सबसे अच्छा: Tetrads के बारकोड Enabled अनुक्रमण

Summary

Tetrads के बारकोड Enabled अनुक्रमण (सर्वोत्तम), अलग खलल न डालें और tetrads रिक्ति के मैन्युअल प्रक्रिया को बदलता है. श्रेष्ठ, अगर प्लेटों पर छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा tetrads आइसोलेट्स ग्लास मनकों के साथ आंदोलन द्वारा बीजाणुओं को अलग करता है, और बेतरतीब ढंग से arrayed कालोनियों आणविक बारकोड का उपयोग कर एक ही मूल TETRAD से प्राप्त किए गए, जो निर्धारित करता है.

Abstract

TETRAD विश्लेषण खमीर आनुवंशिकी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, लेकिन इस प्रक्रिया की श्रमसाध्य पुस्तिका प्रकृति बड़े पैमाने पर अपने आवेदन रुकावट है. बारकोड Tetrads का अनुक्रमण (सर्वोत्तम) ^1, अलग खलल न डालें और tetrads रिक्ति के मैन्युअल प्रक्रिया को बदलता है Enabled. श्रेष्ठ सीधे ASCUS enzymatically पच जाता है और बीजाणुओं बाधित कर रहे हैं और बेतरतीब ढंग से गिलास मनका चढ़ाना द्वारा arrayed जहां अगर प्लेटों, पर tetrads की प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई कि परमिट एक sporulation विशेष GFP संलयन प्रोटीन की हैसियत से tetrads आइसोलेट्स. बीजाणुओं जीनोटाइपिंग के दौरान पढ़ा आणविक बारकोड का उपयोग कर, एक ही TETRAD से उत्पन्न यानी जानकारी के बारे में जो अगुणित कालोनियों तो, बहन बीजाणु रिश्तों सौंपा है. पुस्तिका विच्छेदन की टोंटी को दूर करके, tetrads के भी सैकड़ों या हजारों मिनट में अलग किया जा सकता है. यहाँ हम खमीर में सबसे अच्छा प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण पेशSaccharomyces cerevisiae, अगुणित meiotic संतान से व्युत्पन्न कालोनियों के अलगाव के माध्यम से एक विषमयुग्मजी द्विगुणित तनाव के साथ शुरू.

Introduction

सामान्यतः TETRAD विश्लेषण के रूप में जाना जाता meiotic जीन मैपिंग, खमीर आनुवंशिकी के लिए केंद्रीय है. संक्षेप में, प्रत्येक प्रत्येक गुणसूत्र की एक एक प्रति युक्त दो अगुणित उपभेदों, प्रत्येक गुणसूत्र की दो प्रतियां, प्रत्येक माता पिता से एक के साथ एक विषमयुग्मजी द्विगुणित तनाव फार्म के लिए mated रहे हैं. नाइट्रोजन के लिए द्विगुणित कोशिकाओं को भूख गुणसूत्रों, नकल पुनर्व्यवस्था से गुजरना है, और प्रत्येक माता पिता से alleles के नए संयोजन के साथ चार अगुणित कोशिकाओं (बीजाणुओं या segregants) में विभाजित (sporulation) जिसमें अर्धसूत्रीविभाजन लाती है. एक एकल अर्धसूत्रीविभाजन से उत्पन्न चार बीजाणुओं TETRAD विच्छेदन नामक एक मैन्युअल प्रक्रिया से अलग किया जा सकता है.

1937 ⁴ में मूल प्रकाशन के बाद से अपेक्षाकृत थोड़ा बदल गया है, जो परम्परागत TETRAD विच्छेदन ^2,3, तीन लक्ष्य हैं. सबसे पहले, अर्धसूत्रीविभाजन (tetrads) आया है कि कोशिकाओं वनस्पति कोशिकाओं की एक पृष्ठभूमि से दूर अलग किया जाना चाहिए. पारंपरिक विश्लेषण में, इस का उपयोग करते हुए, जो एक शोधकर्ता द्वारा पूरा किया हैएक माइक्रोस्कोप, नेत्रहीन एक अगर प्लेट पर tetrads को दिखाता है और एक micromanipulator तंत्र नेत्रहीन एक अगर प्लेट पर tetrads की पहचान करने और प्लेट की एक सेल मुक्त क्षेत्र पर TETRAD स्थानांतरित करने के लिए एक micromanipulator का उपयोग कर काम करते हैं. अगला, TETRAD में चार बीजाणुओं शारीरिक रूप से interspore संभोग को रोकने के लिए अलग किया जाना चाहिए. एक TETRAD भीतर बीजाणु एक ASCUS, मूल द्विगुणित सेल सेल की दीवार के अवशेष, और interspore पुलों ⁵ का एक सेट दोनों ने एक साथ आयोजित की जाती हैं. पारंपरिक TETRAD विश्लेषण में ASCUS enzymatic पाचन द्वारा हटा दिया, और एक शोधकर्ता interspore पुल को तोड़ने और बीजाणुओं अलग तंग करने micromanipulator का उपयोग करता है. अंत में, व्यक्तिगत बीजाणुओं बीजाणुओं के बीच रिश्ता रखता है कि एक gridded पैटर्न में arrayed रहे हैं, चार की एक पंक्ति में यानी सभी संतान एक ही मूल TETRAD की बहन बीजाणुओं हैं. एक अनुभवी खमीर शोधकर्ता 10 tetrads (एक आम तौर पर स्वीकार न्यूनतम संख्या विदारक की प्रक्रिया को पूरा कर सकते हैंलगभग 15 मिनट में) पार प्रति.

हम ¹ (सर्वोत्तम) टी etrads की nabled एस equencing बी arcode ई जो फोन एक नए उच्च throughput TETRAD जीनोटाइपिंग विधि विकसित किया है. श्रेष्ठ अलग कर रहे हैं कि संतान की बड़ी संख्या, genotyped, और सभी चार meiotic उत्पादों की बहन बीजाणु रिश्तों बरामद करने की अनुमति देता है एक तरह से व्यक्तियों के रूप में बनाए रखा है की पीढ़ी और जीनोटाइपिंग सक्षम करने से उच्च throughput जेनेटिक्स में मौजूदा तरीकों पर फैलता है. यह तीन मुख्य रणनीति (चित्रा 1) का उपयोग कर पूरा किया है. सबसे पहले GFP के साथ अर्धसूत्रीविभाजन आया है कि कोशिकाओं लेबल और उन्हें छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा अलग किया जा करने की अनुमति देता है कि एक पत्रकार के निर्माण की शुरूआत है. दूसरा एक TETRAD के सभी चार बीजाणुओं से फैलता है और पुनः संयोजक progen के डीएनए अनुक्रमण द्वारा पढ़ा जा सकता है कि एक फार्म में एक अत्यधिक जटिल डीएनए बारकोड का समावेश (15 यादृच्छिक nucleotides के एक स्ट्रिंग) हैइस प्रकार y और एक ही TETRAD से बहन बीजाणुओं को पहचानती है. तीसरा जीनोटाइपिंग कदम है, और सबसे अच्छा है कि कब्जा जीनोमिक मार्करों के एक सेट के रूप में अच्छी तरह से TETRAD विशेष बारकोड दोनों कई जीनोटाइपिंग प्लेटफार्म के साथ संगत है. हम इस तरह एक सुसंगत 2-3 संतान उपभेदों के जीनोम का% के साथ ही कब्जा करने, एक प्रतिबंध साइट जुड़े डीएनए टैग अनुक्रमण (रेड-seq) विशिष्ट प्रतिबंध साइटों ¹ जीनोम अनुक्रमण कि निर्देशन ⁶ विधि रोजगार प्लाज्मिड जनित बारकोड . पार से अनुभव से व्युत्पन्न जीनोटाइपिंग डेटा के साथ TETRAD रिश्तों की वसूली कम अनुक्रम कवरेज के साथ मार्कर की स्थिति और inviable (और इसलिए अप्राप्य) व्यक्तियों की पूरी जीनोटाइप सहित लापता जानकारी के सटीक अनुमान की अनुमति देता है. यहाँ, हम meiotic मानचित्रण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सूक्ष्मजीव, खमीर एस में विधि के आवेदन का वर्णन cerevisiae. हालांकि, जीव विशेष वजह से मामूली प्रतिस्थापन के साथमर्द, GFP के लिए जुड़े हुए जैसे विभिन्न sporulation विशेष प्रोटीन, विधि meiotic मानचित्रण गहन या वर्तमान में असभ्य काफी अधिक श्रम है जिसमें जीवों सहित अन्य सूक्ष्मजीवों को आसानी से संक्रमणीय होना चाहिए.

चित्रा 1. सबसे अच्छा तरीका. (ए) pCL2_BC प्लाज्मिड एक sporulation विशेष GFP संलयन, G418 के लिए प्रतिरोध, और एक 15 मेर यादृच्छिक बारकोड के साथ एक 2 माइक्रोन प्लाज्मिड है. प्लाज्मिड पुस्तकालय का निर्माण लुडलो एट अल ¹ में वर्णित है. (बी) बारकोड वाले plasmids के एक पूल एक पार से द्विगुणित तनाव में तब्दील हो जाता है. (सी) transformants तब चयन पर हो रहे हैं और ~ 10,000 तब्दील कालोनियों जमा और sporulated रहे हैं. अर्धसूत्रीविभाजन दौरान एक TETRAD की प्रत्येक बीजाणु एक सह संभालतेबारकोड वाले प्लाज्मिड के py. (डी) Tetrads FACS द्वारा unsporulated कोशिकाओं से अलग कर दिया और वे पचा और प्रत्येक बीजाणु एक कॉलोनी बनाने के लिए अनुमति को बाधित कर रहे हैं जहां अगर प्लेटों पर एकत्र कर रहे हैं. (ई) कालोनियों तो, 96 अच्छी तरह प्लेटें में उठाया phenotyped, और genotyped रहे हैं. जीनोटाइपिंग के दौरान प्लाज्मिड बारकोड को पढ़ने और प्रत्येक TETRAD के चार सदस्यों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह आंकड़ा लुडलो एट अल ¹ से संशोधित किया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Protocol

1. तनाव निर्माण और विशेषता

1. अगुणित उपभेदों संभोग और diploids ² का चयन या एक स्वाभाविक रूप से होती विषमयुग्मजी तनाव का उपयोग करके पार में प्रयोग की जाने वाली विषमयुग्मजी द्विगुणित तनाव का निर्माण. उपभेदों GFP बंदरगाह नहीं होना चाहिए.
2. तनाव YPD ² + 200 माइक्रोग्राम / एमएल G418 पर विकसित करने में असमर्थ है की पुष्टि.
3. तनाव sporulate करने में सक्षम है की पुष्टि. सबसे कम sporulation दक्षता पार के साथ संगत है, लेकिन कम sporulation आवृत्ति बढ़ FACS छँटाई समय की आवश्यकता है.
   1. 5 मिलीलीटर YPD में तनाव का एक हे / एन संस्कृति की स्थापना की और 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ हो जाना
   2. पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ हे / एन संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर तीन बार धोएं.
   3. धोया गोली कोशिकाओं, 2 मिलीलीटर sporulation मध्यम ⁷ में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend हटा दें.
   4. आरटी पर कोशिकाओं को उत्तेजित और एक 40x उद्देश्य के साथ एक चरण विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग TETRAD गठन के लिए दैनिक जांच ले.
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   5. Tetrads की एक छोटी संख्या (~ 20) की पारंपरिक विच्छेदन ^2,3 से पार की बीजाणु व्यवहार्यता का अनुमान है. अलग तनाव की पृष्ठभूमि के बीच पार में बीजाणु व्यवहार्यता व्यापक रूप से और उठते बदलता रहता है. हालांकि, बीजाणु व्यवहार्यता का एक प्राथमिकताओं उम्मीदों पूर्व उपभेदों बचत और जीनोटाइपिंग के श्रम और लागत प्रधान कदम के लिए एक अच्छा प्रयोग की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, इस चरण अत्यधिक की सिफारिश की है.

   बारकोड वाले plasmids के पुस्तकालय के साथ Diploids के 2. परिवर्तन

   1. निम्नलिखित संशोधनों के साथ GIETZ और वुड्स ⁸ में वर्णित परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग विषमयुग्मजी द्विगुणित तनाव में pCL2_BC बारकोड वाले प्लाज्मिड डालें.
      1. कोशिकाओं 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन मिश्रण के साथ incubated किए जाने के बाद, परिवर्तन मिश्रण की मात्रा के लिए 8% DMSO जोड़ें. DMSO के अलावा परिवर्तन दक्षता मैं सुधार पाया गया हैn कुछ तनाव पृष्ठभूमि ^9.
      2. गर्मी झटका कदम के बाद, एक संक्षिप्त centrifugation के साथ गोली कोशिकाओं परिवर्तन मिश्रण छानना, और YPD में धीरे कोशिकाओं धो लो. फिर, 1 मिलीलीटर YPD में कोशिकाओं resuspend और उन्हें आंदोलन के बिना 3 घंटे के लिए आरटी पर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.
   2. प्लेटों अगर YPD + G418 (200 माइक्रोग्राम / एमएल) पर चढ़ाना द्वारा transformants का चयन करें. प्लाज्मिड बारकोड की एक जटिल पूल सुनिश्चित करने के लिए, कालोनियों की एक बड़ी संख्या, प्रति प्लेट ~ 2500 कालोनियों के साथ 5 जैसे प्लेटें फसल.
   3. कालोनियों (30 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 2-3 दिन) दिखाई दे रहे हैं एक बार, ध्यान से तरल YPD + G418 (200 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर) + 15% ग्लिसरॉल में थाली उन्हें बंद scraping द्वारा transformants पूल. भंवर इस सेल निलंबन, एक cryopreservation शीशी के लिए स्थानांतरण, और सी. प्रत्येक थाली के लिए एक अलग जमे हुए शेयर बनाओ ° -80 पर फ्रीज. ये जमी शेयरों 3.1 चरण के लिए शुरू करने उपभेदों के रूप में सेवा और भी अगर वांछित, एक बाद की तारीख में अधिक tetrads उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

      3. बारकोड वाले Tetrads प्राप्त करने के लिए बदल कोशिकाओं की लाइब्रेरी Sporulating

      1. आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर YPD + G418 (200 माइक्रोग्राम / एमएल) में ओ / एन वृद्धि से 2.3 में बनाया जमी शेयरों से कोशिकाओं को पुनर्जीवित.
      2. हे कोशिकाओं से धो लो / एन संस्कृतियों पीबीएस (7.4 पीएच) में 3x और फिर sporulation मध्यम ⁷ प्लस 200 माइक्रोग्राम / एमएल G418 में कोशिकाओं resuspend.
      3. आरटी पर sporulation संस्कृतियों आंदोलन और नए tetrads बनाने बंद कर दिया है जब तक दैनिक sporulation प्रगति की निगरानी.
      4. संस्कृति अच्छी तरह से बनाई tetrads और अपेक्षाकृत कुछ dyads होता है एक बार, आंदोलन से संस्कृतियों को हटाने और कम से कम 7 दिनों के लिए आरटी पर छोड़ दें. कुछ पार (7.3 में वर्णित के रूप में मूल्यांकन) के रूप में जल्द ही tetrads का गठन किया है के रूप में थाली पाचन और विघटन पर करने के लिए उत्तरदायी हो सकता है, अतिरिक्त ऊष्मायन (हमारे प्रयोगों में 7-10 दिन) दूसरे पार के लिए आवश्यक है. इसलिए, इस चरण अत्यधिक की सिफारिश की है.

      4. स्थापनाTETRAD छँटाई के लिए FACS गेट्स

      meiotically pCL2_BC प्लाज्मिड पर SPS2-GFP संलयन sporulation संस्कृति में tetrads का पता चला और प्रतिदीप्ति द्वारा संस्कृति से अलग होने की अनुमति देता व्यक्त किया. निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक FACSAria द्वितीय के लिए विकसित किया गया है.

      
      चार अनुक्रमिक फाटकों के चित्रा 2. FACS फाटकों. एक श्रृंखला tetrads अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (ए) में दिखाया गया फाटक और (बी) के झुरमुटों की संख्या कम करने में मदद. फ्लोरिसेंट घटनाओं (सी) में गेट के साथ चुना जाता है. (डी) में हिस्टोग्राम दो चोटियों है. बाईं शिखर में घटनाक्रम मुख्यतः tetrads (बाएँ इनसेट छवि) हैं, और सही शिखर में घटनाओं को आम तौर पर एक संलग्न कली (सही इनसेट छवि) के साथ tetrads हैं. एक अंतिम द्वार हैज्यादातर tetrads (लाल बार) हैं जो घटनाओं को चुनने के लिए इस हिस्टोग्राम के लिए आवेदन किया. यह आंकड़ा एट अल ^1, लुडलो से संशोधित किया गया है.

      1. एक FACS सॉर्टर पर sporulated संस्कृति लोड और मलबे, clumped कोशिकाओं, और छोटी बूंद प्रति एकाधिक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए दो आगे तितर बितर और पक्ष बिखराव फाटकों की स्थापना (आंकड़े 2A और 2 बी).
      2. SPS2-GFP संवाददाता निर्माण का उपयोग करते समय dyads और tetrads ¹⁰ में शामिल हैं जो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की आबादी होनी चाहिए. गेट इन फ्लोरोसेंट घटनाओं (चित्रा -2) शामिल करने के लिए FSC बनाम GFP.
      3. तनाव की पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है यह tetrads और अन्य कोशिकाओं शामिल है कि clumps को दूर करने के लिए एक अतिरिक्त गेट शामिल करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह आवश्यक है, तो फ्लोरोसेंट की घटनाओं का एक FSC हिस्टोग्राम का निरीक्षण किया और कम FSC (चित्रा 2 डी, gated घटनाओं लाल रंग में हैं) के साथ घटना भी शामिल है कि एक गेट निर्दिष्ट.
      4. टी की दक्षता की जांच करें वह एक खुर्दबीन स्लाइड पर ~ 1500 tetrads छँटाई और 400X बढ़ाई पर एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग गैर tetrads को tetrads के अनुपात की गणना के द्वारा शासन gating. tetrads का प्रतिशत सही केवल ~ 200 क्रमबद्ध घटनाओं की गणना के द्वारा अनुमान लगाया गया है, लेकिन ~ 1500 के समय की राशि कम कर देता है छँटाई खुर्दबीन स्लाइड पर कोशिकाओं के लिए खोज खर्च किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, गैर tetrads को tetrads का अनुपात 4.5 कदम के दौरान मूल्यांकन किया जा सकता है.
      5. समय - समय सॉर्टर सही एक खुर्दबीन स्लाइड पर 25 tetrads छँटाई और 400X बढ़ाई पर एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग छोटी बूंद में समाहित कोशिकाओं की जांच से घटनाओं की संख्या की रिपोर्ट है कि जांच ले. छोटी बूंद में 25 tetrads होना चाहिए. FACS साधन के विचरण का आकलन करने के लिए 3-4x दोहराएँ.

      एक अगर थाली पर 5. छंटनी Tetrads

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      FACS सॉर्टर पर अगर प्लेट की चित्रा 3. नियुक्ति. एक मानक (सर्कुलर) अगर प्लेट, एक मानक (100 मिमी आयताकार) के बीच में रखा zymolyase समाधान की एक छोटी सी बूंद में tetrads सॉर्ट करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली पहला है सेल सॉर्टर के मंच पर रखा और सॉर्टर (इस मामले D5 में) एक विशिष्ट कुएं में tetrads जमा करने के लिए प्रोग्राम है. फिर, परिपत्र अगर प्लेट 96 अच्छी तरह से थाली के शीर्ष पर रखा और zymolyase की बूंद निर्दिष्ट अच्छी तरह पर केन्द्रित है ताकि गठबंधन किया है.

      1. FACS सॉर्टर के पास तैनात एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 1.5 घंटे के लिए YPD + G418 (200 माइक्रोग्राम / एमएल) के प्लेटों की वांछित संख्या गर्म.
      2. छँटाई प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता सही FACS zymolyase समाधान का एक पूल में शामिल है कि एक अगर प्लेट पर एक विशिष्ट स्थान पर tetrads क्रमबद्ध लक्षित करने की क्षमता है. टी पर ऐसा करने के लिए, एक "मील का पत्थर" जगह 96 अच्छी तरह से थालीवह सॉर्टर की सेल बयान इकाई (ACDU) स्वचालित. एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में से एक कुएं में 25 tetrads तरह का होगा कि एक प्रकार के लेआउट तैयार करें. चुनें एक अच्छी तरह से थाली के बीच निकट, जैसे अच्छी तरह D5. चित्रा 3 एक सेल सॉर्टर पर लादा एक पेट्री डिश और 96 अच्छी तरह से थाली से पता चलता है. प्रति प्लेट 25 tetrads छंटनी अच्छी तरह से अलग कालोनियों पैदावार.
      3. सॉर्टर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से 10 अगर प्लेटों का एक ढेर लाओ.
      4. प्लेट के केंद्र के पास अगर पर zymolyase समाधान में से एक अगर प्लेट और पिपेट 25 μl (0.7 मीटर sorbitol में 1 मिलीग्राम / एमएल) ले लो. फिर, कदम 5.2, जैसे अच्छी तरह D5 से अच्छी तरह से लक्ष्य से अधिक zymolyase छोटी बूंद aligning, मील का पत्थर 96 अच्छी तरह से थाली पर प्लेट रखें.
      5. सॉर्ट शुरू करें और अगर प्लेट पर zymolyase छोटी बूंद के मध्य में 25 tetrads जमा. फिर, हटाने और थाली को कवर किया.
      6. दोहराएँ 5.4 कदम और 5.5 25 तक tetrads ढेर में प्रत्येक प्लेट पर zymolyase बूंदों में हल किया गया है. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर TETRAD युक्त प्लेटों के ढेर पर लौटें.
      7. सभी प्लेटों tetrads है जब तक 5.7 के माध्यम से कदम 5.3 दोहराएँ.

      6. अलग बीजाणु

      1. 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर TETRAD युक्त अगर प्लेटों में से प्रत्येक पर ढेर सेते हैं.
      2. इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें प्लेट प्रति 15-25 बाँझ 3 मिमी ग्लास मनकों जोड़ें, और 3-5 मिनट के लिए एक ढेर (या 5 प्लेटों के दो ढेर के रूप में) के रूप में प्लेटें हिला. सबसे अच्छा बीजाणु जुदाई वापस करने के पक्ष या सामने की ओर से सख्ती से प्लेटें ले जाकर हासिल की है. इस तरह की थाली के बाहरी छोर के आसपास मोती "भंवर" प्लेटें कि हिलना मत. जब समाप्त प्लेटों पर मोती छोड़ दें.
      3. मोती एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सामना के साथ प्लेटों के ढेर रखें. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से अगले ढेर प्लेटें निकालते हैं, और 6.2 कदम दोहराएँ.
      4. 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों हे / एन सेते

      7. फसल काटने कालोनियों

      1. के बाद30 डिग्री सेल्सियस पर एक हे / एन ऊष्मायन, छोटी कालोनियों प्लेटों पर गठन किया जाना चाहिए. ध्यान से कांच के मोती परेशान बिना इनक्यूबेटर से प्लेटें हटा दें.
      2. सावधानी से कांच के मोती निकालें और जल्दी से एक गहरी कंटेनर पर प्लेटें पहले. कंटेनर उन्हें उछाल और अगर प्लेट को हिट करने की अनुमति के बिना मोतियों को पकड़ने के लिए पर्याप्त गहरा किया जाना चाहिए. यह उलटा है, जबकि प्लेट के नीचे दोहन की थाली के लिए फंस रहे हैं कि मोती बेदखल कर सकते हैं. ये मोती विआयनीकृत पानी के साथ अच्छी तरह से rinsing और autoclaving द्वारा स्टरलाइज़, साबुन के साथ पूरी तरह से धोने से पुन: उपयोग किया जा सकता है.
      3. प्रत्येक प्लेट पर कालोनियों की संख्या की गणना और बीजाणु जुदाई और वसूली की दक्षता आकलन करने के लिए कालोनियों की संख्या का उपयोग करें. उदाहरण के लिए, के पास 100% व्यवहार्यता के साथ एक क्रॉस के लिए प्रति प्लेट 25 tetrads प्रति प्लेट 100 कॉलोनियों की कुल उपज सकती है.
      4. प्रत्येक Colo से पर्याप्त कालोनियों की संख्या (एक उच्च व्यवहार्यता पार के लिए> 65), स्थानांतरण की कोशिकाओं के साथ प्लेटों से+ G418 YPD तरल युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक अलग और साथ में हिन्दी अनुवाद. इसके अलावा, कुओं वही अगर थाली से कालोनियों होते हैं जो का ध्यान करना; इस जानकारी TETRAD असाइनमेंट सॉफ्टवेयर सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
      5. जीनोटाइपिंग के लिए और जमे हुए ग्लिसरॉल शेयरों के रूप में उपभेदों बचत के लिए संस्कृतियों के बीज के लिए 96 अच्छी तरह से तरल प्लेट का उपयोग करें. रेड टैग अनुक्रमण और अनुक्रम विश्लेषण पर विवरण लुडलो एट अल ¹ में पाया जा सकता है.

Representative Results

श्रेष्ठ बहुत tetrads से बीजाणुओं अलग किया जा सकता है जो गति के साथ सुधार कर सकते हैं. इस विधि वितरित कर सकते हैं throughput के एक उदाहरण के रूप में, एक शोधकर्ता 3 घंटा ¹ में 149 अगर प्लेटों के साथ छँटाई FACS और बीजाणु जुदाई (कदम 5.1 6.3 के माध्यम से) का प्रदर्शन किया. एक बराबर उपज (लगभग 3,725 tetrads) पुस्तिका विच्छेदन की अधिक से अधिक 90 घंटे की आवश्यकता होगी. हालांकि, कई उच्च तरीकों के साथ के रूप में, विधि का वर्तमान स्वरूप का मार्गदर्शन विच्छेदन की तुलना में दक्षता के कुछ नुकसान भी हैं. कालोनियों की संख्या कम पुस्तिका विच्छेदन (1.4 कदम) द्वारा निर्धारित पार के बीजाणु व्यवहार्यता के आधार पर गणना की उम्मीद की तुलना में बरामद रूप में इस नुकसान से प्रकट होता है. बीजाणु नुकसान (चर्चा) के कारणों यादृच्छिक पर बीजाणुओं को प्रभावित यह मानते हुए कि अनुमानों बरामद कालोनियों 1, 2, 3, या 4 बीजाणुओं बरामद किया गया है जिसमें tetrads के सदस्यों (चित्रा 4) हो जाएगा कि कितने का बनाया जा सकता है.

TETRAD स्तर सफलतापूर्वक (कालोनियों के रूप में) बीजाणुओं को ठीक करने के लिए. विफलता पर विधि दक्षता की चित्रा 4. सिमुलेशन द्विपद बंटन इस्तेमाल किया गया था आदि बीजाणु inviability, कांच के मनकों को बीजाणु आसंजन, एक दूसरे से बीजाणुओं अलग करने के लिए विफलता के कारण हो सकता है सफलतापूर्वक बरामद सभी बीजाणुओं के अनुपात के आधार पर 4, 3, 2 या 1 कालोनियों का निर्माण (कम से कम एक सफलतापूर्वक बरामद बीजाणु साथ) tetrads की उम्मीद अंश की गणना करने के लिए. या 4 - - बीजाणु tetrads यह ग्राफ अंततः 3 में इकट्ठा किया जाएगा कि उपभेदों की संख्या के लिए एक मोटा गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं. थाली बढ़ जाती प्रति कालोनियों की संख्या के रूप में, तो बरामद पूरा tetrads की संख्या है.

प्रयोग में ऊपर वर्णित में, 100% करने के लिए बीजाणु व्यवहार्यता पास से एक पार से 25 tetrads (डेट के रूप में) पुस्तिका विच्छेदन द्वारा ermined ¹ 149 अगर प्लेटों पर चढ़ाया गया. इस प्रयोग में, प्लेट प्रति मनाया कालोनियों की अधिकतम संख्या 20 बीजाणुओं असतत कालोनियों के रूप में करने में विफल रहा है कि यह दर्शाता है, 80 था. प्लेट प्रति कालोनियों का मतलब संख्या 65 कालोनियों या अधिक युक्त 61 प्लेटें काटा और अनुक्रम थे से 62. कालोनियों था. या 4 - - अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण पारित किया कि 3700 उपभेदों में से, 72% computationally 3 में सौंपा जा सकता है बीजाणु tetrads.

Discussion

जटिल विशेषता मानचित्रण ¹¹ से डीएनए पुनर्संयोजन ¹² अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए लेकर आनुवंशिकी अनुसंधान के कई क्षेत्रों, संतान की बहुत बड़ी संख्या है और डीएनए अनुक्रमण की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है. उच्च throughput डीएनए अनुक्रमण की क्षमता के साथ परंपरागत तरीके से बिजली की शादी तकनीक है कि पहले से असभ्य थे कि अध्ययन के लिए सक्षम करने की क्षमता है. कई उच्च throughput खमीर आनुवंशिकी तरीकों विशिष्ट समस्याओं को प्रभावी ढंग से लागू किया गया है, प्रत्येक पारंपरिक TETRAD विश्लेषण के व्यापक प्रयोज्यता की कमी है कि सीमाएं हैं. TETRAD विच्छेदन के संयोजन एक उच्च throughput दृष्टिकोण को रोजगार और खमीर पार की संतान जीनोटाइपिंग द्वारा सर्वश्रेष्ठ पते इन चुनौतियों. मल्टिप्लेक्स रेड टैग अनुक्रमण के साथ संयोजन के रूप में, सबसे अच्छा अनूठा TETRAD बारकोड के माध्यम से TETRAD रिश्तों के संरक्षण, जबकि प्रत्येक संतान तनाव के लिए जीनोटाइप जानकारी बटोरने के लिए एक सस्ता तरीका प्रदान करता है.0; सभी इस समय उच्च तरीकों का इस्तेमाल किया, श्रेष्ठ सबसे निकट एक मैन्युअल विच्छेदित खमीर क्रॉस द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी का स्मरण दिलाता है.

सबसे अच्छा दो प्रमुख विशेषताएं है. पहले तेजी से (प्रोटोकॉल 5-6 कदम) दूर संस्कृति में unsporulated कोशिकाओं से tetrads अलग करने के लिए FACS का इस्तेमाल होता है. फ्लोरोसेंट घटनाओं (tetrads) के हजारों को अलग करने की क्षमता श्रेष्ठ throughput में इसकी सबसे बड़ी लाभ देता है. यह स्वचालन कारण नेत्रहीन दुर्लभ घटनाओं की पहचान करने की जरूरत वृद्धि हुई समय के लिए, कम sporulation दक्षता के साथ पार के लिए मार्गदर्शन विच्छेदन पर एक भी अधिक से अधिक लाभ प्रदान करता है. दूसरा प्रमुख विशेषता एक TETRAD की प्रत्येक बहन बीजाणु से फैलता है कि एक अत्यधिक जटिल आणविक बारकोड (प्रोटोकॉल चरण 2) का इस्तेमाल होता है. इन बारकोड बेतरतीब ढंग से की जरूरत है मैन्युअल रूप से एक आदेश ग्रिड में सरणी कोशिकाओं क्रमशः समाप्त होता है करने के लिए, एक अगर प्लेट भर में वितरित किया गया है कि बीजाणुओं के बीच TETRAD रिश्तों को फिर से संगठित computationally के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में,आणविक बारकोड और sporulation विशेष GFP रिपोर्टर जीन शारीरिक रूप से (एक ही प्लाज्मिड पर) से जुड़े हुए हैं, क्योंकि आणविक बारकोड को बनाए रखा है कि केवल tetrads FACS छँटाई के द्वारा चुना जाता है.

संस्कृतियों sporulation माध्यम में incubated किया जाना चाहिए कि समय की लंबाई को नियंत्रित करने वाले दो विचार कर रहे हैं. Sporulation विशिष्ट रिपोर्टर (SPS2 GFP) जल्दी अर्धसूत्रीविभाजन में व्यक्त किया है क्योंकि सबसे पहले, अकेले GFP अर्धसूत्रीविभाजन (यानी dyads) पूरा नहीं किया है कि कोशिकाओं से पूरा 4-बीजाणु tetrads भेद नहीं करता. अतिरिक्त FACS gating फ्लोरोसेंट, अधूरा tetrads की संख्या कम हो सकती है, वहीं इन अवांछित घटनाओं को कम करने के लिए सबसे आसान तरीका सिर्फ sporulation संस्कृति निगरानी (3.3 चरण) और एक बार नए tetrads बनाने बंद कर दिया है आगे बढ़ रहा है. हमारे प्रयोगों में, हल dyads की आवृत्ति 1% से कम है. दूसरा, आंदोलन के बिना आरटी पर sporulation माध्यम में बिताए कुछ पार अतिरिक्त समय के लिए हस्ताक्षर (3.4 चरण)nificantly वास्तव में, यह कदम कुछ पार के विघटन के लिए बहुत जरूरी है चढ़ाना दौरान ग्लास मनकों द्वारा tetrads की जुदाई ((प्रोटोकॉल चरण 6). सुधार.

सभी उच्च तरीकों की तरह, श्रेष्ठ इसी परंपरागत दृष्टिकोण से "शोर" है. पारंपरिक TETRAD विच्छेदन की तुलना में सर्वश्रेष्ठ में से दक्षता में मामूली कमी कई कारकों के संयोजन से परिणाम सकता है. एक कारक की वजह से प्रक्रिया के यांत्रिक तनाव के बीजाणु मौत प्रसार या बढ़ा दौरान कांच के मोती को आसंजन से परिणाम सकता है, अन्यथा व्यवहार्य बीजाणुओं की वृद्धि की हानि है. एक दूसरा पहलू अर्धसूत्रीविभाजन दौरान सरल प्लाज्मिड नुकसान हो सकता है. एक तीसरा पहलू मिश्रित जीनोटाइप के साथ कालोनियों से उत्पन्न प्रयोग करने योग्य कालोनियों में एक प्रभावी कमी हो सकता है, हमारे पायलट में कालोनियों की अनुमानित ~ 5% ¹ पार. यह इन कालोनियों बहन बीजाणु जुदाई की विफलताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं कि संभावना है. क्योंकि तेजी से Fluorescence छँटाई और बीजाणु जुदाई tetrads की भारी संख्या के संग्रह की अनुमति, अच्छा ठीक है इस पैमाने पर दक्षता में कमी दूर करने के लिए सुसज्जित है. सर्वश्रेष्ठ में से भविष्य पुनरावृत्तियों पुस्तिका विच्छेदन आ कि क्षमता में वृद्धि कर सकता है, यह डीएनए अनुक्रमण क्षमता की मौजूदा घातीय प्रक्षेपवक्र तेजी से प्रयोग करने योग्य तनाव घटाने के इस स्तर के लिए क्षतिपूर्ति करेगा कि शायद और अधिक होने की संभावना है. भले ही, सबसे अच्छा लागू किया जा सकता करने के लिए जो पैमाने पर TETRAD विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता वर्तमान में मैनुअल तरीके से unfeasible हैं कि पढ़ाई कर सकेंगे.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACSAria II (Special order unit)	BD Biosciences		Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488 nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto Petri dishes
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html