BEST: Barcode Enabled Sequencing van Tetrads

Summary

Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads door fluorescentie-geactiveerde celsortering op agarplaten, scheidt de sporen door roeren met glaskralen, en bepaalt welke willekeurig bekleed kolonies afgeleid van dezelfde oorspronkelijke viertal behulp van moleculaire barcodes.

Abstract

Tetradenanalyse is een waardevol instrument voor gist genetica, maar de moeizame handmatige aard van het proces heeft de toepassing ervan belemmerd op grote schalen. Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) ¹ vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads krachtens een sporulatie-specifiek GFP-fusie-eiwit dat fluorescentie-geactiveerde celsortering van tetrads maakt direct op agarplaten, waarbij de ascus enzymatisch gedigereerd en sporen worden verstoord en willekeurig bekleed met glasparels plateren. De haploïde kolonies worden vervolgens toegewezen zus spore relaties, dat wil zeggen informatie over welke sporen afkomstig uit hetzelfde viertal, met behulp van moleculaire barcodes lezen tijdens genotypering. Door het verwijderen van het knelpunt van handmatige dissectie, kunnen honderden of zelfs duizenden tetraden worden geïsoleerd in een paar minuten. Hier presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van de experimentele procedures die de beste presteren in de gistSaccharomyces cerevisiae, te beginnen met een heterozygote diploïde stam door het isoleren van kolonies afgeleid van de haploïde meiotische nakomelingen.

Introduction

Meiotische kaart brengen van genen, beter bekend als tetradenanalyse, staat centraal in gist genetica. In het kort, twee haploïde stammen, die elk een exemplaar van elk chromosoom, zijn gekoppeld aan een heterozygote diploïde stam vormen met twee exemplaren van elk chromosoom, een van elke ouder. Verhongeren diploïde cellen stikstof induceert meiose (sporulatie) waarin chromosoompakket ondergaan omlegging en in vier haploïde cellen (sporen of segreganten) met nieuwe combinaties van allelen van elke ouder. De vier sporen gevolg van een meiose kan worden geïsoleerd door een handmatig proces genaamd viertal dissectie.

Conventionele tetrad dissectie ^2,3 die relatief weinig is veranderd sinds de oorspronkelijke publicatie in 1937 ^4, heeft drie doelen. Ten eerste moet cellen die meiose (tetrads) hebben ondergaan verwijderd worden geïsoleerd uit een achtergrond van vegetatieve cellen. In conventionele analyse, wordt dit bereikt door een onderzoeker die gebruikeen microscoop, identificeert visueel tetraden op een agar plaat en heeft een micromanipulator toestel visueel te identificeren tetraden op een agar plaat en met behulp van een micromanipulator om de tetrad verplaatsen naar een cel-vrij gebied van de plaat. Vervolgens moet de vier sporen in tetrad fysiek gescheiden interspore paring voorkomen. Sporen binnen een viertal worden bij elkaar gehouden door zowel een ascus, het overblijfsel van de celwand van de oorspronkelijke diploïde cel, en een set van interspore bruggen ^5. In conventionele tetradenanalyse de ascus wordt verwijderd door enzymatische vertering, en een onderzoeker gebruikt de micromanipulator om de interspore bruggen te breken en plagen elkaar de sporen. Tenslotte worden de afzonderlijke sporen bekleed met een gerasterde patroon dat de relatie tussen de sporen stelt, dwz alle nakomelingen in een rij van vier zijn zuster sporen van hetzelfde origineel viertal. Een ervaren gist onderzoeker kan het proces van ontleden 10 tetraden (een algemeen aanvaarde minimum aantal rondenper kruis) in ongeveer 15 minuten.

We hebben een nieuwe high-throughput tetrad genotyperingsmethode, die noemen we B arcode E nabled S equencing van T etrads (BEST) ¹ ontwikkeld. BEST breidt uit op de huidige methoden in high-throughput genetische doordat het genereren en genotypering van grote aantallen nakomelingen die geïsoleerd zijn, met genotypering en onderhouden als individuen op een wijze die het mogelijk maakt de zus spore relaties van alle vier meioseproducten te vorderen. Hierbij moeten drie strategieën (figuur 1). Eerst is de invoering van een reporter construct dat cellen die meiose ondergaan GFP labels mogelijk maakt die door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Ten tweede is de opname van een zeer complexe DNA barcode (een reeks van 15 willekeurige nucleotiden) in een vorm die voor alle vier sporen van een viertal wordt uitgezonden en kan worden gelezen door DNA sequentie van het recombinante Progeny en dus identificeert zuster sporen van dezelfde viertal. Derde is de genotypering stap, en het beste is compatibel met tal van genotypering platforms die geven zowel een set van genomische markers evenals het viertal specifieke barcode. We gebruiken een restrictieplaats geassocieerde DNA sequentie tag (RAD-seq) ⁶ methode genoom leidt tot specifieke restrictieplaatsen ^1, waarbij het ​​vastleggen van een consistente 2-3% van het genoom van de nakomelingen stammen en het plasmide-gedragen barcode . Het herstel van tetrad relaties samen met de empirisch-afgeleide genotypering gegevens van het kruis staat de juiste gevolgtrekking van ontbrekende informatie, met inbegrip van de status van markers met lage sequentie dekking en het volledige genotype van inviable (en dus onherstelbare) individuen. Hier, de toepassing van de werkwijze beschrijven we het meest gebruikte micro-organisme voor meiotische mapping, de gist S. cerevisiae. Echter, met geringe substituties van organisme-specifieke reaheren, bv. verschillende sporulatie-specifieke eiwitten gefuseerd met GFP, de methode moet gemakkelijk overdraagbaar naar andere micro-organismen, met inbegrip van organismen waarin meiotic mapping is aanzienlijk arbeidsintensiever of momenteel hardnekkig zijn.

Figuur 1. BEST methode. (A) De pCL2_BC plasmide is een 2-micron plasmide met een sporulatie-specifiek GFP fusie, weerstand tegen G418, en een 15-meer willekeurige barcode. Constructie van het plasmide bibliotheek wordt beschreven in Ludlow c.s. ^1. (B) Een pool van barcodes plasmiden wordt omgezet in de diploïde stam uit een kruising. (C) transformanten worden vervolgens gekweekt op selectie en -10.000 getransformeerde kolonies samengevoegd en gesporuleerd. Tijdens de meiose elke spore van een viertal erft een copy van de barcode plasmide. (D) Tetrads worden uit unsporulated cellen gescheiden door FACS en verzameld op agarplaten, waar ze worden verteerd en verstoord dat elk spoor van een kolonie. (E) Kolonies worden vervolgens opgepikt in 96-well platen, fenotype en genotype. Tijdens genotyperen het plasmide barcode wordt gelezen en gebruikt om de vier leden van elk viertal te identificeren. Dit cijfer is gewijzigd van Ludlow et al. ^1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

1. Strain Bouw en karakterisering

1. Teken de heterozygote diploïde stam in het kruis te gebruiken door voortplanting haploïde stammen en selecteren diploïde ^{2 hetzij} met een natuurlijk voorkomend heterozygote stam. De stammen moeten niet haven GFP.
2. Bevestigen dat de stam niet in staat is om te groeien op YPD ² + 200 ug / ml G418.
3. Bevestigen dat de stam in staat is om sporuleren. BEST is compatibel met lage sporulatie efficiëntie kruisen, maar lage sporulatie frequentie toeneemt FACS sortering tijd die nodig is.
   1. Opzetten van een O / N cultuur van de stam in 5 ml YPD en groeien met agitatie bij 30 ° C.
   2. Was 0,5 ml O / N kweek driemaal met PBS (pH 7,4).
   3. Pellet de gewassen cellen, verwijder het supernatant en resuspendeer in 2 ml sporulatie medium ^7.
   4. Schud cellen bij RT en dagelijks controleren op tetrad vorming met behulp van een fase-contrast lichtmicroscoop met een 40X objectief.
   </ Ol>
   5. Schat de spore levensvatbaarheid van het kruis door conventionele dissectie ^2,3 van een klein aantal (~ 20) van tetraden. Levensvatbaarheid spore kruisingen tussen verschillende stam achtergronden varieert sterk en onvoorspelbaar. Echter, een priori verwachtingen van spore levensvatbaarheid worden gebruikt om de efficiëntie van een BEST experiment voor de arbeids-en kostenintensieve stappen van het opslaan en genotypering van de stammen te evalueren. Daarom wordt deze stap ten zeerste aanbevolen.

   2. Transformatie van diploïden met Bibliotheek Barcoded plasmiden

   1. Plaats de pCL2_BC barcode plasmide in de heterozygote diploïde stam met behulp van de transformatie protocol in Gietz en Woods ⁸ beschreven met de volgende wijzigingen.
      1. Nadat de cellen zijn geïncubeerd met de transformatie mengsel bij 30 ° C gedurende 20 minuten, voeg DMSO tot 8% van het volume van het transformatiemengsel. Toevoeging van DMSO werd gevonden dat de transformatie-efficiëntie verbeteren in enkele stam achtergronden ^9.
      2. Na de heat shock stap, pellet de cellen met een kort centrifugeren, decanteren de transformatie mengsel, en was de cellen voorzichtig in YPD. Vervolgens resuspendeer de cellen in 1 ml YPD en laat ze herstellen bij kamertemperatuur gedurende 3 uur zonder schudden.
   2. Selecteer transformanten door uitplating op YPD + G418 (200 ug / ml) agarplaten. Om een complexe pool van plasmide barcodes waarborgen, oogst een groot aantal kolonies, bijv. 5 platen met ~ 2500 kolonies per plaat.
   3. Zodra kolonies zijn zichtbaar (2-3 dagen van de groei bij 30 ° C), zwembad de transformanten door voorzichtig schrapen ze van de plaat in vloeibare YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% glycerol. Vortex deze celsuspensie, over te dragen aan een cryoconserveringsflesje en invriezen bij -80 ° C. Maak een apart ingevroren voorraad voor elke plaat. Deze bevroren voorraden dienen als uitgangsmateriaal stammen voor stap 3.1 en kan ook worden gebruikt om meer tetraden genereren later, indien gewenst.

      3. Sporuleren de Bibliotheek van getransformeerde cellen te verkrijgen Barcoded Tetrads

      1. Herleven cellen uit de bevroren voorraden die in 2.3 door O / N groei in 5 ml YPD + G418 (200 ug / ml) bij 30 ° C onder roeren.
      2. Was de cellen van de O / N culturen 3x in PBS (pH 7,4) en resuspendeer de cellen in sporulatie medium ⁷ plus 200 ug / ml G418.
      3. Schud sporulatie culturen bij RT en bewaken sporulatie vooruitgang dagelijks tot nieuwe tetraden gestopt vormen.
      4. Zodra de cultuur bevat welgevormde tetraden en relatief weinig duo's, verwijder culturen uit agitatie en laat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 7 dagen. Terwijl sommige kruisen vatbaar kan zijn op plaat spijsvertering en verstoring zodra tetrads gevormd (bepaald als beschreven in 7.3), de aanvullende incubatie (7-10 dagen in onze experimenten) is essentieel voor andere kruisen. Daarom wordt deze stap ten zeerste aanbevolen.

      4. Bepaalde FACS Gates voor Viertal Sorting

      De meiose tot expressie SPS2-GFP-fusie op pCL2_BC plasmide kan tetrads in de kweek sporulatie worden gedetecteerd en geïsoleerd uit de kweek door fluorescentie. Het volgende protocol is ontwikkeld voor een FACSAria II.

      
      Figuur 2. FACS poorten. Een reeks van vier opeenvolgende poorten wordt gebruikt om tetraden isoleren. De in (A) poorten en (B) bijdragen tot het verminderen van het aantal bosjes. Fluorescerende gebeurtenissen worden geselecteerd met de poort in (C). Het histogram in (D) heeft twee pieken. Evenementen in de linker piek zijn voornamelijk tetraden (image inzet links), en evenementen in de juiste piek zijn over het algemeen Tetrads met een bijgevoegd knop (inzet afbeelding rechts). Een laatste poort istoegepast op dit histogram om gebeurtenissen die meestal tetraden (rode balken) te selecteren. Dit cijfer is gewijzigd van Ludlow, et al. ^1.

      1. Laad de gesporuleerde cultuur op een FACS sorter en het opzetten van twee voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing poorten naar puin, samengeklonterd cellen, en meerdere cellen per druppel uit te sluiten (Figuren 2A en 2B).
      2. Er moet een populatie van fluorescerende cellen, die bij gebruik van de SPS2-GFP reporter construct omvatten dyades en tetraden ¹⁰ zijn. De poort van de GFP vs FSC deze fluorescerende gebeurtenissen (figuur 2C) omvatten.
      3. Afhankelijk van de stamachtergrond kan het noodzakelijk zijn een extra poort klonten die tetraden en andere cellen omvatten verwijderen omvatten. Indien dit noodzakelijk is, inspecteren een FSC histogram van de fluorescerende gebeurtenissen en geef een poort die evenementen met lagere FSC (figuur 2D, gated gebeurtenissen zijn in het rood) omvat.
      4. Controleer de werking van de t hij gating regime door het sorteren ~ 1500 tetraden op een microscoop glijbaan en het tellen van het aantal tetraden aan niet-tetraden behulp van een fase-contrast microscoop op 400X vergroting. Het percentage tetrads nauwkeurig worden geschat door het tellen van slechts ~ 200 gesorteerd gebeurtenissen, maar sorteren ~ 1500 vermindert de hoeveelheid tijd besteed aan het zoeken naar cellen op het objectglaasje. Alternatief kan de verhouding van tetrads niet-tetraden worden beoordeeld in stap 4.5.
      5. Controleer regelmatig of de sorter nauwkeurig is de rapportage van het aantal evenementen door het sorteren 25 tetraden op een microscoop glijbaan en het onderzoeken van de cellen die in de druppel met behulp van een fase-contrast microscoop op 400X vergroting. Er dient 25 tetrads in de druppel. Herhaal dit 3-4x de variantie van de FACS instrument te beoordelen.

      5. Sorteren Tetrads op een Agar Plate

      p_upload/51401/51401fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
      Figuur 3. Plaatsing van de agar plaat op de FACS sorter. Om tetraden sorteren in een kleine daling van de zymolyase oplossing geplaatst in het midden van een standaard (cirkelvormige) agar plaat, een standaard (100 mm rechthoekig) 96-well plaat is de eerste die op de fase van de cel sorteerder en de sorteerder wordt geprogrammeerd tetraden storten van een bepaalde put (in dit geval D5). Vervolgens wordt de cirkelvormige agarplaat bovenop de plaat met 96 putjes geplaatst en uitgelijnd dat de druppel zymolyase gecentreerd over een bepaalde put.

      1. Verwarm het gewenste aantal YPD + G418 (200 ug / ml) platen ten minste 1,5 uur in een 37 ° C incubator nabij de FACS sorter.
      2. Een belangrijk kenmerk van de sortering protocol is de mogelijkheid om nauwkeurig richten FACS gesorteerd tetrads een specifieke locatie op een agarplaat die een pool van zymolyase oplossing bevat. Om dit te doen, plaats een "mijlpaal" 96-well plaat op thij geautomatiseerde cel depositie eenheid (ACDU) van de sorter. Bereid een soort lay-out die zal sorteren 25 tetraden in een putje van een 96-well formaat. Kies een put in het midden van de plaat, zoals goed D5. Figuur 3 toont een petrischaaltje 96-well plaat op een celsorteerder geladen. Sortering 25 tetraden per plaat levert goed gescheiden kolonies.
      3. Breng een stapel 10 agarplaten uit de 37 ° C incubator om de sorteerder.
      4. Neem een ​​agarplaat en pipetteer 25 pl zymolyase-oplossing (1 mg / ml in 0,7 M sorbitol) op de agar in het midden van de plaat. Plaats vervolgens de plaat op de historische 96-well plaat, het uitlijnen van de zymolyase druppel over het doel en uit stap 5.2, bijv. goed D5.
      5. Start het sorteren en storten 25 tetrads in het midden van de zymolyase druppel op de agarplaat. Verwijder vervolgens en bedek de plaat.
      6. Herhaal de stappen 5.4 en 5.5 tot en met 25 tetraden zijn gesorteerd in zymolyase druppels op elke plaat in de stapel. De terugkeer van de stapel-tetrad bevattende platen om de 37 ° C incubator.
      7. Herhaal stap 5.3 tot 5.7 totdat alle platen hebben tetraden.

      6. Scheiden Sporen

      1. Incubeer elke stapel van tetrad bevattende agarplaten bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
      2. Verwijder platen uit de incubator, voeg 15-25 steriele 3 mm glasparels per plaat, en schud de platen als een stapel (of als twee stapels van 5 platen) voor 3-5 minuten. De beste spore scheiding wordt bereikt door het verplaatsen van de platen stijf van links naar rechts of van voor naar achter. Niet bewegen de platen zodanig dat de kralen "swirl" rond de buitenrand van de plaat. Laat de kralen op de platen als u klaar bent.
      3. Plaats de stapel platen met kralen zijde naar boven in een 30 ° C incubator. Haal de volgende stapel platen uit de 37 ° C incubator, en herhaal stap 6.2.
      4. Incubeer de platen O / N bij 30 ° C.

      7. Oogsten Kolonies

      1. Naeen O / N incubatie bij 30 ° C, moeten kleine kolonies zijn gevormd op de platen. Verwijder voorzichtig de platen uit de incubator zonder verstoring van de glazen kralen.
      2. Verwijder de glazen kralen door het zorgvuldig en snel omkeren van de platen over een diepe container. De container moet diep genoeg zijn om de kralen te vangen zonder ze te stuiteren op en raakte de agar plaat zijn. Door op de onderzijde van de plaat terwijl het omgekeerde kan helpen verjagen kralen die vastzitten aan de plaat. Deze kralen kunnen worden hergebruikt door grondig wassen met zeep, goed spoelen met gedemineraliseerd water en steriliseren in een autoclaaf.
      3. Tel het aantal kolonies op elke plaat en gebruik het aantal kolonies op de efficiëntie van spore scheiding en terugwinning schatten. Bijvoorbeeld, kon 25 tetraden per plaat voor een kruis met in de buurt van de levensvatbaarheid 100% van een totaal van 100 kolonies per plaat opleveren.
      4. Van platen met een voldoende aantal kolonies (> 65 voor een high-levensvatbaarheid kruisen), overdracht cellen van elke colony in een aparte goed van een 96-wells plaat met YPD vloeibaar + G418. Ook, noteer die putjes bevatten kolonies van dezelfde agar plaat; Deze informatie zal worden gebruikt om de opdracht viertal software helpen.
      5. Gebruik de 96-well vloeistof platen te kweken voor genotypering en voor het opslaan van stammen als bevroren glycerol voorraden zaad. Details over RAD-tag sequencing en sequentie-analyse is te vinden in Ludlow et al. ^1.

Representative Results

BESTE kan sterk verbeteren van de snelheid waarmee sporen uit tetraden kunnen worden geïsoleerd. Als voorbeeld van het debiet deze werkwijze kan leveren, een onderzoeker voerde de FACS sorteren en spore scheiding (stap 5,1 tot 6,3) met 149 agarplaten in 3 uur ^1. Een gelijkwaardige opbrengst (ongeveer 3725 tetraden) zou meer dan 90 uur van handmatige dissectie nodig. Zoals met veel high throughput methoden, de huidige iteratie van de werkwijze heeft enkele rendementsverlies opzichte van handmatige dissectie. Dit verlies manifesteert als een gereduceerd aantal kolonies teruggewonnen vergeleken met de verwachting berekend op basis van de spore levensvatbaarheid van het kruis, bepaald door handmatige dissectie (Stap 1.4). Ervan uitgaande dat de oorzaken van spore verlies (Discussie) beïnvloeden sporen willekeurig kunnen schattingen worden gemaakt van het aantal teruggewonnen kolonies zal deelnemen tetrads waarin 1, 2, 3 of 4 sporen zijn teruggewonnen (Figuur 4).

Figuur 4. Simulatie van werkwijze efficiëntie op het viertal niveau. Niet succesvolle sporen herstellen (zo kolonies) kan door spore inviability, spore hechting aan de glazen kralen, niet-sporen gescheiden van elkaar, enz. worden De binomiale verdeling werd gebruikt de verwachte fractie tetrads (met ten minste een verhaald spore) produceert 4, 3, 2 of 1 kolonies gebaseerd op het percentage van alle sporen verhaald berekenen. Deze grafiek kan dienen als een ruwe gids voor het aantal stammen die uiteindelijk zullen worden samengevoegd tot 3 - of 4 - spore tetraden. Als het aantal kolonies per plaat toeneemt, neemt ook het aantal volledige tetraden hersteld.

In de hierboven beschreven experiment 25 tetrads van de flank met spore levensvatbaarheid bijna 100% (zo detmet hermelijn getooid door handmatige dissectie) ¹ werden uitgezet op 149 agar platen. In dit experiment, het maximale aantal kolonies per plaat waargenomen was 80, wat aangeeft dat 20 sporen geen afzonderlijke kolonies vormen. Het gemiddelde aantal kolonies per plaat was. Kolonies 62 uit de 61 platen met 65 of meer kolonies werden geoogst en de sequentie. Van de 3.700 stammen die sequencing kwaliteitscontrole gepasseerd, kon 72% computationeel ingedeeld in 3 - of 4 - spore tetraden.

Discussion

Vele gebieden van genetisch onderzoek, van complex kenmerk afbeelding ¹¹ de studie van mechanismen DNA recombinatie ^12, worden zeer grote aantallen nakomelingen en grote hoeveelheden DNA sequencing. Technieken die de kracht van de conventionele benaderingen met de capaciteit van high throughput DNA-sequencing trouwen hebben het potentieel om studies die eerder hardnekkige verkeerden. Hoewel verschillende high-throughput gistgenetica methoden effectief zijn toegepast op specifieke problemen, elk heeft beperkingen die niet aan de brede toepasbaarheid van conventionele tetradenanalyse vallen. BESTE adressen deze uitdagingen door het gebruik van een high-throughput aanpak waarbij tetrad dissectie en genotypering het nageslacht van gist kruisen. In combinatie met multiplex-RAD-tag sequencing, BEST biedt een goedkope manier om genotype informatie verzamelen voor elk nageslacht stam behoud tetrad relaties door middel van unieke tetrad barcodes.0; Van alle momenteel gebruikte high throughput methoden, BESTE nauwst recapituleert de door een handmatig ontleed gist kruis informatie.

BEST heeft twee belangrijke functies. De eerste is het gebruik van FACS snel isoleren tetraden afgelegen unsporulated cellen in de kweek (Protocol stappen 5-6). De mogelijkheid om duizenden fluorescerende evenementen (tetraden) isoleren geeft BESTE haar grootste winst van de overslag. Deze automatisering biedt een nog groter voordeel boven handmatige dissectie voor kruisingen met lage sporulatie rendement, vanwege de toegenomen tijd die nodig is om visueel zeldzame gebeurtenissen te identificeren. De tweede belangrijke kenmerk is het gebruik van een zeer complexe moleculaire barcode (Protocol Stap 2) dat voor iedere zuster spore van een viertal wordt verzonden. Omdat deze barcodes kunnen worden gebruikt om computationeel reconstrueren viertal relaties tussen sporen die willekeurig zijn verdeeld over een agarplaat, de noodzaak om handmatig reeks cellen in een geordende rooster verlicht. Tenslotteomdat de moleculaire streepjescode en sporulatie-specifiek GFP reportergen fysiek verbonden (op hetzelfde plasmide) worden alleen tetrads dat de moleculaire streepjescode hebben behouden geselecteerd door FACS-sortering.

Er zijn twee overwegingen die de tijdsduur dat culturen in de sporulatie medium worden geïncubeerd regelen. Ten eerste, omdat de sporulatie specifieke reporter (SPS2-GFP) in het begin van meiose wordt uitgedrukt, GFP alleen niet compleet 4-spore tetraden onderscheiden van cellen die niet hebben voltooid meiose (dwz tweetallen). Terwijl de extra FACS gating het aantal fluorescerende, onvolledige tetraden kan afnemen, is de gemakkelijkste manier om deze ongewenste gebeurtenissen verlagen gewoon toezicht op de sporulatie cultuur (Stap 3.3) en over te gaan zodra nieuwe tetraden zijn gestopt vormen. In onze experimenten de frequentie van tweetallen gesorteerd minder dan 1%. Ten tweede, voor sommige kruisen extra tijd doorgebracht in sporulatie medium bij kamertemperatuur zonder agitatie (Stap 3.4) significantly verbetert de scheiding van tetrads door de glasparels gedurende plating ((Protocol stap 6). In feite is deze stap absoluut noodzakelijk om verstoring van sommige kruisen.

Zoals alle high throughput methoden, BEST is "luidruchtiger" dan de overeenkomstige conventionele benadering. De bescheiden vermindering van de efficiëntie van BEST vergeleken met conventionele tetrad dissectie zou kunnen voortvloeien uit een combinatie van verschillende factoren. Een factor is de toegenomen verlies van overigens gezonde sporen, die kan voortvloeien uit hechting aan de glasparels tijdens verspreiding en verhoogde spore overlijden als gevolg van de mechanische belasting van het proces. Een tweede factor kan eenvoudig plasmide verlies tijdens de meiose. Een derde factor kan een effectieve daling van de bruikbare kolonies als gevolg van kolonies met gemengde genotypes zijn, naar schatting ~ 5% van de kolonies in onze piloot kruist ^1. Het is waarschijnlijk dat deze kolonies vertegenwoordigen mislukkingen van zus spore scheiding. Omdat de snelle fluorEscence sorteren en spore scheiding toestaan ​​dat de verzameling van enorme aantallen tetraden, is het best goed uitgerust om dalingen in efficiëntie op deze schaal te overwinnen. Terwijl toekomstige herhalingen van BEST efficiëntie kunnen verhogen naderen die van handmatige dissectie, is het misschien meer waarschijnlijk dat de huidige exponentiële traject van DNA-sequencing capaciteit snel zal compenseren voor dit niveau van bruikbare spanning verlies. Desondanks zullen de mogelijkheid tetradenanalyse voeren op de schaal die het best kan worden toegepast studies die momenteel haalbaar door handmatige methoden mogelijk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACSAria II (Special order unit)	BD Biosciences		Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488 nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto Petri dishes
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html