ベスト：四分子のバーコード有効シーケン

Summary

四分子のバーコード有効シング（ベスト）四分子を単離崩壊さと間隔の手動プロセスを置き換えます。ベスト寒天プレート上に蛍光活性化細胞選別による四分子を分離、ガラスビーズを攪拌することにより胞子を分離して、ランダムに配列されたコロニーは、分子バーコードを使用して、同じ元の四分子から誘導されたかを決定します。

Abstract

四分子分析は、酵母遺伝学のための貴重なツールであるが、プロセスの煩雑な手動の性質は、大規模なスケールでの適用を妨げてきた。バーコードは四分子の配列^{（BEST）1は} 、分離破壊し、四分子間隔の手動プロセスに取って代わることができました。 BESTは、子嚢を酵素的に消化し、胞子を破壊し、ランダムにガラスビーズめっきにより配列されている直接寒天プレート上に四分子の蛍光活性化細胞選別を可能にする胞子形成特異的GFP融合タンパク質のおかげで四分子を分離する。胞子はジェノタイピング中に読み込ま分子バーコードを使用して、同じ四分子に由来すなわち情報かについての半数体コロニーは、その後、姉妹胞子関係が割り当てられます。マニュアル解剖のボトルネックを除去することにより、四分子の数百または数千、数分で単離することができる。ここでは、酵母においてBESTを実行するために必要な実験手順の詳細な説明を提示するサッカロマイセス·セレビシエ 、半数体減数分裂子孫から派生したコロニーの分離を通じてヘテロ接合二倍体株で始まる。

Introduction

一般的に四分子分析として知られる減数分裂遺伝子マッピングは、酵母遺伝学の中心である。簡単に言えば、それぞれがそれぞれの染色体の単一コピーを含む2半数体株は、各染色体の2つのコピー、各親からの1とヘテロ接合二倍体の歪みを形成するために交配させる。窒素のための二倍体細胞を飢餓と、染色体は、複製転位を受けて、それぞれの親からの対立遺伝子の新しい組み合わせで4半数体細胞（胞子または分離個体）に分割（胞子形成）が減数分裂を誘導する。シングル減数分裂によって生じる4胞子は四分子解剖と呼ばれる手動プロセスによって単離することができる。

1937 ⁴に初版発行以来、比較的ほとんど変わっていない従来の四分子解剖^2,3は 、三つの目標を持っています。まず、減数分裂（四分子）を受けた細胞は栄養細胞の背景から単離されなければならない。従来の分析では、これを用いて、研究者によって達成される顕微鏡は、視覚的に寒天プレート上に四分子を識別し、マイクロマニピュレータ装置が視覚的に寒天プレート上に四分子を同定し、プレートの無細胞領域に四分子を移動させるためにマイクロマニピュレーターを用いて使用する。次に、四分子中の4胞子はinterspore交配を防ぐために、物理的に分離しなければならない。四分子内の胞子嚢は、元の二倍体細胞、及びintersporeブリッジ⁵のセットの細胞壁の残留両方によって一緒に保持される。従来の四分子分析で子嚢を酵素消化により除去し、研究者はinterspore橋を破壊し、胞子を離れていじめるマイクロマニピュレーターを使用しています。最後に、個々の胞子が胞子との関係を維持してグリッド状に配列された4つの行、すなわち 、すべての子孫は、同じ元四分子の姉妹胞子である。経験豊富な酵母の研究者は、10四分子（一般に公正妥当と認められる最小数を解剖するプロセスを完了することができます約15分）のクロスあたり。

