这里我们描述了细胞的细胞毒性和单轮感染性测定允许对化合物的快速,准确的筛选以确定它们的细胞毒性(CC 50)和IC 50值对WT和耐药性的HIV-1。
虽然一些抗HIV药物已被批准,但仍有问题,毒性和耐药性。这表明需要鉴定新的化合物,可以由共同的耐药性的HIV-1毒株具有最小的毒性抑制感染。在这里,我们描述了可以用于快速确定该细胞的细胞毒性和抗WT和突变型病毒株的化合物的功效的高效测定。
所需的目标细胞系接种在96孔板中,并24小时温育后,被测试化合物的连续稀释液加入。没有进一步的操作所必需的细胞的细胞毒性测定法;对于抗HIV测定的任一WT或耐药的HIV-1载体,表达荧光素酶加入到细胞中一个预定量。的细胞毒作用是通过使用一个ATP依赖的发光测定法和感染性化合物的影响测定是通过测定lucife的量测RASE在存在或不存在的推定抑制剂。
此筛选测定需要4天时间来完成和多个化合物可以并行进行筛选。筛选化合物以一式三份,并在数据被归一化到感染性/ ATP水平中不存在目标化合物。这种技术提供了潜在的抗HIV化合物的功效和毒性的快速和准确的测量。
的目标在HIV-1病毒的生命周期的几个基本步骤药品的供应,导致药物联合疗法(称为高效抗逆转录病毒疗法,或HAART),极大地提高了治疗的HIV-1感染和长期生存的病人。 HAART治疗,通常使用两种核苷逆转录酶(RT)抑制剂,要么蛋白酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂的组合,现在已经转换成一种致命的疾病成为寿命长条件1-5。然而,尽管鸡尾酒疗法在病毒复制的持续抑制了许多成就,但也有局限性。 HAART治疗不根除艾滋病病毒,所以病人没有治愈,治疗是寿命长。有问题的药物的毒性,并与药物抗性菌株的出现。阻力位可以出现于所有的被认可的抗HIV药物,包括新批准的药物,针对HIV整合酶(IN)。耐药性的产生可能贝科利用病毒复制(3×10 -5突变/基地/复制周期误差率)过程中发生的自发突变6。当突变发生在编码基因的反转录病毒药物的目标,这些突变的一小部分会导致在病毒株的敏感性的药物的减少。避免耐药性的发展,药物浓度必须维持在充分地抑制HIV复制的水平。穷坚持治疗方案加剧了这一问题,并可能导致电阻7-9的快速发展。虽然药物浓度可在患者有所不同,因为不同的吸收,代谢,分布和排泄水平,高浓度的药物可导致中毒10。由于继续治疗的病人的生命,大约有抗逆转录酶病毒药物的长期毒性严重的安全问题。抗逆转录病毒药物鸡尾酒疗法中常用的可以有不利影响次出现了发病率,其中的副作用,已危及生命11-15。患者的抵抗力和毒性的发展遇到的问题背后,需要开发新的药物,有效地阻断病毒的很少或根本没有长期毒性的常见耐药菌株的复制。
因此,有必要对一个测定,可以筛选阻断在病毒生命周期的基本步骤很快化合物。在这里,我们描述了可以用来评估化合物和它们的迅速和有效地阻断WT和药物抗性HIV病毒株的复制能力的细胞毒性高效率的检测。我们使用的测定法类似,被开发的病毒从患者16-18分离筛选耐药性的测定法。
虽然可以使用,而无需修改屏幕,可以阻止艾滋病病毒逆转录化合物的分析中,我们将DESCRIBE使用试验,以评估抑制剂。中是一个重要的病毒酶,插入病毒DNA进入细胞基因组19。虽然正在开发一些有前途的抑制剂,其中一些目前正在进行临床试验,只有20的Isentress,21(也称为拉替拉韦或RAL),最近,Elvitegravir(EVG)22和Dolutegravir(DTG)23人被FDA批准。这些化合物具有抗艾滋病病毒B和细胞培养非亚型乙双方及患者24,25。然而,RAL治疗选择为耐药的HIV-1突变体中,包括Y143R,N155H和G140S/Q148H 24,26-31。 N155H和G140S/Q148H也减少了EVG的功效,它强调需要来设计和开发第二代链转移抑制剂(INSTIs)是可以有效对付这些耐药突变。
我们描述了一种快速,有效和可重复的试验,可用于筛选化合物的细胞毒性和它们抑制WT和耐药的HIV-1的复制能力。快速识别化合物,并测试其疗效和毒性的能力是至关重要的新的和改进的药物抗HIV-1的发展。一旦铅化合物被确定,铅化合物的类似物,可以产生并使用相同的测定中测试。该测定是相对简单的。有两个阳性和阴性对照,允许用户来诊断的最常见问题(毒性化合物,存在的问题与载体stock)。使用一式三份组井与没有添加化合物的表示发生病毒感染。细胞毒性的测量是在一个独立的试验中的事实避免误解在荧光素酶的减少所造成的细胞毒性作为病毒复制的特定效果。
的关键步骤在协议中被制备的板,使细胞均匀地分布在孔中,该孔具有适当浓度的待测试的化合物中,加入病毒的相同数量的每个孔中,并测定荧光素酶活性,以确定CC 50和IC 50值。
该法是安全的,定量,重现性好。该测定是安全的,因为该载体是复制缺陷型。该测定是定量的和可重复的,因为它是基于一个单一圆形矢量,表达荧光素酶,它可以准确和方便地进行测定。在多轮病毒复制测定法,测得的IC 50值依赖于病毒生命周期的数目;这是一个特别的问题时,检测涉及WT和药物可能具有显著不同的复制能力,抗病毒。
已经有一些酶检测报告之前,可以可用于筛查中的抑制剂。涉及实时PCR技术来测量整合的DNA检测需要纯化的重组蛋白(S),并且,在一般情况下,两个更多的劳动密集和昂贵36,37。尽管有可能使用酶测定来测量化合物对其它病毒酶(RT和蛋白酶)的影响,每种酶都需要它自己的检测系统。一个圆形矢量测定,如上所述,可以使用,而无需修改,以筛选RT抑制剂。一个类似的试验,可用于筛选蛋白酶抑制剂;然而,在蛋白酶抑制剂的测定法,所述化合物必须被添加到用于制备载体的细胞。一个相关的实验中,使用不同的细胞和载体,也可用于筛选包膜(ENV)和HIV进入融合抑制剂。最后,该法可用于,在更大的规模,利用自动机械手的分配器。因此,该测定可用于筛选化合物的大文库抗WT和米utant艾滋病病毒。然而,事实上该测定可检测的HIV复制抑制剂,作用在病毒生命周期的点,在分析数据的限制不同的阶段。通过自身的测定并没有定义该步骤在生命周期中被阻止的化合物。如果这个问题出现了,这可以通过使用另外测定38的时间来解决,并通过测试对纯化的重组病毒蛋白的化合物。
不幸的是,尽管抗HIV药物的成功,仍然有问题的,这两个电阻和毒性。在没有有效的抗HIV疫苗,有必要不仅要开发新的治疗药物,这将有效地对抗现有药物抗性突变体,还开发预防性药物,可以减少病毒的传播。如果预防性使用抗HIV药物incudes未感染者的治疗,这种方法会放置一个特殊的负担,开发那些有升药ittle或无长期毒性。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了国家癌症研究所的院内研究计划的支持。
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |