Summary
الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز على لوحات أجار، يفصل الجراثيم عن طريق التحريض مع الخرز الزجاجي، ويحدد التي تستمد المستعمرات المحتشدة عشوائيا من نفس الرباعيات الأصلي باستخدام الباركود الجزيئية.
Abstract
تحليل الرباعيات هو أداة قيمة لعلم الوراثة الخميرة، ولكن طبيعة دليل شاقة عملية أعاق تطبيقها على المقاييس الكبيرة. الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) 1 يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads بحكم بروتين GFP الانصهار تبوغ محددة تسمح مضان تنشيط الخلايا الفرز من tetrads مباشرة على لوحات أجار، حيث يتم هضم إنزيمي زق وتتعطل الجراثيم وبشكل عشوائي من قبل المحتشدة الزجاج والطلاء حبة. ثم يتم تعيين المستعمرات فرداني العلاقات بوغ أخت، أي معلومات حول أي جراثيم نشأت من نفس الرباعيات، وذلك باستخدام الباركود الجزيئية قراءة خلال التنميط الجيني. عن طريق إزالة عنق الزجاجة للتشريح دليل، أو حتى مئات الآلاف من tetrads يمكن أن تكون معزولة في غضون دقائق. نحن هنا تقديم وصف تفصيلي للإجراءات التجريبية المطلوبة لأداء أفضل في الخميرةخميرة الخباز، بدءا من سلالة مضاعفا متخالف من خلال عزل المستعمرات المستمدة من ذرية الانتصافي فرداني.
Introduction
رسم خرائط الجينات الانتصافي، والمعروف باسم تحليل الرباعيات، أمر أساسي لعلم الوراثة الخميرة. لفترة وجيزة، وتزاوج سلالتين فرداني، تحتوي كل منها على نسخة واحدة من كل كروموسوم، لتشكيل سلالة مضاعفا متخالف مع نسختين من كل كروموسوم، واحد من كل من الوالدين. تجويع الخلايا مضاعفا للنيتروجين يؤدي الانقسام الاختزالي (تبوغ) التي الكروموسومات مكررة، الخضوع لإعادة ترتيب، وتقسيمها إلى أربع خلايا فرداني (جراثيم أو segregants) مع مجموعات جديدة من الأليلات من كل من الوالدين. الجراثيم أربعة الناتجة عن الانقسام الاختزالي واحدة يمكن أن تكون معزولة عن طريق عملية يدوية دعا تشريح الرباعيات.
التقليدية الرباعيات تشريح 2،3 التي قد تغير قليلا نسبيا منذ نشر الأصلي في عام 1937 4، لديه ثلاثة أهداف. الأولى، والخلايا التي خضعت الانقسام الاختزالي (tetrads) يجب أن تكون معزولة بعيدا عن خلفية من الخلايا النباتية. في التحليل التقليدي، ويتم ذلك من قبل الباحث الذي، وذلك باستخدامالمجهر، ويحدد بصريا tetrads على صفيحة أجار ويعمل جهاز مياداة مجهرية تحديد بصريا tetrads على صفيحة أجار وباستخدام مياداة مجهرية لنقل الرباعيات إلى منطقة خالية من الخلايا من لوحة. المقبل، وجراثيم أربعة في الرباعيات يجب فصل جسديا لمنع interspore التزاوج. وتعقد جراثيم داخل الرباعيات معا عن طريق كل من زق، وبقايا جدار الخلية للخلية مضاعفا الأصلي، ومجموعة من الجسور interspore 5. في تحليل الرباعيات التقليدية تتم إزالة زق بواسطة الهضم الأنزيمي، ويستخدم الباحث مياداة مجهرية لكسر الجسور interspore وندف بصرف النظر الجراثيم. أخيرا، يتم المحتشدة الجراثيم الفردية في نمط الشبكية التي تحافظ على العلاقة بين الجراثيم، أي جميع ذرية في صف واحد من الأربعة هي جراثيم شقيقة من نفس الرباعيات الأصلي. باحث الخميرة شهدت يمكن إكمال عملية تشريح 10 tetrads (عدد الحد الأدنى المقبولة عمومافي الصليب) في حوالي 15 دقيقة.
قمنا بتطوير الإنتاجية العالية طريقة الرباعيات التنميط الجيني الجديد الذي نسميه ب arcode E nabled S T equencing من etrads (بست) 1. أفضل يوسع عليه الأساليب الحالية في مجال علم الوراثة عالية الإنتاجية من خلال تمكين الجيل والتنميط الجيني لأعداد كبيرة من ذرية التي هي معزولة، مرمزة بالجينات، والحفاظ على كأفراد بطريقة تسمح للعلاقات بوغ الشقيقة من جميع المنتجات الانتصافي أربعة لاستردادها. ويتم إنجاز ذلك باستخدام ثلاث استراتيجيات رئيسية (الشكل 1). الأول هو إدخال بناء المراسل أن التسميات الخلايا التي خضعت الانقسام الاختزالي مع GFP، ويسمح لها أن تكون معزولة من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS). هي ثاني إدراج رمز شريطي الحمض النووي معقدة للغاية (سلسلة من 15 النيوكليوتيدات عشوائي) في شكل يمكن أن ينتقل إلى جميع الجراثيم أربعة من الرباعيات ويمكن قراءتها من قبل تسلسل الحمض النووي المؤتلف من PROGENذ وبالتالي يحدد جراثيم شقيقة من نفس الرباعيات. هي ثالث خطوة التنميط الجيني، وأفضل متوافق مع العديد من المنصات التي التنميط الجيني التقاط كل من مجموعة من علامات الجيني وكذلك الباركود الرباعيات محددة. نحن توظيف تقييد الحمض النووي المرتبط موقع العلامة التسلسل (RAD وما يليها) 6 الأسلوب الذي يوجه تسلسل الجينوم إلى مواقع محددة تقييد 1، وبالتالي التقاط متسقة 2-3٪ من الجينوم من سلالات ذرية وكذلك الباركود المنقولة البلازميد . انتعاش العلاقات الرباعيات جنبا إلى جنب مع البيانات المستمدة تجريبيا التنميط الجيني عن الصليب يسمح الاستدلال الدقيق للمعلومات في عداد المفقودين، بما في ذلك وضع علامات منخفضة مع تغطية تسلسل وراثى كاملة من الأفراد inviable (وبالتالي غير قابل للاسترداد). هنا، نحن تصف تطبيق الأسلوب في الكائنات الحية الدقيقة الأكثر استخداما لرسم الخرائط الانتصافي، الخميرة S. الخباز. ومع ذلك، مع استبدال طفيفة من الجرمية كائن محددةأيها السادة، مثل البروتينات تبوغ محددة مختلفة تنصهر إلى GFP، ينبغي أن تكون طريقة للتحويل بسهولة إلى الكائنات الدقيقة الأخرى، بما في ذلك الكائنات التي رسم الخرائط الانتصافي هو أكثر بكثير كثيفة العمالة أو مستعصية على الحل في الوقت الراهن.
الشكل 1. أفضل طريقة. (A) البلازميد pCL2_BC هو البلازميد 2 ميكرون مع GFP الانصهار تبوغ محددة، ومقاومة للG418، والباركود عشوائي 15 مير. يوصف بناء مكتبة البلازميد في دلو وآخرون 1. (ب) يتم تحويل بركة من البلازميدات barcoded في سلالة مضاعفا من كرة عرضية. ثم تزرع (C) Transformants على الاختيار ويتم تجميع ~ 10،000 المستعمرات تحولت وsporulated من. أثناء الانقسام الاختزالي كل بوغ من الرباعيات يرث المشتركPY من البلازميد barcoded. يتم فصل (D) Tetrads من خلايا unsporulated بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية والتي تم جمعها على لوحات أجار، حيث يتم هضمها والتي عطلت إتاحة الفرصة أمام كل بوغ لتشكيل مستعمرة. ثم يتم اختيار (E) المستعمرات في لوحات 96 جيدا، phenotyped، ومرمزة بالجينات. خلال التنميط الجيني تتم قراءة الباركود البلازميد وتستخدم لتحديد أربعة أعضاء من كل الرباعيات. تم تعديل هذا الرقم من دلو وآخرون 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
1. سلالة البناء وتوصيف
- بناء سلالة مضاعفا متخالف لاستخدامها في الصليب من قبل التزاوج واختيار سلالات فرداني diploids 2 أو باستخدام سلالة متخالف التي تحدث بشكل طبيعي. ينبغي أن لا تأوي سلالات GFP.
- تأكد من أن سلالة غير قادر على تنمو على YPD 2 + 200 ميكروغرام / مل G418.
- تأكد من أن سلالة قادرة على sporulate. أفضل متوافق مع انخفاض تبوغ الصلبان الكفاءة، ولكن زيادة التردد المنخفض تبوغ FACS الوقت الفرز المطلوبة.
- انشاء ثقافة O / N من سلالة في 5 مل YPD وتنمو مع الإثارة في 30 درجة مئوية.
- غسل 0.5 مل من ثقافة O / N ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4).
- بيليه الخلايا غسلها، وإزالة طاف، و resuspend في 2 مل تبوغ متوسطة 7.
- تستنهض الهمم الخلايا في RT وتحقق يوميا لتشكيل الرباعيات باستخدام المجهر المرحلة على ضوء تباين مع الهدف 40X. </ رأ>
- تقدير الجدوى بوغ الصليب عن طريق تشريح التقليدية 2،3 من عدد صغير (~ 20) من tetrads. بقاء بوغ في الصلبان بين الخلفيات سلالة مختلفة تختلف على نطاق واسع وغير متوقع. ومع ذلك، فإن التوقعات بداهة الجدوى بوغ يمكن استخدامها لتقييم كفاءة أفضل تجربة قبل خطوات العمل ومكثفة من حيث التكلفة لتوفير والتنميط الجيني في السلالات. لذلك، ينصح بشدة هذه الخطوة.
2. تحول Diploids مع مكتبة Barcoded البلازميدات
- إدراج البلازميد barcoded pCL2_BC في سلالة مضاعفا متخالف باستخدام بروتوكول التحول هو موضح في GIETZ وودز 8 مع التعديلات التالية.
- بعد أن تم تحضين الخلايا التي تحتوي على خليط التحول عند 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، إضافة DMSO إلى 8٪ من حجم المزيج التحول. وقد وجد إضافة DMSO لتحسين كفاءة التحول طن بعض الخلفيات سلالة 9.
- بعد الخطوة الصدمة الحرارية، بيليه الخلايا مع الطرد المركزي وجيزة، صب الخليط التحول، وغسل الخلايا برفق في YPD. ثم، resuspend الخلايا في 1 مل YPD والسماح لهم باسترداد على RT لمدة 3 ساعة دون الانفعالات.
- حدد transformants بواسطة الطلاء على YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) لوحات أجار. لضمان بركة معقدة من الرموز الشريطية البلازميد، حصاد عدد كبير من المستعمرات، على سبيل المثال 5 لوحات مع ~ 2،500 المستعمرات في لوحة.
- مرة واحدة المستعمرات مرئية (2-3 أيام للنمو عند 30 درجة مئوية)، تجميع transformants عن طريق كشط لهم بعناية قبالة لوحة في السائل YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) + 15٪ الجلسرين. دوامة هذا التعليق الخلية، ونقل إلى قارورة الحفظ بالتبريد، وتجميد في -80 درجة مئوية. جعل الأسهم المجمدة منفصلة لكل لوحة. هذه الأرصدة المجمدة بمثابة البداية لسلالات الخطوة 3.1، ويمكن أيضا أن تستخدم لتوليد المزيد من tetrads في وقت لاحق، إذا رغبت في ذلك.
3. Sporulating مكتبة الخلايا تحولت إلى الحصول Barcoded Tetrads
- إحياء الخلايا من الأسهم المجمدة التي تم إنشاؤها في 2.3 بواسطة O / N النمو في 5 مل YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) عند 30 درجة مئوية مع الإثارة.
- غسل الخلايا من O / N الثقافات 3x أخرى في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثم resuspend الخلايا في تبوغ متوسطة 7 بالإضافة إلى 200 ميكروغرام / مل G418.
- تستنهض الهمم الثقافات تبوغ في RT ورصد التقدم المحرز تبوغ يوميا حتى توقفت tetrads جديدة تشكيل.
- مرة واحدة ثقافة يحتوي tetrads منسق بشكل جيد وعدد قليل نسبيا من dyads، إزالة الثقافات من الانفعالات وترك في RT لمدة 7 أيام على الأقل. في حين أن بعض الصلبان قد تكون قابلة للهضم وعلى لوحة اضطراب في أقرب وقت شكلت tetrads (المقررة كما هو موضح في 7.3)، والحضانة إضافية (7-10 أيام في تجاربنا) أمر ضروري لالصلبان الأخرى. لذلك، ينصح بشدة هذه الخطوة.
4. إنشاءغيتس نظام مراقبة الأصول الميدانية لالرباعيات الفرز
أعرب meiotically SPS2-GFP الانصهار على البلازميد pCL2_BC يسمح tetrads في الثقافة تبوغ ليتم الكشف عن ومعزولة عن الثقافة عن طريق مضان. وقد تم تطوير بروتوكول التالية لFACSAria الثاني.
يستخدم الرقم 2. نظام مراقبة الأصول الميدانية البوابات. سلسلة من أربع بوابات متسلسلة لعزل tetrads. بوابات هو مبين في (أ) و (ب) يساعد على التقليل من عدد من كتل. ويتم اختيار الأحداث الفلورسنت مع البوابة في (C). الرسم البياني في (D) واثنين من القمم. الأحداث في ذروة اليسار هي في المقام الأول tetrads (يسار الصورة أقحم)، والأحداث في ذروة الحق عموما tetrads مع برعم المرفقة (صورة أقحم اليمين). بوابة النهائيتطبق على هذا الرسم البياني لتحديد الأحداث التي هي في معظمها tetrads (الحانات الحمراء). تم تعديل هذا الرقم من دلو، وآخرون 1.- تحميل الثقافة sporulated من الصعود إلى فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية وإنشاء شركتين الأمام مبعثر مبعثر الجانب وبوابات لاستبعاد الحطام، وخلايا تجمعت، وخلايا متعددة لكل قطرة (أرقام 2A و 2B).
- يجب أن يكون هناك عدد من الخلايا الفلورسنت، والتي عندما باستخدام مراسل بناء SPS2-GFP تشمل dyads وtetrads 10. بوابة GFP مقابل FSC لتشمل هذه الأحداث الفلورسنت (الشكل 2C).
- اعتمادا على خلفية التوتر قد يكون من الضروري لتشمل بوابة إضافية لإزالة كتل التي تشمل tetrads والخلايا الأخرى. إذا كان ذلك ضروريا، وفحص على الرسم البياني FSC الأحداث الفلورسنت وتحديد البوابة التي تشمل الأحداث مع انخفاض FSC (الشكل 2D، الأحداث بوابات باللون الأحمر).
- تحقق كفاءة ر انه النابضة النظام عن طريق الفرز ~ 1،500 tetrads على شريحة المجهر والفرز نسبة tetrads لغير tetrads باستخدام المجهر النقيض من المرحلة في 400X التكبير. في المئة من tetrads يمكن تقديرها بدقة عن طريق عد فقط ~ 200 الأحداث فرزها، ولكن الفرز ~ 1،500 يقلل من مقدار الوقت الذي يقضيه في البحث عن الخلايا على شريحة المجهر. بدلا من ذلك، فإن نسبة tetrads لغير tetrads ويمكن تقييمها خلال الخطوة 4.5.
- دوري تأكد من أن يتم الإبلاغ فارز بدقة عدد من الأحداث عن طريق فرز 25 tetrads على شريحة المجهر ودراسة الخلايا الموجودة في قطيرة باستخدام المجهر النقيض من المرحلة في 400X التكبير. ينبغي أن يكون هناك 25 tetrads في الحبرية. تكرار 3-4X لتقييم التباين الصك نظام مراقبة الأصول الميدانية.
5. Tetrads الفرز على صفيحة آجار
p_upload/51401/51401fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 3. تنسيب لوحة آغار على فارز FACS. لفرز tetrads في قطرة صغيرة من الحل zymolyase وضعت في منتصف معيار (التعميم) لوحة أجار، وهو معيار (100 ملم مستطيلة) لوحة 96 جيدا هو أول وضعت على المسرح من فارز الخلية ويتم برمجة فارز لإيداع tetrads في بئر محددة (في هذه الحالة D5). ثم، يتم وضع لوحة آغار التعميم على الجزء العلوي من لوحة 96 جيدا والانحياز بحيث يتم توسيط قطرة من zymolyase على مدى المحددة جيدا.- تدفئة العدد المطلوب من YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) لوحات للا يقل عن 1.5 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية وضعه بالقرب من فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- ومن السمات الرئيسية لبروتوكول الفرز هو القدرة على استهداف بدقة FACS فرز tetrads إلى موقع معين على صفيحة أجار التي تحتوي على مجموعة من الحل zymolyase. للقيام بذلك، ضع "معلما" لوحة 96 جيدا على رانه الآلي وحدة ترسب الخلايا (مبدع) من فارز. إعداد تخطيط النوع الذي سيصنف 25 tetrads في بئر واحدة لشكل 96 جيدا. اختيار جيد بالقرب من وسط لوحة، ويظهر على سبيل المثال كذلك D5. الشكل 3 طبق بتري و96 لوحة جيدا تحميلها على فارز الخلية. فرز 25 tetrads في لوحة غلة المستعمرات مفصولة جيدا.
- جلب كومة من 10 لوحات أجار من الحاضنة 37 درجة مئوية إلى فارز.
- تأخذ واحدة لوحة وماصة أجار 25 ميكرولتر من الحل zymolyase (1 ملغ / مل في 0.7 M السوربيتول) على أجار بالقرب من مركز اللوحة. ثم، وضع لوحة على معالم لوحة 96 جيدا والتوفيق بين الحبرية zymolyase على الهدف بشكل جيد من الخطوة 5.2، على سبيل المثال كذلك D5.
- بدء فرز وإيداع 25 tetrads في وسط الحبرية zymolyase على لوحة أجار. ثم، وإزالة وتغطية لوحة.
- كرر الخطوات من 5.4 و 5.5 تم فرزها حتى 25 tetrads إلى قطرات zymolyase على كل لوحة في المكدس. العودة كومة من لوحات تحتوي على الرباعيات إلى الحاضنة 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوات من خلال 5.3 5.7 حتى يكون جميع لوحات tetrads.
6. فصل الجراثيم
- احتضان كل كومة من الرباعيات التي تحتوي على لوحات أجار عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
- إزالة لوحات من الحاضنة، إضافة 15-25 حبات العقيمة 3 مم الزجاج في لوحة، ويهز لوحات كما كومة (أو عن اثنين من أكوام من 5 لوحات) لمدة 3-5 دقيقة. ويتحقق أفضل فصل بوغ عن طريق تحريك لوحات بشكل صارم من جانب إلى آخر أو الأمام إلى الخلف. لا تتحرك لوحات من هذا القبيل أن حبات "دوامة" حول حافة خارج اللوحة. مغادرة الخرز على لوحات عند الانتهاء.
- وضع كومة من لوحات مع حبات مواجهة في حاضنة 30 درجة مئوية. استرداد لوحات كومة المقبل من الحاضنة 37 درجة مئوية، وكرر الخطوة 6.2.
- احتضان لوحات O / N عند 30 درجة مئوية.
7. حصاد المستعمرات
- بعدوالحضانة O / N عند 30 درجة مئوية، مستعمرات صغيرة ينبغي أن يكون شكلت على لوحات. إزالة بعناية لوحات من الحاضنة دون إزعاج الخرز الزجاجي.
- إزالة الخرز الزجاجي كتبها بعناية وبسرعة عكس لوحات أكثر من وعاء عميق. يجب أن تكون الحاوية عميقة بما فيه الكفاية للقبض على حبات دون السماح لهم ترتد صعودا وضرب لوحة آغار. يمكن التنصت على الجزء السفلي من لوحة حين هو مقلوب أن يساعد طرد الخرز التي تمسك اللوحة. هذه الخرز يمكن إعادة استخدامها عن طريق الغسيل بالماء والصابون شامل، الشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات وتعقيم بواسطة التعقيم.
- حساب عدد المستعمرات في كل لوحة واستخدام عدد من المستعمرات لتقدير كفاءة الفصل بوغ والانتعاش. على سبيل المثال، يمكن لكل لوحة 25 tetrads للصليب قرب مع بقاء 100٪ العائد ما مجموعه 100 مستعمرات لكل لوحة.
- من لوحات مع أعداد كافية من المستعمرات (> 65 لالصلبان عالية الجدوى)، وخلايا نقل كل من كولونيويورك في بئر منفصلة من لوحة 96 جيدا تحتوي على YPD السائل + G418. أيضا، وجعل علما الآبار التي تحتوي على المستعمرات من نفس لوحة أجار؛ وسوف تستخدم هذه المعلومات للمساعدة في برامج الاحالة الرباعيات.
- استخدام 96 جيدا لوحات السائل إلى البذور الثقافات لالتنميط الجيني لإنقاذ وسلالات من أسهم الجلسرين المجمدة. التفاصيل حول RAD علامة تسلسل وتحليل تسلسل يمكن العثور عليها في دلو وآخرون 1.
Representative Results
أفضل يمكن أن تحسن كثيرا من السرعة التي جراثيم من tetrads يمكن أن تكون معزولة. كمثال على الإنتاجية هذا الأسلوب يمكن أن يحقق، ينجز أحد الباحثين في نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز والفصل بوغ (خطوات 5.1 خلال 6.3) مع 149 لوحات أجار في 3 ساعة 1. أن عائد يعادل (حوالي 3،725 tetrads) تتطلب أكثر من 90 ساعة من تشريح اليدوي. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من وسائل إنتاجية عالية، والتكرار الحالي للطريقة ديه بعض فقدان الكفاءة مقارنة تشريح دليل. هذه الخسارة كما يظهر تعافى انخفاض عدد المستعمرات مقارنة مع توقعات محسوبة على أساس الجدوى بوغ الصليب، والتي تحددها تشريح دليل (الخطوة 1.4). على افتراض أن أسباب فقدان بوغ (مناقشة) تؤثر الجراثيم على نحو عشوائي، ويمكن إجراء تقديرات عن عدد المستعمرات استردادها سيكون أعضاء tetrads التي تم استردادها 1، 2، 3، 4 أو جراثيم (الشكل 4).
الصفحة = "دائما"> 
قد يكون الرقم 4. محاكاة كفاءة الأسلوب على مستوى الرباعيات. الفشل في استعادة بنجاح جراثيم (كما المستعمرات) بسبب inviability بوغ، بوغ التصاق إلى الخرز والزجاج، وعدم الفصل بين الجراثيم عن بعضها البعض، وما كان يستخدم توزيع ذي الحدين لحساب جزء من المتوقع tetrads (مع واحد على الأقل بوغ تعافى بنجاح) إنتاج 4، 3، 2 أو 1 المستعمرات على أساس نسبة كل الجراثيم استردادها بنجاح. هذا الرسم البياني يمكن أن تكون بمثابة دليل الخام إلى عدد من السلالات التي سوف يتم تجميعها في نهاية المطاف إلى 3 - أو 4 - tetrads بوغ. حيث بلغ عدد المستعمرات في الزيادات لوحة، لذلك لا عدد tetrads كاملة استردادها.
في وصف التجربة أعلاه، tetrads 25 من كرة عرضية مع بوغ بقاء ما يقرب من 100٪ (كما ديتermined عن طريق تشريح دليل) كانت مطلية 1 على 149 لوحات أجار. في هذه التجربة، وكان الحد الأقصى لعدد المستعمرات لوحظ في لوحة 80، مشيرا إلى أن 20 جراثيم فشلت في شكل مستعمرات منفصلة. وكان متوسط عدد المستعمرات في لوحة 62. المستعمرات من لوحات تحتوي على 61 65 المستعمرات أو أكثر تم حصادها ومتسلسلا. من السلالات التي مرت 3،700 مراقبة الجودة التسلسل، 72٪ يمكن أن تسند حسابيا إلى 3 - أو 4 - tetrads بوغ.
Discussion
مناطق كثيرة من أبحاث الوراثة، بدءا من تعيين سمة معقدة 11 لدراسة الآليات الكامنة وراء إعادة التركيب DNA 12، تتطلب أعداد كبيرة للغاية من ذرية وكميات كبيرة من تسلسل الحمض النووي. التقنيات التي تتزوج قوة الأساليب التقليدية مع قدرة إنتاجية عالية تسلسل الحمض النووي لديها القدرة على تمكين الدراسات التي كانت مستعصية سابقا. على الرغم من أن العديد من الإنتاجية العالية الوراثة الخميرة أساليب تم تطبيقها على نحو فعال لمشاكل محددة، لكل منها القيود التي تقصر من تطبيق واسعة للتحليل الرباعيات التقليدية. أفضل عناوين هذه التحديات من خلال توظيف نهج الإنتاجية العالية الجمع بين تشريح الرباعيات والتنميط الجيني ذرية من الصلبان الخميرة. بالتزامن مع المضاعفة RAD علامة التسلسل، وأفضل يوفر وسيلة غير مكلفة لاستخلاص المعلومات الوراثي لكل سلالة ذرية مع الحفاظ على علاقات الرباعيات عن طريق الباركود الرباعيات فريدة من نوعها.0؛ من استخدام كافة أساليب إنتاجية عالية في الوقت الراهن، وأفضل يلخص أوثق المعلومات التي تقدمها عبر الخميرة تشريح يدويا.
أفضل اثنين من السمات الرئيسية. الأول هو استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل بسرعة tetrads بعيدا عن خلايا unsporulated في الثقافة (بروتوكول الخطوات 5-6). القدرة على عزل الآلاف من الأحداث الفلورسنت (tetrads) يعطي أفضل أكبر مكاسبه في الإنتاجية. يوفر هذا أتمتة ميزة أكبر دليل على تشريح لالصلبان مع انخفاض كفاءة تبوغ، ويرجع ذلك إلى زيادة الوقت اللازم لتحديد بصريا الأحداث النادرة. ميزة المفتاح الثاني هو استخدام الباركود الجزيئية المعقدة للغاية (البروتوكول الخطوة 2) التي تبث إلى كل بوغ أخت من الرباعيات. لأن هذه الرموز الشريطية يمكن استخدامها لإعادة بناء العلاقات حسابيا الرباعيات بين الجراثيم التي تم توزيعها عشوائيا عبر لوحة آغار، والحاجة إلى يدويا الخلايا مجموعة في الشبكة أمر يتم إنزال. أخيرا،لأن الباركود الجزيئية والجينات مراسل GFP تبوغ محددة ترتبط جسديا (على نفس البلازميد)، ويتم اختيار tetrads الوحيدة التي احتفظت الباركود الجزيئية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز.
هناك نوعان من الاعتبارات التي تحكم طول الفترة الزمنية التي ينبغي الثقافات المحتضنة في المتوسط تبوغ. أولا، لأن ما يعبر عنه مراسل محددة تبوغ (SPS2-GFP) في الانقسام الاختزالي في وقت مبكر، GFP وحده لا يميز كاملة tetrads 4 بوغ من الخلايا التي لم تكتمل الانقسام الاختزالي (أي dyads). في حين تبوب FACS إضافية قد يقلل من عدد من الفلورسنت، tetrads غير مكتملة، وأسهل طريقة لخفض هذه الأحداث غير المرغوب فيها وببساطة رصد الثقافة تبوغ (الخطوة 3.3) والشروع توقفت مرة واحدة tetrads جديدة تشكيل. في تجاربنا، وتواتر dyads فرز أقل من 1٪. الثانية، بالنسبة لبعض الصلبان وقتا إضافيا قضى في تبوغ المتوسطة في RT دون التحريض (الخطوة 3.4) سيجيحسن nificantly فصل tetrads من الخرز الزجاجي أثناء الطلاء ((بروتوكول الخطوة 6)، وفي الواقع، هذه الخطوة ضرورية للغاية لتعطيل بعض الصلبان.
مثل كل أساليب إنتاجية عالية، وأفضل هو "ضجيج" من النهج التقليدي المقابلة. تخفيض متواضع في كفاءة أفضل مقارنة الرباعيات تشريح التقليدية يمكن أن تنجم عن مزيج من عدة عوامل. أحد العوامل هو فقدان متزايد من الجراثيم قابلة للحياة على خلاف ذلك، والتي يمكن أن تنجم عن الانضمام إلى حبات الزجاج خلال نشر أو زيادة بوغ الموت بسبب الضغوط الميكانيكية لهذه العملية. وهناك عامل ثان يمكن أن يكون فقدان البلازميد بسيطة أثناء الانقسام الاختزالي. هناك عامل ثالث يمكن أن يكون انخفاض فعالية في المستعمرات صالحة للاستعمال الناتجة عن المستعمرات مع الأنماط الوراثية المختلطة، ما يقدر ب ~ 5٪ من المستعمرات في الطيار لدينا الصلبان 1. فمن المرجح أن هذه المستعمرات تمثل إخفاقات شقيقة بوغ الانفصال. لأن فلوري السريعescence الفرز والفصل بوغ تسمح جمع أعداد هائلة من tetrads، وقد تم تجهيز أفضل بشكل جيد للتغلب على النقص في الكفاءة على هذا النطاق. في حين التكرار مستقبل أفضل يمكن زيادة الكفاءة تقترب من تشريح دليل، فإنه ربما يكون من المرجح أن مسار الأسي الحالي من الحمض النووي القدرة التسلسل سوف تعوض سريعا لهذا المستوى من فقدان سلالة صالحة للاستعمال. بغض النظر، فإن القدرة على إجراء تحليل الرباعيات على نطاق والتي أفضل يمكن تطبيقها تمكين الدراسات التي هي غير مجدية بواسطة الطرق اليدوية حاليا.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة على جائزة / NHGRI الجينوم الباحث العلمي / كلية الانتقالية (K22 HG002908) لAMD وشراكة استراتيجية بين معهد بيولوجيا الأنظمة وجامعة لوكسمبورغ. طلبات سلالات أو البلازميدات ينبغي أن توجه إلى ايمي دادلي (aimee.dudley @ gmail.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488 nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto Petri dishes | |
| Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
| Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
| G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |
References
- Ludlow, C. L., et al. High-throughput tetrad analysis. Nat Methods. 10, 671-675 (2013).
- Rose, M., Winston, F., Hieter, P. Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1990).
- Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci. J Vis Exp. 27, (2009).
- Winge, O., Laustsen, O. On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures. C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).
- Coluccio, A., Neiman, A. M. Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall. Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).
- Baird, N. A., et al. Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers. PLoS One. 3, (2008).
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
- Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).
- Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency. Genetics. 174, 985-997 (2006).
- Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494, 234-237 (2013).
- Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).