我々は、B arcode、EがT ^{etrads（BEST）1} のS equencingをnabled呼び出す新しい高スループット四分子ジェノタイピング法を開発した。ベストは単離されているの子孫が多数、遺伝子型を決定し、すべての4減数分裂の製品の姉妹胞子の関係を回復することを可能にする方法で、個人として維持の発生や遺伝子タイピングを可能にすることにより、ハイスループット遺伝学の現在の方法を発展させ。これは、3つの主要な戦略（ 図1）を用いて達成される。第GFPと減数分裂を受けた細胞を標識し、それらを（FACS）を蛍光活性化細胞ソーティングによって単離することを可能にするレポーター構築物の導入である。第四分子の4つ全ての胞子に伝達され、組換えPROGENのDNA配列決定によって読み取ることができる形態の非常に複雑なDNAバーコードの取り込み（15ランダムヌクレオチドの文字列）であるしたがって、Yとは、同一の四分子から姉妹胞子を識別します。第三は、遺伝子型判定ステップであり、最高のゲノムマーカーのセットだけでなく、四分子固有のバーコードの両方をキャプチャし、多数のジェノタイピング·プラットフォームと互換性があります。我々はそれによって子孫株のゲノムの一貫した2から3パーセントだけでなく、プラスミド由来のバーコードをキャプチャする、制限部位に関連したDNAタグシーケンシング（RAD-SEQ）特定の制限部位¹にゲノム配列決定を指示する⁶方法を採用。クロスから経験的に由来ジェノタイピングデータとともに四分子の関係の回復は低い配列カバレッジと生存不能（したがって、回復不可能な）個人の完全な遺伝子型とマーカーのステータスなどの情報が不足しての正確な推定を可能にする。ここでは、減数分裂のマッピングのための最も一般的に使用される微生物は、酵母S.の方法の適用を記載サッカロミセス·セレビシエが 、生物特異的REAのマイナー置換を有するメンズ、GFPに融合した例えば 、異なる胞子特異的タンパク質、方法が減数分裂のマッピングはかなり多くの労力を要するか、現在難治である生物を含む他の微生物には容易に譲渡する必要があります。

図1。最善の方法。（A）pCL2_BCプラスミドは胞子特有のGFP融合、G418に対する耐性、および15-merのランダムバーコードと2ミクロンプラスミドである。プラスミドライブラリーの構築は、ラドローら ¹に記載されている。 （B）バーコードプラスミドのプールは、クロスからの二倍体株に形質転換されている。 （C）形質転換体は、その後の選択に成長させ、〜万形質転換コロニーをプールし、胞子形成されています。減数分裂の際に四分子の各胞子は、COを継承バーコードプラスミドのPY。 （D）四分子を、FACSによってオーシスト細胞から分離し、それらを消化し ​​、それぞれの胞子コロニーを形成することができるように破壊されている寒天プレート上に収集される。 （E）コロニーを、次いで、96ウェルプレートに採取表現型および遺伝子型決定される。ジェノタイピング中にプラスミドバーコードが読み取られ、各四分子の4メンバーを同定するために使用される。この図は、ラドローら ¹から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Protocol

1。菌株構築とキャラクタリゼーション

1. 一倍体の株を交配し、二倍体^2を選択するか、天然に存在するヘテロ接合菌株を使用することにより、クロスで使用するヘテロ接合二倍体株を構築する。株は、GFPを抱くべきではありません。
2. 株は、YPD ² + 200μg/ mlのG418を上に成長することができないことを確認してください。
3. 菌株は胞子形成することが可能であることを確認します。ベスト低胞子形成効率が横切ると互換性がありますが、低胞子形成周波数が高くなるのFACSソーティング時間が必要。
   1. 5ミリリットルYPD中で株のO / N培養を設定し、30℃で攪拌しながら成長する
   2. PBS（pH7.4）でO / N培養の0.5ミリリットル3回洗浄する。
   3. 洗浄した細胞をペレット化し、上清を除去し、2ミリリットル胞子形成培地⁷に再懸濁。
   4. 室温で細胞を攪拌し、40倍の対物レンズとの位相差光学顕微鏡を用いて四分子形成のために、毎日チェックしてください。
   </ OL>
   5. 四分子の数が少ない（〜20）の、従来の解剖^2,3でクロスの胞子の生存率を推定する。異なる株バックグラウンドの間の交雑での胞子の生存率は、広く予測できない変化します。しかしながら、胞子の生存率の先験的な期待は、従来の菌株を保存し、遺伝子型決定の手間と費用のかかる工程にBEST実験の効率を評価するために使用することができる。そのため、このステップを強くお勧めします。

   バーコード付きプラスミドのライブラリーと二倍体2。転換

   1. 以下の改変をGietzのウッズ⁸で説明した形質転換プロトコルを用いて、ヘテロ接合二倍体株にpCL2_BCバーコードプラスミドを挿入します。
      1. 細胞を、20分間30℃で形質転換混合物と共にインキュベートした後、形質転換混合物の体積の8％DMSOを加える。 DMSOの添加は、形質転換効率をiを改善することが見出されているNいくつかの歪みの背景^9。
      2. 熱ショックステップの後、短時間の遠心分離で細胞をペレット化形質転換混合物をデカントし、YPD中で静かに細胞を洗浄。その後、1ミリリットルのYPDに細胞を再懸濁し、それらを撹拌せずに室温で3時間回復することができます。
   2. 寒天プレートYPD + G418（200μg/ ml）を上にめっきすることによって形質転換体を選択してください。プラスミドバーコードの複雑なプールを確保するために、多数のコロニー、プレートあたり〜2500個のコロニーを持つなど 5枚を収穫。
   3. コロニーは（30℃での成長の2〜3日）表示されたら、慎重に液体YPD + G418（200μg/ ml）を+15％グリセロールにプレートを、それらを掻き落として形質転換体をプールする。渦この細胞懸濁液は、凍結保存用バイアルに移し、Cの各プレートに別々の凍結ストックを作る-80℃で凍結する。これらの凍結ストックは、ステップ3.1の出発系統として機能し、また、所望であれば、後でより四分子を生成するために使用することができる。

      3。バーコード付き四分子を入手するために、形質転換細胞のライブラリ胞子形成

      1. 攪拌しながら30℃で5ミリリットルのYPD + G418（200μg/ ml）を中のO / Nの成長により2.3で作成した凍結ストックから細胞を復活させる。
      2. PBS中3X（pH7.4）を、O / N培養物から細胞を洗浄した後、胞子形成培地⁷プラス200μg/ mlのG418中で細胞を再懸濁。
      3. RTで胞子形成の文化を攪拌して、新しい四分子形成が停止するまで、毎日の胞子形成の進行状況を監視します。
      4. 文化が整形四分子と比較的少ないダイアドが含まれていたら、興奮からの文化を削除し、少なくとも7日間、室温で残す。いくつかの交配が（7.3で説明したように評価）とすぐに四分子が形成されているように、プレート消化と混乱に影響を受けやすいかもしれないが、追加のインキュベーション（我々の実験で7〜10日）は、他の交配のために不可欠です。そのため、このステップを強くお勧めします。

      4。設立テトラッドソートのためのFACSゲイツ

      減数分裂はpCL2_BCプラスミド上SPS2-GFP融合は、胞子形成培養中の四分子が検出され、蛍光によって培養物から単離することを可能にする表現。以下のプロトコルは、FACSAriaをIIのために開発された。

      
      図2 FACSゲート。4つの連続ゲートの一連の四分子を単離するために使用される。 （A）に示したゲートと、（B）は、凝集塊の数を減らすのに役立つ。蛍光イベントは、（C）ゲートで選択される。 （D）ヒストグラムは、2つのピークを有している。左のピークでのイベントは、主に四分子（左挿入画像）であり、右のピークでのイベントは、通常、付属の芽（右挿入画像）と四分子である。最終的なゲートがある主に四分子（赤いバー）のイベントを選択するには、このヒストグラムに適用される。この図は、ラドローら ¹から変更されている。

      1. FACSソーター上に胞子形成の文化をロードし、2前方散乱および側方散乱ゲートの破片を除外するには、凝集した細胞、および滴あたり複数のセル（ 図2Aおよび2B）を設定します。
      2. SPS2-GFPレポーター構築物を使用する場合には、ダイアドと四分子^10を含む蛍光細胞の集団があるはずです。ゲートこれらの蛍光事象（ 図2C）を含むようにFSC対GFP。
      3. 株バックグラウンドに依存して、四分子および他の細胞を含む凝集塊を除去するために追加のゲートを含める必要があり得る。これが必要な場合には、蛍光イベントのFSCヒストグラムを検査し、低FSC（ 図2D、ゲートイベントは赤である）とのイベントが含まれたゲートを指定します。
      4. Tの効率をチェックする彼は顕微鏡スライド上に1,500〜四分子を選別し、400Xの倍率で位相差顕微鏡を用いて非四分子に四分子の割合をカウントすることによってレジームゲー。四分子の割合を正確にわずか約200ソートイベントを計数することによって推定したが、〜1,500時間の量を減少ソートは、顕微鏡スライド上の細胞の探索に費やされ得る。あるいは、非四分子の四分子の比は、4.5ステップの間に評価することができる。
      5. 定期的ソーターを正確顕微鏡スライド上に25四分子をソートし、400Xの倍率で位相差顕微鏡を用いて、液滴中に含まれる細胞を調べることにより、イベントの数を報告していることを確認してください。液滴中の25の四分子があるはずです。 FACS装置の分散性を評価するために3〜4倍を繰り返します。

      5。寒天プレートにソート四分子

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      FACS選別機での寒天プレートの図3。配置。標準（円形）寒天プレート、標準（100ミリメートルの長方形）の中央に配置チモリアーゼ液の小滴に四分子を並べ替えるには96ウェルプレートを最初にセルソーターのステージ上に置き、ソータ（この場合D5）に特異的なウェルに四分子を堆積させるようにプログラムされている。そして、円形の寒天プレートを96ウェルプレートの上に置き、ザイモリアーゼの低下が指定ウェル上の中心に位置するように整列される。

      1. FACS選別機の近くに位置して37℃のインキュベーター内に少なくとも1.5時間YPD + G418（200μg/ ml）をプレートの希望番号を温める。
      2. ソートプロトコルの重要な特徴は、正確に、FACSを標的とする能力がザイモリアーゼソリューションのプールが含まれている寒天プレート上の特定の場所に四分子を並べ替えられます。これを行うために、トンの「ランドマーク」96ウェルプレートを配置する彼は、ソーターの細胞堆積ユニット（ACDU）を自動化しました。 96ウェルフォーマットの1ウェルに25四分子を並べ替えするソートレイアウトを準備します。選択したウェルプレートの中央付近に、 例えばよく、D5。 図3は、セルソーターにロードペトリ皿と96ウェルプレートを示している。プレート当たり25四分子をソートする十分に分離したコロニーが得られます。
      3. ソーターを37℃のインキュベーターから10寒天プレートのスタックを持って来る。
      4. プレートの中央付近の寒天上にザイモリアーゼ溶液を1寒天プレートおよびピペット25μL（0.7 Mソルビトール中1 mg / mlの）を取る。すると、 例えばよくD5、ステップ5.2からうまくターゲット上のザイモリアーゼ滴を揃え、画期的な96ウェルプレートにプレートを配置します。
      5. 並べ替えを起動し、寒天平板上チモリアーゼ滴の中央に25四分子を付着させる。その後、プレートを外し、カバー。
      6. 手順を繰り返し5.4および5.5 25までの四分子は、スタック内の各プレート上チモリアーゼ滴にソートされている。 37℃のインキュベーターに四分子含有プレートのスタックを返します。
      7. すべてのプレートが四分子になるまで5.7〜ステップ5.3を繰り返します。

      6。の分離胞子

      1. 1.5時間、37℃で四分子を含む寒天プレートの各スタックをインキュベートする。
      2. インキュベーターからプレートを外し、プレートあたり15〜25の滅菌3ミリメートルのガラスビーズを追加し、スタックとしてのプレートを振る（または5枚の2スタックなど）3〜5分間。最良の胞子分離を背面に側面または前面左右に堅固にプレートを移動させることによって達成される。このようなプレートの外側のエッジの周りビーズ」スワール」というプレートを移動しないでください。終了したら、プレートにビーズを残す。
      3. 30℃のインキュベーター内で表向きビーズとプレートのスタックを配置します。 37℃のインキュベーターから次のスタックプレートを取得し、ステップ6.2を繰り返します。
      4. 30℃でプレートO / Nインキュベート

      7。収穫コロニー

      1. 後に30℃でO / Nインキュベートし、小さなコロニーがプレート上に形成されている必要があります。慎重にガラスビーズを乱すことなく、インキュベーターからプレートを取り外します。
      2. 慎重にかつ迅速に深いコンテナの上にプレートを反転させて、ガラスビーズを除去します。コンテナは、それらをバウンスし、寒天プレートをヒットさせることなく、ビーズをキャッチするのに十分な深にする必要があります。それが反転している間にプレートの底をタップすると、プレートに付着しているビーズを取り除くことができます。これらのビーズは、脱イオン水で十分にすすぎ、オートクレーブ処理により滅菌する、石けんでよく洗浄し再使用することができる。
      3. 各プレート上のコロニー数をカウントし、胞子分離回収の効率を推定するためにコロニーの数を使用しています。例えば、ほぼ100％の生存率とのクロスのためのプレートあたり25四分子は、プレート当たり100個のコロニーの合計を得ることができた。
      4. 各COLOから十分なコロニー数（高生存率の交配のために> 65）、転送細胞でプレートからnyの液体YPD + G418を含む96ウェルプレートの別個のウェルに。また、ウェルは、同じ寒天プレートからコロニーを含むものをメモしておきます。この情報は、四分子​​割当ソフトウェアを支援するために使用される。
      5. ジェノタイピングのための凍結グリセロールストックとしての株を保存するための文化をシードする96ウェルプレートの液体を使用してください。 RAD-タグ配列決定および配列解析の詳細については、ラドローら ¹に記載されています。

Representative Results

ベストを大幅に四分子からの胞子を単離することができる速度を向上させることができます。このメソッドが提供できるスループットの例としては、1研究者は3時間¹における149寒天プレートにFACS選別し、胞子分離（6.3〜ステップ5.1）を行った。同等の収量（約3725四分子）は、マニュアル解剖の90時間を必要とする。しかし、多くのハイスループット法と同様に、方法の現在の反復は、手動切開と比較して、効率のある程度の損失を有する。コロニー数の減少が手動切開（ステップ1.4）によって決定される断面の胞子の生存率に基づいて計算予想と比較して回収し、この損失が現れる。胞子損失（考察）の原因はランダムに胞子に影響を与えると仮定すると、推定を回収コロニーは1、2、3、または4胞子が回収された四分子の部材（ 図4）であろう何から作ることができる。

図4四分子レベルでの方法の効率のシミュレーションに成功（コロニーとして）胞子を回収しないと、二項分布を用いた等による胞子の生存不能、ガラスビーズへの胞子の付着、互いから胞子を分離する障害であり得る正常に回復し、すべての胞子の割合に基づいて、4個、3個、または1個のコロニーを産生する（少なくとも1つの正常に回復胞子を有する）四分子の予想される割合を算出する。または4 - - 胞子四分子このグラフは、最終的に3に組み立てされた株の数におおよその目安として使用できます。プレートが増大あたりのコロニー数につれて、完全な四分子の数が回復しない。

実験は、上述の形態では、100％の胞子の生存率に近いとの交差から25は、四分子​​（DETとして手動切開によって王侯にされた^）1は 149寒天プレート上にプレーティングした。この実験では、プレートあたりのコロニーが観察さの最大数は20胞子が離散コロニーを形成することができなかったことを示す、80であった。プレートあたりのコロニーの平均数は62であった。65コロニー以上含有する61プレートからのコロニーを採取し、配列決定した。または4 - - シーケンシング品質管理に合格した3,700株のうち、72％は、計算3に割り当てることができる胞子四分子を。

Discussion

複雑な形質のマッピング¹¹からDNA組換え^12のメカニズムの研究に至る遺伝学研究の多くの分野は、子孫およびDNA配列の大量の非常に多くを必要とする。ハイスループットDNA配列決定の容量を持つ従来のアプローチの力を結婚する技法は、以前は難治性であった研究を可能にする可能性を有する。いくつかのハイスループット酵母遺伝学法は、特定の問題に効果的に適用されてきたが、それぞれが従来の四分子分析の幅広い適用を下回るの制限があります。四分子解剖を組み合わせたハイスループットアプローチを採用し、酵母の交配の子孫の遺伝子型で、最良のアドレスこれらの課題。多重化されたRAD-タグシーケンシングと組み合わせて、最高のユニークな四分子のバーコードを用いて四分子の関係を維持しながら、各々の子孫株について遺伝子型情報を収集するために安価な方法を提供しています。0;すべての現在使用されているハイスループット方法のうち、BESTは、最も密接に手動で切開し、酵母断面によって提供される情報を再現する。

ベストは、次の2つの主要機能を備えています。最初は急速に離れて文化（プロトコールステップ5-6）中のオーシストの細胞から四分子を分離するため、FACSを使用することである。蛍光イベント（四分子）の数千人を単離する能力は、最高のスループットでの最大のゲインを提供します。この自動化により、視覚的に稀な事象を識別するために必要な時間の増加に、低胞子形成効率との交雑のためのマニュアルの解剖上のさらに大きな利点を提供する。第二の重要な特徴は、四分子​​の各姉妹胞子に伝達され、非常に複雑な分子バーコード（プロトコールステップ2）を使用することである。これらのバーコードは、計算上、ランダムに寒天平板上に分散された胞子間の四分子の関係を再構築するために使用することができるため、必要が手動で注文し、グリッド内のアレイ·セルは緩和されます。最後に、分子バーコードと胞子形成特異的GFPレポーター遺伝子が物理的に（同じプラスミド上）リンクされているため、分子バーコードを保持している唯一の四分子は、FACSソーティングにより選択される。

培養物を胞子形成培地中でインキュベートされるべきである時間の長さを支配する2つの考慮事項が存在する。胞子形成特異的レポーター（SPS2-GFP）は 、早期減数分裂で表現されるので、最初、GFP単独では、減数分裂（ すなわちダイアド）が完了していない細胞から完全な4 -胞子四分子を区別しません。追加のFACSゲーティングは、蛍光、不完全な四分子の数を減少させることができるが、これらの不要なイベントを減少させる最も簡単な方法は、単純に胞子形成の文化を監視する（3.3ステップ）と新しい​​四分子形成を停止した後は進んでいます。我々の実験では、ソートダイアドの頻度は1％未満である。第二に、いくつかの交配のために撹拌せずに室温で胞子形成培地で過ごした追加時間（ステップ3.4）SIGnificantly（（プロトコルステップ6）、めっき中にガラスビーズによる四分子の分離を向上させます。実際には、このステップは、いくつかの交配の破壊のために絶対に必要です。

すべての高スループット法と同様に、最高の対応する従来のアプローチよりも「騒々しい」です。従来の四分子解剖と比較した最高の効率のわずかな減少は、いくつかの要因の組み合わせから発生する可能性があります。一つの要因は、プロセスの機械的応力に胞子の死滅を拡散または増加中のガラスビーズへの付着に起因する可能性がある、そうでなければ、生存胞子の増加した損失である。第二の要因は、減数分裂の間の単純なプラスミド損失である可能性があります。第三の要因は、我々のパイロットでコロニーの推定〜5％は^1を横切る、混合遺伝子型を有するコロニーから生じた使用可能なコロニーに効果的な減少である可能性があります。それは、これらのコロニーは、姉妹胞子分離の失敗を表している可能性があります。急速なフッ素理由escenceソートや胞子分離は四分子の膨大な数のコレクションを許可し、ベストはよく、この規模での効率の低下を克服するために装備されている。 BESTの将来の反復は手動解剖に近い効率を高めることができるが、それはDNA配列決定能力の指数関数的な電流の軌跡が急激に利用可能な株損失のこのレベルを補償することがおそらく可能性が高い。それにもかかわらず、BESTを適用可能な規模で四分子分析を実行する能力は、現在、手動の方法によって、実現不可能である研究を可能にする。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACSAria II (Special order unit)	BD Biosciences		Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488 nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto Petri dishes
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html