כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.
למרות מספר תרופות אנטי HIV אושרו, יש עדיין בעיות עם רעילות ועמידות לתרופה. זה מדגים את הצורך לזהות תרכובות חדשות שיכול לעכב זיהום על ידי זני HIV-1 הנפוץ בסמים עמידים עם רעילות מינימאלית. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי לקבוע את cytotoxicity ויעילות של מתחם כנגד זנים נגיפיים WT ומוטציה הסלולריים במהירות.
שורת תאי המטרה הרצויה היא זורעים בצלחת 96 היטב, ולאחר דגירה 24 שעות, באופן סדרתי דילולים של התרכובות להיבדק מתווספים. אין מניפולציות נוספות נדרשות למבחני cytotoxicity הסלולרי; עבור אנטי HIV מבחני סכום קבוע מראש של או WT או וקטור HIV-1 עמיד בפני תרופה המבטא לוציפראז מתווסף לתאים. Cytotoxicity נמדד באמצעות assay ATP תלוי הארה ואת ההשפעה של התרכובות בinfectivity נמדד על ידי קביעת סכום lucifeRase בנוכחות או היעדר מעכבים המשוערים.
assay הקרנה זה לוקח 4 ימים כדי להשלים ויכולים להיות מוקרן תרכובות מרובות במקביל. תרכובות מוקרנות בשלושה עותקים והנתונים מנורמלים לרמות infectivity / ATP בהעדר תרכובות יעד. טכניקה זו מספקת מדידה מהירה ומדויקת של היעילות ורעיל של תרכובות אנטי HIV פוטנציאליים.
הזמינות של תרופות המכוונות כמה צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי HIV-1 הובילה לטיפול משולב תרופתי (נקרא טיפול אנטי retroviral פעיל מאוד, או HAART) ששפר את הטיפול ב-HIV-1 זיהומים, והישרדות לטווח הארוך מאוד של חולים. HAART, אשר בדרך כלל משתמש בשילובים של שני טרנסקריפטאז ההפוך נוקלאוזידים מעכבים (RT) וגם מעכבי פרוטאז או מעכבי RT נוקלאוזידים לא, יש עכשיו הוסב מחלה קטלנית למצב חיים ארוכים 1-5. עם זאת, למרות הצלחות רבות של HAART בדיכוי מתמשך של שכפול נגיפי, יש לו מגבלות. HAART לא למגר את האיידס, ולכן החולים אינם נרפא וטיפול הוא חיים ארוכים. יש בעיות עם רעילות תרופה ועם הופעתה של סמים זנים עמידים. התנגדות יכולה להתעורר לכל תרופות שאושרו נגד האיידס, כוללים תרופות שאושרו לאחרונה כי יעד אינטגראז HIV (IN). עמידות לתרופות סבירה מתעוררת becaשימוש במוטציות ספונטניות המתרחשות בעת שכפול נגיפי (שיעור שגיאה של 3 x 10 מחזור -5 מוטציות / בסיס / שכפול) 6. כאשר מוטציות להתעורר בקידוד גנים למטרות של תרופות אנטי רטרווירלי, קבוצה קטנה של מוטציות אלה תוביל לירידה ברגישות של הזן הנגיפי לסמים. כדי למנוע ההתפתחות של עמידות לתרופה, ריכוז תרופה חייב להישמר ברמות שלדכא את שכפול נגיף האיידס באופן מלא. דבקות עניים למשטר הטיפולי מחריפה את הבעיה, ויכולה להוביל להתפתחות המהירה של התנגדות 7-9. למרות שריכוזי תרופה יכולים להשתנות בחולים עקב ספיגה שונה, חילוף חומרים, הפצה, ורמות הפרשה, ריכוזי תרופה גבוהים יכולים להוביל לרעילות 10. מאז הטיפול ממשיך לחייו של המטופל, יש חששות בטיחות חמורים על הרעילות ארוכת הטווח של retrovirals אנטי. Retrovirals נגד שימוש נפוץ בHAART יכול להיות תופעות לוואיnd יש כבר מקרים שבהם תופעות הלוואי הייתה סכנת החיים 11-15. בעיות חולים נתקלים עם ההתפתחות של עמידות ורעיל בבסיס הצורך בפיתוח תרופות חדשות שיעילות לחסום את השכפול של הזנים הנפוצים התרופה עמידות של הנגיף עם רעילות ארוך טווח קטן או לא.
לפיכך, יש צורך בassay שיכול להקרין לתרכובות לחסום צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי במהירות. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי להעריך את cytotoxicity של תרכובות והיכולת שלהם לחסום את השכפול של שני WT וזני HIV עמיד לתרופות במהירות וביעילות. Assay אנו משתמשים דומה לassay שפותח למסך בעמידות לתרופה בוירוס מבודד מהחולים 16-18.
למרות assay ניתן להשתמש בם ללא שינוי למסך עבור תרכובות שיכולים לחסום שעתוק לאחור איידס, אנו descrIBE באמצעות assay להעריך במעכבים. IN הוא אנזים נגיפי חיוני שמוסיף את ה-DNA הנגיפי לתוך הגנום התאי 19. למרות מספר מבטיח במעכבים מפותחים, שחלקם כעת בתהליך של ניסויים קליניים, רק 20 Isentress, 21 (הידוע גם בRaltegravir או RAL) ולאחרונה, Elvitegravir (EVG) 22 וDolutegravir (DTG) 23 היו שאושר על ידי ה-FDA. תרכובות אלו הן פעילים נגד שני HIV B ו-B תת הלא בתרבית תאים ובחולים 24, 25. עם זאת, טיפול בRAL בוחר לעמידים לתרופות HIV-1 במוטציות, כולל Y143R, N155H, וG140S/Q148H 24, 26-31. N155H וG140S/Q148H גם להפחית את היעילות של EVG, המדגישה את הצורך לעצב ולפתח את הדור שני במעכבי העברת גדיל (INSTIs) כי הם יעילים נגד מוטציות עמידות אלה.
אנו מתארים assay מהיר, יעיל, ושחזור שניתן להשתמש בם לתרכובות מסך לcytotoxicity ויכולתם כדי לעכב את השכפול של שני WT וסמים עמידים HIV-1. היכולת לזהות במהירות תרכובות ובדיקת היעילות ורעילה לתאים שלהם היא קריטית בפיתוח של תרופות חדשות ומשופרות נגד HIV-1. ברגע שתרכובות עופרת מזוהות, אנלוגים של המתחם להוביל יכולים להיות מיוצרים ונבדקו תוך שימוש באותה assay. Assay הוא יחסית פשוט. ישנן שני בקרות חיוביות ושליליות המאפשרות למשתמש כדי לאבחן את הבעיות הנפוצות ביותר (תרכובות רעילות, בעיות עם מניית הווקטור). השימוש בסט שלושה עותקים של בארות ללא מתחם הוסיף מראה כי זיהום ויראלי התרחש. העובדה שcytotoxicity נמדד בassay עצמאי נמנעה פרשנות שגויה לירידה בלוציפראז נגרמת על ידי cytotoxicity כהשפעה ספציפית על שכפול נגיפי.
השלבים הקריטייםבפרוטוקול מכינים את הצלחות, כך שהתאים מפוזרים באופן אחיד בבארות, שיש להם הבארות ריכוזים תקינים של התרכובות להיבדק, ומוסיף את אותה הכמות של וירוס לכל אחת מהבארות, ומדידת פעילות לוציפראז כדי לקבוע את CC 50 וIC 50 ערכים.
Assay הוא בטוח, כמוני, ושחזור. Assay הוא בטוח כי הווקטור הוא שכפול פגום. Assay הוא כמוני ולשעתק משום שהיא מבוססת על וקטור אחד עגול שמבטא לוציפראז, אשר ניתן assayed במדויק ובנוחות. בassay שכפול נגיף עגול רב, IC נמדד 50 תלוי במספר מחזורי חיים נגיפיים; מדובר בבעיה מסוימת כאשר מבחני כרוכים בשני WT ווירוסים עמידים לתרופות שעשויות להיות יכולות שכפול שונות באופן משמעותי.
יש כמה מבחני האנזימטית כבר דיווחו כי יכולים בעברלשמש מסך למעכבי IN. מבחני שכוללים טכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת כדי למדוד DNA המשולב דורשים חלבונים מטוהרים רקומביננטי (ים), והם, באופן כללי, הן יותר עבודה אינטנסיבית ויקר 36, 37. למרות שניתן להשתמש במבחנים האנזימטית כדי למדוד את ההשפעה של תרכובות על אנזימים האחרים נגיפיים (RT ופרוטאז), כל אנזים דורש מערכת assay משלו. Assay וקטור הסיבוב אחד, כפי שתואר, ניתן להשתמש בם, ללא שינוי, מסך עבור מעכבי RT. Assay דומה יכול לשמש מסך למעכבי פרוטאז; עם זאת, בassay מעכבי פרוטאז, התרכובות יש להוסיף לתאים המשמשים לייצור הווקטורים. Assay בנושא, תוך שימוש בתאים ווקטורים שונים, יכול גם לשמש מסך למעטפה (env) ומעכבי איחוי כניסת ה-HIV. לבסוף, ניתן להשתמש assay, בקנה מידה גדול יותר, עם מכשירי רובוטית אוטומטיים. לפיכך, assay יכול לשמש מסך ספריות גדולות של תרכובות נגד WT ומטרutant-HIV. עם זאת, העובדה assay יכול לזהות מעכבי של שכפול נגיף איידס שפועל בשלבים שונים של מחזור החיים נגיפיות נקודות להגבלה בפרשנות הנתונים. על ידי עצמו assay אינו מגדיר ששלב במחזור החיים חסום על ידי מתחם. אם שאלה זו מתעוררת, ניתן לפתור אותו על ידי שימוש בזמן של מבחני בנוסף 38, ועל ידי בדיקת המתחם נגד חלבונים נגיפיים רקומביננטי מטוהרים.
למרבה הצער, למרות ההצלחה של תרופות נגד HIV, יש עדיין בעיות עם שניהם התנגדות ורעילות. בהיעדר חיסון ל-HIV אנטי יעיל, יש צורך לא רק לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות שתהיינה יעיל נגד מוטציות עמידות לתרופות הקיימות, אלא גם לפתח תרופות מונעות שיכול לצמצם את התפשטות הנגיף. אם שימוש מניעתי בתרופות נגד HIV incudes הטיפול של אנשים נגוע, גישה זו תציב את נטל מיוחד על פיתוח תרופות שיש little או ללא רעילות לטווח ארוך.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של NCI.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |