكرار فيروس نقص المناعة البشرية. الفقراء الالتزام بالنظام العلاجي يزيد من تفاقم المشكلة، ويمكن أن يؤدي إلى التطور السريع للمقاومة 7-9. على الرغم من أن تركيزات الدواء في المرضى الذين يمكن أن تختلف بسبب اختلاف امتصاص والتمثيل الغذائي، والتوزيع، ومستويات إفراز، يمكن أن تركيزات عالية المخدرات يؤدي إلى سمية 10. منذ العلاج يستمر لحياة المريض، وهناك مخاوف جدية حول سلامة سمية على المدى الطويل من مكافحة الفيروسات. مكافحة الفيروسات التي يشيع استخدامها في خليط عقاقير هارت يمكن أن يكون لها آثار سلبية علىالثانية كانت هناك حالات حيث الآثار الجانبية التي تهدد الحياة وقد 11-15. مشاكل تواجه المرضى مع تطور المقاومة وسمية تكمن وراء الحاجة إلى تطوير أدوية جديدة التي تمنع بشكل فعال تكرار سلالات مقاومة المخدرات شيوعا من الفيروس مع سمية قليلة أو معدومة على المدى الطويل.

وبالتالي، هناك حاجة لفحص الشاشة التي يمكن للمركبات التي تعمل على منع خطوات أساسية في دورة الحياة الفيروسية بسرعة. نحن هنا تصف مقايسة كفاءة التي يمكن استخدامها لتقييم السمسة من المركبات وقدرتها على منع تكرار كلا WT وسلالات فيروس نقص المناعة البشرية المقاوم للأدوية بسرعة وكفاءة. الفحص التي نستخدمها هي مماثلة لمقايسة التي تم تطويرها للكشف عن الفيروسات المقاومة للأدوية في عزل المرضى من 16-18.

على الرغم من أن الفحص يمكن استخدامها دون تعديل للكشف عن المركبات التي يمكن منع فيروس نقص المناعة البشرية النسخ العكسي، ونحن سوف descrمتد باستخدام مقايسة لتقييم IN مثبطات. في هو انزيم الفيروسية الضروري أن يدرج الحمض النووي الفيروسي في جينوم الخلوية 19. على الرغم من أن عددا من واعدة في مثبطات يجري تطويرها، وبعضها يخضع حاليا لتجارب سريرية، Isentress فقط 20، 21 (المعروف أيضا باسم Raltegravir أو RAL) ومؤخرا، Elvitegravir (EVG) 22 وDolutegravir (DTG) 23 كانت التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير. هذه المركبات هي فعالة ضد فيروس نقص المناعة البشرية على حد سواء B وأنواع فرعية غير B في خلية ثقافة والمرضى في 24 و 25. ومع ذلك، والمعاملة مع راؤول يختار لالمقاوم للأدوية HIV-1 في المسوخ، بما في ذلك Y143R، N155H، وG140S/Q148H 24، 26-31. N155H وG140S/Q148H أيضا أن يقلل من فعالية EVG، وهو ما يؤكد على الحاجة لتصميم وتطوير الجيل الثاني في مثبطات نقل حبلا (INSTIs) التي هي فعالة ضد هذه الطفرات المقاومة.

Protocol

1. إعداد مخزون ماستر

  1. جعل الأسهم الرئيسي من المركبات لفحصها في DMSO. إعداد الأسهم بتركيز مستوى 20 ملي.
    ملاحظة: أي تركيز أعلى من 10 ملي يمكن استخدامها. المركبات التي يمكن أن تستخدم الضوابط الإيجابية للتحقق من صحة هذا الاختبار تشمل RAL، EVG، وDTG.
  2. تذاب ضمان مركبات في DMSO من قبل vortexing الحلول عدة مرات لمدة 15 ثانية وتفرخ على RT لمدة 1 ساعة. تخزين 20 ملي حلول الأسهم في الظلام في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. إعداد لوحات 96 جيدا لفحص المركبة

  1. اختيار خط الخلية لفحصها (على سبيل المثال ملتحقا أو TZM-BL)، والبذور 100 ميكرولتر من تلك الخلايا في مناطق ذات كثافة من 4 × 10 4 خلية / مل (4،000 خلايا / جيد) في وسائل الإعلام (مثل تعديل في النسر أو DMEM المتوسطة Dulbecco و تستكمل مع 5٪ (V / V) مصل الجنين البقري، 5٪ مصل العجل الوليد، والبنسلين (50 وحدة / مل)، بالإضافة إلى streptomycin).

3. جيل من مخزون الفيروسات

إنتاج VSV-ز pseudotyped فيروس نقص المناعة البشرية عليها بنقل 293 خلايا (كما هو موضح في الشكل 1، الخطوة 1) 32-34.

  1. في اليوم قبل ترنسفكأيشن، لوحة 293 الخلايا على الأطباق 100 مم في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 6 خلايا.
  2. في يوم ترنسفكأيشن، 293 بالنقل الخلايا مع 16 ميكروغرام من النوع البري أو متحولة فيروس نقص المناعة البشرية (pNLNgoMIVR - ΔLUC) و 4 ميكروغرام من VSV (pHCMV ز) باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم 35.
  3. يتم إضافة ما يقرب من 6 ساعة بعد راسب فوسفات الكالسيوم، وغسل الخلايا مرتين مع 293 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، واحتضان مع وسائل الإعلام الجديدة لمدة 48 ساعة. [تستكمل DMEM مع 5٪ (V / V) مصل الجنين البقري، 5٪ مصل العجل الوليد، والبنسلين (50 وحدة / مل)، بالإضافة إلى الستربتوميسين (50 ميكروغرام / مل)].
  4. حصاد الفيروس تحتوي على supernatants عن طريق إزالة وسائل الاعلام من 100 ممالأطباق، وتوضيح supernatants بواسطة الطرد المركزي في انخفاض سرعة 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة، تحديد supernatants من خلال مرشح 45 ميكرون حجم المسام حقنة، علاج supernatants مع توربو الدناز لمدة 30 دقيقة في RT وتمييع supernatants في وسائل الإعلام لإعداد المقايسات في العدوى . تخزين supernatants الفيروسية المجمدة، في مأخوذة، في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم تحديد المبلغ من P24 في طاف باستخدام HIV-1 P24 انزيم مرتبط المناعي طقم الفحص. ويستخدم تركيز P24 للسيطرة على كمية الفيروس في العينة. يتم إضافة ما يقرب من 500 نانوغرام من الفيروس إلى الخلايا ملتحقا مطلي على أطباق قطرها 60 ملم في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 5 خلية / طبق في اليوم قبل العدوى. بعد ساعة 48 من الحضانة، ويتم حصاد الخلايا، التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي، وغسلها، ومعلق في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة مبلغ مساو من مراسل التلألؤ فحص الجينات كاشف وقياس luciferase النشاط كما هو موضح في الأقسام 5.4.1 و5.4.2. من هذا، يمكن إجراء التخفيف المناسب للفيروس كما نوقش في الخطوة 4.6.

4. فحص مركب في لوحات 96 جيد

فحص كل مجمع في ثلاث نسخ ومتوسط ​​النتائج.

ملاحظة: يتم تصحيح تأثير كل مركب على تكاثر الفيروس عن طريق تطبيع إلى مستوى النسخ المتماثل التي تم الحصول عليها في غياب أي مجمع.

  1. تحديد نطاق تركيز التجريبية ليتم عرضه.
    ملاحظة: عادة، يتم إجراء شاشات مع 11 التخفيفات المسلسل بإضافة مركب إلى العمود العمود وحة من قبل وشاشات مع 7 التخفيفات التسلسلي مصنوعة بإضافة المجمع حسب الصف. واحدة ثلاث نسخ مجموعة من الآبار يجب أن تكون محفوظة لمراقبة أي مجمع. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يظل عمود واحد أو صف واحد فارغ لتكون بمثابة السيطرة السلبية / الخلفية. أخيرا، سواء كان السمسة الخلوية أو العدوى مقايسة سوف تملي إذا تم إضافة الفيروس.
  2. إعدادالتخفيفات المسلسل من محلول المخزون 20 ملي. ويتم اختيار التركيزات اعتمادا على مجموعة العزم تجريبيا تركيزات لفحصها (كما هو موضح في الجدول رقم 1). تحضير التخفيفات في وسائل الإعلام في تركيز النهائي من 10X المطلوب، أي إذا كان تركيز النهائي سيكون 100 ميكرومتر، وجعل الأسهم العمل 1 ملم.
    ملاحظة: المركبات مع IC 50 ق 5-10 ميكرومتر أعلاه ليسوا مرشحين عادة ما تكون جيدة لتطوير العقاقير. في فحوصات أولية ونحن اختبار المركبات فقط ضد ناقلات WT. ثم يتم اختبار مركبات الواعدة التي تمنع بشكل فعال متجه WT ضد فريق من المسوخ مقاومة المخدرات.
  3. إزالة لوحات 96 جيدا من الحاضنة وإضافة التخفيفات التسلسلي للمركبات التي سيتم اختبارها في الآبار في ثلاث نسخ (كما هو موضح في الشكل 1، الخطوة 2).
    ملاحظة: حجم تضاف إلى البئر يجب أن يكون حجم 1/10 من تركيز النهائي. وهكذا، أضف 22 ميكرولتر / جيد (النهائي ع حجمبالإضافة إلى ذلك الفيروس معاهدة الفضاء الخارجي هو 220 ميكرولتر) لفحوصات العدوى. لفحوصات السمية الخلوية، إضافة 11 ميكرولتر / جيد (الحجم النهائي هو 110 ميكرولتر / جيد).
  4. العودة لوحات 96 جيدا إلى الحاضنة. لشاشة السمسة الخلوية، واحتضان لوحات 96 جيد 48 ساعة على 37 درجة مئوية، وهناك حاجة إلى أي مزيد من التلاعب في البروتوكول 4: المضي قدما في البروتوكول 5 لفحوصات العدوى، ومواصلة اتباع الإرشادات الموجودة في البروتوكول 4.
  5. فحوصات العدوى فقط. إزالة لوحات من الحاضنة بعد مدة لا تقل عن 3 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية مع المركبات ليتم تحليلها.
    ملاحظة: هذا يسمح المجمع ليتم تناولها من قبل الخلايا قبل عدوى فيروس نقص المناعة البشرية مع ناقلات.
  6. إعداد تخفيف الأسهم للفيروس 33 و 34 (عادة حوالي 1:3) التي من شأنها أن تنتج إشارة luciferase المراسل بين 0،2-1،5 وحدة luciferase المراسل النسبي (RLUs) في الخلايا غير المعالجة. سوف لوحة كامل يستغرق حوالي 10 مل من diluتيد الفيروس. إضافة 100 ميكرولتر من الفيروس إلى كل من الآبار، وذلك باستخدام إما 8 أو 12 الأقنية pipettor. لا تضيف الفيروس إلى آبار المراقبة السلبية / الخلفية. العودة إلى لوحات الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: ل01:03 التخفيف من الأسهم الفيروس هو التخفيف النموذجية التي سوف تنتج إشارة luciferase المراسل بين 0.2 -1.5 RLUs على أساس مقايسة P24 تبين أن تركيز الفيروس في طاف ما يقرب من 500 نانوغرام في 1.0 مل.

5. إعداد وقياس السمسة والعدوى في لوحات 96 جيد

  1. نضح وسائل الإعلام من الآبار (الفينول الحمراء في وسائل الإعلام يمكن أن تتداخل مع إشارة luciferase المراسل). استخدام ماصة الزجاج مع تلميح ماصة 200 ميكرولتر تعلق على نهاية. تبدأ في الجزء العلوي من وسائل الإعلام والعمل ببطء نحو الزاوية قاع البئر. لا تنفق الكثير من الوقت في قاع البئر، أو يمكن إزالة الخلايا من البئر.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5 مترM MgCl 2 إلى كل بئر. هذا يجب القيام به فورا بعد إزالة وسائل الإعلام بحيث الخلايا لا تجف.
  3. فقط لفحوصات السمية الخلوية، إضافة 5 مل من العازلة الركيزة من كشف فحص التلألؤ ATP إلى كل قارورة من توفيره كاشف مجفف بالتجميد. واحد قارورة كافية لوحة 96 جيدا.
    1. إضافة 50 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية من كشف فحص التلألؤ ATP إلى كل بئر. يهز جيدا لوحة 96 في 700 دورة في الدقيقة في RT لمدة 5 دقائق باستخدام thermomixer المدمجة.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من إعادة تشكيل التلألؤ ATP كشف الفحص الكاشف لجميع الآبار باستثناء آبار المراقبة / خلفية سلبية. يهز في 700 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق باستخدام thermomixer المدمجة. احتضان لوحات في RT لمدة 20 دقيقة لإتاحة الوقت لوضع إشارة.
    3. قراءة لوحة 96 جيدا باستخدام luminometer صفيحة ميكروسكوبية.
      ملاحظة: فتح برو برنامج صفيحة ميكروسكوبية luminometer SoftMax. تأكد من تعيين luminometer لقياس وميnescence في حساسية من 5 قراءات / جيد.
  4. فقط لفحوصات العدوى، إضافة 10 مل من العازلة الركيزة من الفحص الجيني مراسل التلألؤ إلى كل قارورة من توفيره كاشف مجفف بالتجميد. واحد قارورة كافية لكل لوحة 96 جيدا.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من إعادة تشكيل التلألؤ مراسل الفحص الجيني كاشف إلى كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإتاحة الوقت لوضع إشارة.
    2. قراءة لوحة 96 جيدا باستخدام luminometer صفيحة ميكروسكوبية كما يؤديها في القسم 5.3.3.

6. تحديد CC 50 و 50 IC القيم للمركبات

  1. نقل البيانات luciferase المراسل من luminometer صفيحة ميكروسكوبية في جداول اكسل.
    1. البيانات luciferase المراسل في ثلاث نسخ والبيانات إشارة الخلفية / تحكم المتوسط ​​على حد سواء. طرح متوسط ​​إشارة الخلفية / تحكم عن متوسط ​​إشارة ثلاث نسخ لمجموعة تركيز كامل.
      2. <لى> تطبيع الخلفية تصحيح متوسط ​​إشارة للنطاقات تركيز على النشاط، سواء كان السمسة أو العدوى، في غياب أي عنصر لتحديد تثبيط في المئة.
      ملاحظة: يتم تعريف المئة تثبيط كما luciferase النشاط في وجود المخدرات مقسوما على luciferase النشاط في غياب المخدرات مضروبا في 100.
  2. استخدام برنامج حاسوبي Kaleidagraph الحصول CC 50 و 50 IC القيم
    1. نقل كل من مجموعة تركيز العزم تجريبيا في المئة وتثبيط luciferase النشاط في Kaleidagraph.
    2. رسم البيانات مع مجموعة التركيز على المحور س وتثبيط في المئة من luciferase النشاط على المحور ص.

Representative Results

إذا كان فحص (الشكل 1، الخطوتين 1 و 2) وقد أجريت بنجاح، ثم القيم luciferase المراسل يجب أن يشبه البيانات الواردة في الجدول 2 المسح الضوئي عبر مجموعة التركيز.؛ سوف مركب يحتمل أن تكون قوية تكشف عن زيادة luciferase النشاط من اليسار إلى اليمين، ويجب أن يكون التحكم في أعلى luciferase النشاط. إذا لم luciferase النشاط تتجاوز 0.1 وحدات luciferase المراسل النسبية (RLUs) عبر مجموعة التركيز، وهذا عادة ما يشير إلى أن مجمع قتل الخلايا. إذا كانت البيانات luciferase المراسل أكبر من أو يساوي 2.0 RLUs في جميع التخفيفات التسلسلي، ثم كانت المركبات غير قادرة على منع العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية 1 في تركيزات التي تم اختبارها.

التآمر تركيز مركبات مقابل تثبيط في المئة من luciferase النشاط في Kaleidagraph (الجدول 3، الجزء ألف)، وبعد إجراء تحليل الانحدار الخطي، وسوف تنتج نتائج مماثلة لر خرطوم هو مبين في الجدول 3، الجزء باء.

الشكل 1
الشكل 1. إعداد HIV-1 أسهم الفيروسية وإعداد الخلوي السمسة وجولة واحدة العدوى فحوصات. في الخطوة 1، و transfected الخلايا 293T مع pNL4.3ΔEnv.LUC وVSV-G والمحتضنة لمدة 48 ساعة لإنتاج الفيروس 34 . يتم حصاد الفيروس وتخزينها (المجمدة في -80 درجة مئوية في مأخوذة) حتى يتم استخدامها في فحوصات العدوى. لخطوة 2، هي المصنفة الخلايا ملتحقا في لوحة 96 جيدا والمحتضنة لمدة 24 ساعة. ثم يتم preincubated الخلايا مع التخفيفات التسلسلي للمركبات التي سيتم اختبارها لمدة 3 ساعة ثم المصابين بفيروس (إما WT أو مقاومة المخدرات). بعد الحضانة 48 ساعة، ويتم قياس luciferase النشاط.

le1.jpg "العرض =" 300 "/>
الجدول 1. فحص المخدرات المسلسل التخفيف النموذج. ينطوي على فحص أكثر صرامة 11 التخفيفات المتسلسلة التي تبدأ عادة في 10 ميكرومتر ويغلق عند مستوى 0.0005 ميكرومتر. يتم إعداد التخفيفات المسلسل 10X؛ هناك 100 ميكرولتر من الخلايا و100 ميكرولتر من الفيروس في كل بئر). في هذا الكتاب، وبعد هذه الحسابات، فإن التخفيفات التسلسلي يكون كافيا ل3 صفوف من كامل وحة 96 جيدا. يتم إعداد المقايسات السمسة بالمثل؛ ولكن 11 التخفيفات المسلسل تبدأ في 250 ميكرومتر ويغلق عند 0.05 ميكرومتر. تضاف فقط 11 ميكرولتر من التخفيفات إلى الآبار في لوحة تحتوي على 100 ​​ميكرولتر من الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 2
الجدول 2. luciferase المراسل الإشارة قراءة البيانات وتحديد نسبة تثبيط luciferase المراسل آخر. يبين الجدول البيانات مجموعة نموذجية من البيانات luciferase المراسل لمجمع ناجحة. ويبين الجدول أيضا الحسابات الإضافية اللازمة لتحديد تثبيط في المئة من luciferase النشاط وCC 50 و 50 IC القيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 3
الجدول 3. الانحدار الخطي تحليل بيانات الجدول. الجزء ألف. والرسوم البيانية نطاق التركيز المستخدم مقابل تثبيط في المئة من luciferase النشاط في Kaleidagraph إنتاج منحنيات تثبيط المناسبة. الجزء باء، يتم تعريف المنحنيات تثبيط من قبل حدودي 3وظيفة السيني وتناسب إلى البيانات عن طريق تحليل الانحدار الخطي 18. ثم يتم استخدام هذا الجدول البيانات بالتزامن مع Microsoft Excel لحساب تركيزات المخدرات اللازمة لمنع الفيروس والتكامل السمسة الخلوية بنسبة 50٪، على سبيل المثال IC 50 و 50 CC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نحن تصف مقايسة سريعة وفعالة، وقابلة للتكرار والتي يمكن استخدامها لمركبات الشاشة من أجل سمية الخلايا وقدرتها على منع تكرار كلا WT ومقاومة HIV-1 المخدرات. القدرة على التعرف بسرعة المركبات واختبار فعاليتها والسمسة أمر بالغ الأهمية في تطوير عقاقير جديدة ومحسنة ضد HIV-1. مرة واحدة يتم تحديد مركبات الرصاص، نظائرها من مركب الرصاص يمكن أن تنتج واختبارها باستخدام نفس الفحص. مقايسة بسيطة نسبيا. هناك على حد سواء الضوابط الإيجابية والسلبية التي تسمح للمستخدم لتشخيص المشاكل الأكثر شيوعا (المركبات السامة، ومشاكل مع الأسهم ناقلات). استخدام مجموعة من الآبار ثلاث نسخ مع عدم وجود مجمع أضاف يدل على أن العدوى الفيروسية قد حدث. حقيقة أن السمسة يقاس مقايسة مستقلة يتجنب إساءة تفسير انخفاض في luciferase المراسل الناجمة عن سمية الخلايا كأثر محددة على تكاثر الفيروس.

الخطوات الحاسمةفي بروتوكول يستعدون لوحات بحيث يتم توزيع الخلايا بشكل موحد في الآبار، أن الآبار لديهم تركيزات السليم للمركبات لفحصها، مضيفا نفس كمية الفيروس إلى كل من الآبار، وقياس luciferase النشاط ل تحديد CC 50 و 50 IC القيم.

الفحص آمن، الكمية، وقابلة للتكرار. مقايسة آمنة لأن ناقلات هي تكرار معيب. الفحص هو كمية وقابلة للتكرار لأنه يقوم على ناقلات جولة واحدة التي تعبر عن luciferase المراسل، والتي يمكن أن يعاير بدقة وسهولة. في الجولة متعددة تكاثر الفيروس مقايسة، وIC قياس 50 يعتمد على عدد من دورات الحياة الفيروسية؛ هذه مشكلة خاصة عندما تنطوي على حد سواء المقايسات WT والفيروسات المقاومة للأدوية التي قد يكون لها قدرات مختلفة تكرارها بشكل كبير.

هناك عدة فحوصات تم الأنزيمية ذكرت سابقا التي يمكن أنأن تستخدم للكشف عن مثبطات IN. المقايسات التي تنطوي في الوقت الحقيقي PCR التكنولوجيا لقياس الحمض النووي المتكاملة تتطلب تنقية البروتينات المؤتلف (ق)، ويتم، بشكل عام، على حد سواء أكثر كثيفة العمالة ومكلفة 36، 37. على الرغم من أنه من الممكن استخدام المقايسات الأنزيمية لقياس تأثير المركبات على الانزيمات الفيروسية الأخرى (RT والبروتيني)، يتطلب كل انزيم نظام الفحص الخاصة بها. ناقلات فحص جولة واحدة، كما هو موضح، ويمكن استخدامها، دون تعديل، للكشف عن مثبطات RT. A مقايسة مماثلة يمكن استخدامها للكشف عن مثبطات الأنزيم البروتيني؛ ومع ذلك، في مقايسة مثبط البروتياز، ويجب أن يضاف المركبات إلى الخلايا المستخدمة لإنتاج النواقل. A الفحص ذات الصلة، باستخدام خلايا وناقلات مختلفة، ويمكن أن تستخدم أيضا للكشف عن الظرف (الحياة الفطرية) وفيروس نقص المناعة البشرية مثبطات الانصهار الدخول. وأخيرا، فإن الفحص يمكن استخدامها، وعلى نطاق أوسع، مع موزعات الآلية المؤتمتة. وبالتالي، فإن الفحص يمكن استخدامه للكشف مكتبات كبيرة من المركبات ضد WT ومutant فيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، فإن حقيقة الفحص يمكن الكشف عن المانع من تكرار فيروس نقص المناعة البشرية التي تعمل في مختلف مراحل الفيروسية النقاط دورة الحياة إلى وجود قيود في تفسير البيانات. في حد ذاته لا يحدد الفحص الذي يتم حظر خطوة في دورة الحياة من قبل المجمع. إذا دعت هذا السؤال، فإنه لا يمكن حلها باستخدام وقت فحوصات بالإضافة إلى ذلك 38، واختبار مركب ضد البروتينات الفيروسية المؤتلف المنقى.

للأسف، على الرغم من نجاح العقاقير المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية، لا تزال هناك مشاكل مع كل من المقاومة وسمية. في غياب لقاح فعال لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية، هناك حاجة ليس فقط إلى تطوير عقاقير علاجية جديدة من شأنها أن تكون فعالة ضد المسوخ مقاومة للأدوية الموجودة، ولكن أيضا لتطوير أدوية وقائية التي يمكن أن تقلل من انتشار الفيروس. إذا كان الاستخدام الوقائي للعقاقير المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية incudes معاملة الناس المعافين، وهذا النهج عبئا خاصا على تطوير العقاقير التي يكون لإيتل أو لا سمية على المدى الطويل.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من لجنة التحقيق الوطنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMSO Sigma D2650
DMEM Corning Cellgro 10-017
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System Perkin Elmer 6016941
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6016751
Dulbecco's PBS Gibco-Life Technologies-Invitrogen 14190-136
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices
KaleidaGraph Synergy Software
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate Thomas Scientific 12-566-26
Eppendorf Thermomixer Compact Sigma Aldrich T1442-1EA
Turbo DNase Ambion-Life Technologies-Invitrogen AM2238
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM Millipore SLAHA033SS
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit Perkin Elmer NEK050B001KT
HOS cells ATCC CRL-1543
TZM-bl cells NIH AIDS Reagent Program 8129
pNL4.3ΔEnv.LUC NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
VSV-G NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
SoftMax Pro Molecular Devices 0200-310

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mouton, Y., et al. Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA. AIDS. , 101-105 (1997).
  2. Hammer, S. M., et al. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team. New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).
  3. Hogg, R. S., et al. Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens. Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).
  4. Egger, M., et al. Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study. BMJ. 315, 1194-1199 (1997).
  5. Gulick, R. M., et al. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy. New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).
  6. Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science. 271, 1582-1586 (1996).
  7. Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature. Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).
  8. Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic. Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).
  9. Volberding, P. A., Deeks, S. G. Antiretroviral therapy and management of HIV infection. Lancet. 376, 49-62 (2010).
  10. Acosta, E. P., et al. Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data. Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).
  11. Rockstroh, J. K., et al. Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK. Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).
  12. Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management. Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).
  13. Lunzen, J., et al. Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial. Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).
  14. Sax, P. E., et al. Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks. Lancet. 379, 2439-2448 (2012).
  15. Sax, P. E., et al. Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results. Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).
  16. Kellam, P., Larder, B. A. Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates. Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).
  17. Hertogs, K., et al. A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs. Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).
  18. Petropoulos, C. J., et al. A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1. Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).
  19. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  20. Hazuda, D. J., et al. Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells. Science. 287, 646-650 (2000).
  21. Nguyen, B. Y., et al. Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).
  22. Wills, T., Vega, V. Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase. Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).
  23. Kobayashi, M., et al. In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor. Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).
  24. Cooper, D. A., et al. Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng. J. Med. 359, 355-365 (2008).
  25. Briz, V., et al. Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O. AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).
  26. Fransen, S., et al. Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways. J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).
  27. Goethals, O., et al. Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles. Virology. 402, 338-346 (2010).
  28. Goethals, O., et al. Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors. J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).
  29. Canducci, F., et al. Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies. AIDS. 23, 455-460 (2009).
  30. Ceccherini-Silberstein, F., et al. Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation. AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).
  31. Charpentier, C., et al. Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy. HIV Med. 9, 765-770 (2008).
  32. Julias, J. G., et al. Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage. J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).
  33. Hare, S., et al. Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572). Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).
  34. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol. 59, 284-291 (1986).
  35. Kemp, S. D., et al. A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).
  36. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  37. Brussel, A., et al. Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection. AIDS. 17, 645-652 (2003).
  38. Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds. Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).

Tags

علم المناعة، العدد 86، فيروس نقص المناعة البشرية، السمسة، العدوى، luciferase المراسل، ومقاومة المخدرات، integrase، عكس الناسخ
الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, S. J., Hughes, S. H. Rapid… More

Smith, S. J., Hughes, S. H. Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors. J. Vis. Exp. (86), e51400, doi:10.3791/51400 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter