Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.
Hoewel een aantal anti HIV geneesmiddelen zijn goedgekeurd, zijn er nog steeds problemen met toxiciteit en geneesmiddelresistentie. Dit toont behoefte om nieuwe verbindingen die infectie kan remmen door het gemeenschappelijk resistente HIV-1 stammen met minimale toxiciteit identificeren. Hier beschrijven we een efficiënte test die kan worden gebruikt om snel bepalen van de cellulaire cytotoxiciteit en werkzaamheid van een verbinding met WT en mutante virusstammen.
Het gewenste doel cellijn wordt geënt in een 96-well plaat en, na 24 uur incubatie serieel verdunningen van de te testen verbindingen toegevoegd. Verdere manipulaties vereist voor cellulaire cytotoxiciteit assays; anti HIV-testen een vooraf bepaalde hoeveelheid ofwel een WT of geneesmiddel resistente HIV-1 vector die expressie luciferase wordt toegevoegd aan de cellen. De cytotoxiciteit wordt gemeten met een ATP-afhankelijke luminescentie assay en het effect van de verbindingen op infectiviteit wordt gemeten door de hoeveelheid luciferase in aanwezigheid of afwezigheid van het vermeende remmers.
Deze screening test duurt 4 dagen in beslag en meerdere verbindingen kunnen worden gescreend parallel. Verbindingen worden vertoond in drievoud en de gegevens worden genormaliseerd om de besmettelijkheid / ATP-niveaus in afwezigheid van doelverbindingen. Deze techniek biedt een snelle en nauwkeurige meting van de werkzaamheid en toxiciteit van potentiële anti HIV stoffen.
De beschikbaarheid van geneesmiddelen gericht op verschillende essentiële stappen in de HIV-1 virale levenscyclus heeft geleid tot gecombineerde therapie (zogenaamde actieve anti retrovirale therapie, of HAART) die sterk verbeterd de behandeling van HIV-1 infecties en de lange termijn overleving patiënten. HAART, die doorgaans gebruikt combinaties van twee nucleoside reverse transcriptase (RT)-remmers en ofwel een proteaseremmer of een non-nucleoside RT-remmer, is nu omgebouwd van een dodelijke ziekte in een levenslange aandoening 1-5. Ondanks de vele successen van HAART in aanhoudende onderdrukking van virale replicatie, heeft het beperkingen. HAART niet uit te roeien HIV, zodat de patiënten niet genezen en therapie is het leven lang. Er zijn problemen met drugs toxiciteit en met de opkomst van resistente stammen. Resistentie kan ontstaan voor alle goedgekeurde anti HIV drugs, waaronder de onlangs goedgekeurde geneesmiddelen die HIV integrase (IN) richten. Drug resistentie waarschijnlijk ontstaat becagebruik van spontane mutaties die optreden tijdens virale replicatie (foutenmarge van 3 x 10 -5 mutaties / base / replicatie cyclus) 6. Wanneer mutaties optreden in genen die coderen voor de doelwitten van anti remmers, zal een kleine subset van deze mutaties leiden tot een afname in de gevoeligheid van de virale stam voor de drugs. Om de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen te voorkomen, moet drugconcentraties worden gehandhaafd op een niveau dat HIV-replicatie volledig te onderdrukken. Slechte therapietrouw van het therapeutische regime verergert het probleem, en kan leiden tot de snelle ontwikkeling van resistentie 7-9. Hoewel de concentraties van het geneesmiddel kan variëren in patiënten als gevolg van verschillen in de absorptie, metabolisme, verspreiding en excretie, kunnen hoge concentraties van geneesmiddelen leiden tot toxiciteit 10. Sinds therapie blijft voor het leven van de patiënt, zijn er ernstige bezorgdheid over de veiligheid van de toxiciteit op lange termijn van de anti retrovirale medicijnen. De anti-retrovirale medicijnen vaak gebruikt in HAART kan nadelige gevolgen hebbennd zijn er incidenten waarbij de bijwerkingen zijn levensbedreigende 11-15 geweest. De patiënten ondervinden problemen bij de ontwikkeling van resistentie en toxiciteit ten grondslag aan de behoefte om nieuwe geneesmiddelen die effectief blokkeert de replicatie van het gemeenschappelijk resistente stammen van het virus met toxiciteit weinig of geen lange termijn ontwikkelen.
Er is dus een behoefte aan een test die kan screenen op verbindingen die essentiële stappen blok in de virale levenscyclus snel. Hier beschrijven we een efficiënte test die kan worden gebruikt om de cytotoxiciteit van de verbindingen en hun vermogen om de replicatie van zowel WT en resistente HIV-stammen snel en efficiënt blokkeren evalueren. De test die we gebruiken is vergelijkbaar met een test die is ontwikkeld voor het screenen van geneesmiddelen resistentie van het virus geïsoleerd uit patiënten 16-18.
Hoewel de test zonder wijziging scherm kan worden gebruikt voor verbindingen die HIV reverse transcriptie blokkeren, zullen we describe met de test te evalueren IN remmers. IN een essentieel viraal enzym dat het virale DNA in het cellulaire genoom 19 ingevoegd. Hoewel een aantal veelbelovende IN remmers ontwikkeld, waarvan sommige momenteel klinische proeven slechts Isentress 20, 21 (ook bekend als Raltegravir of RAL) en meer recent, Elvitegravir (EVG) 22 en Dolutegravir (DTG) 23 zijn goedgekeurd door de FDA. Deze verbindingen zijn actief tegen zowel HIV B's niet B subtypes in celkweek en bij patiënten 24, 25. Echter, de behandeling met RAL selecteert voor resistente HIV-1 IN mutanten, waaronder Y143R, N155H en G140S/Q148H 24, 26-31. N155H en G140S/Q148H ook de werkzaamheid van EVG, die de noodzaak voor het ontwerpen en ontwikkelen van de tweede generatie IN strand transfer inhibitoren (INSTIs) die effectief zijn tegen deze resistente mutaties zijn benadrukt verminderen.
We beschrijven een snelle, efficiënte en reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor het screenen voor verbindingen cytotoxiciteit en hun vermogen om de replicatie van zowel WT en resistente HIV-1 remmen. De mogelijkheid om snel verbindingen identificeren en testen hun doeltreffendheid en cytotoxiciteit is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe en betere geneesmiddelen tegen HIV-1. Zodra loodverbindingen zijn geïdentificeerd, kunnen analogen van de loodverbinding worden bereid en getest met gebruikmaking van dezelfde assay. De bepaling is relatief eenvoudig. Er zijn zowel positieve als negatieve controles die de gebruiker toestaan om de meest voorkomende problemen (toxische verbindingen, problemen met de vector stock) te diagnosticeren. Het gebruik van een drievoudige reeks putjes zonder toegevoegde verbinding blijkt dat virale infectie heeft plaatsgevonden. Dat cytotoxiciteit wordt gemeten in een onafhankelijke test voorkomt verkeerd verlaging van luciferase door cytotoxiciteit als een specifiek effect op virale replicatie.
De kritische stappenin het protocol bereiden de platen zodat de cellen gelijkmatig verdeeld in de putjes die de putjes de juiste concentraties van de te testen verbindingen, toevoegen van dezelfde hoeveelheid virus aan elk van de putjes en het meten van de luciferase activiteit bepalen de CC 50 en IC 50-waarden.
De test is veilig, kwantitatieve en reproduceerbare. De test is veilig omdat de vector replicatie defect. De bepaling is kwantitatief en reproduceerbaar omdat het gebaseerd is op een enkele ronde vector die luciferase tot expressie, die nauwkeurig en gemakkelijk kan worden getest. In een multi ronde virusreplicatie assay gemeten IC50 afhankelijk van het aantal virale levenscycli; Dit is vooral een probleem wanneer de testen te betrekken zowel WT en resistente virussen die significant verschillend replicatie capaciteiten kunnen hebben.
Er zijn verschillende enzymatische assays eerder gemeld dat kanworden gebruikt om te screenen op remmers IN. Testen die real-time PCR-technologie te betrekken bij geïntegreerde DNA meten vereisen gezuiverde recombinante eiwitten (s), en zijn in het algemeen, zowel meer arbeidsintensief en duur 36, 37. Hoewel het mogelijk is om enzymatische assays om het effect van verbindingen op de andere virale enzymen (RT en protease) meten elk enzym vereist zijn eigen testsysteem. De een ronde vector assay, zoals beschreven, kunnen worden gebruikt zonder modificatie te screenen op RT inhibitoren. Een vergelijkbare test kan worden gebruikt om te screenen op proteaseremmers; In een proteaseremmer assay, de verbindingen worden toegevoegd aan de cellen die de vectoren. Een verwante test met verschillende cellen en vectoren kunnen ook worden gebruikt om te screenen op middelen (env) en HIV ingang fusieinhibitors. Ten slotte kan de test worden gebruikt, op grotere schaal, met geautomatiseerde robot dispensers. Aldus kan de assay worden gebruikt om grote bibliotheken van verbindingen te screenen tegen WT en mutant HIV. Echter, het feit dat de test kan een remmer van HIV-replicatie die in verschillende fases van de virale levenscyclus wijst op een beperking in de interpretatie van de gegevens te detecteren. Door zelf de test niet bepalen welke stap in de levenscyclus wordt geblokkeerd door een verbinding. Als deze vraag kan worden opgelost door de tijd van toevoeging assays 38 en door het testen van de verbinding tegen gezuiverde recombinante virale eiwitten.
Helaas, ondanks het succes van anti HIV medicijnen, zijn er nog steeds problemen met zowel weerstand en toxiciteit. Aangezien een effectieve anti HIV-vaccin, is het niet alleen nodig om nieuwe therapeutische geneesmiddelen die effectief zijn tegen bestaande resistente mutanten, maar ook voor profylactische geneesmiddelen die de verspreiding van het virus kan reduceren ontwikkelen. Als het profylactisch gebruik van anti HIV drugs incudes de behandeling van niet-geïnfecteerde mensen, zal deze aanpak een bijzondere last leggen op de ontwikkeling van geneesmiddelen die worden hebben little of geen toxiciteit op lange termijn.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de Intramurale Research Program van het NCI.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |