İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Summary

Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler.

Abstract

Tetrad analiz maya genetiği için değerli bir araçtır, ancak sürecin zahmetli manuel doğa büyük ölçeklerde başvurusunu engellemiştir. Barkod tetradların sekanslanması (BEST) ^1, izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri Etkin. İYİ doğrudan ascus enzimatik olarak sindirilir ve sporlar bozulur ve rastgele cam boncuk dizilmiş kaplama ile agar plakalar üzerine tetratların floresan-aktive edilmiş hücre sıralama izin veren bir sporülasyon özel GFP füzyon proteini sayesinde iki baştan izole eder. Sporlar genotiplemesi sırasında okunan moleküler barkod kullanarak, aynı tetrat kökenli yani bilgi hangi haploid kolonileri sonra, kardeş spor ilişkiler atanır. Manuel diseksiyon darboğaz kaldırarak, tetratların yüzlerce veya hatta binlerce dakika içinde izole edilebilir. Burada maya İYİ gerçekleştirmek için gerekli deneysel prosedürleri ayrıntılı bir açıklama sunmakSaccharomyces cerevisiae, haploid öz değişmesine ait soyundan türetilen koloni izolasyonu ile bir heterozigot diploid suşu ile başlayarak.

Introduction

Yaygın tetrad analizi olarak bilinen Mayotik gen haritalama, maya genetik merkezidir. Kısaca, her biri, her kromozomun tek bir kopyasını içeren iki haploid suşları, her kromozomdan iki kopya, her ebeveynden biri ile bir heterozigot diploid gerginlik oluşturmak için evlendirilen. Azot için diploid hücreler açlıktan kromozomlar, yinelenen yeniden düzenlenmesini geçmesi ve her ebeveyn alellerin yeni kombinasyonları ile dört haploit hücreleri (sporlar veya ayırımlarındaki) bölün (sporulasyon) hangi mayoz neden olur. Tek bir mayoz kaynaklanan dört sporlar tetrad adı verilen bir manuel işlemle izole edilebilir.

1937 yılında ⁴ orijinal yayınlanmasından bu yana nispeten daha az değişti Konvansiyonel tetdar diseksiyonu ^2,3, üç hedefi vardır. İlk olarak, mayoz (tetradların) geçirmiş hücreleri vejetatif hücrelerin bir arka plan uzak izole edilmelidir. Geleneksel analizde, bu kullanarak, kim bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilirBir mikroskop, görsel olarak bir agar plaka üzerinde iki baştan tanımlar ve bir mikromanipülatör cihaz görsel bir agar plaka üzerinde iki baştan belirlenmesi ve plaka bir hücre içermeyen alanı üzerine tetrad taşımak için bir mikro manipülatörün kullanılması kullanmaktadır. Daha sonra, Tetrad dört sporlar fiziksel interspore çiftleşme önlemek için ayrılmalıdır. Bir tetrad içindeki sporları bir TSKB'lerin, orijinal diploid hücrenin hücre duvarının kalıntısı ve interspore köprü ^5, bir dizi her ikisi tarafından bir arada tutulur. Geleneksel tetrad analizde ascus enzimatik sindirimi ile çıkarıldı ve bir araştırmacı interspore köprüleri kırmak ve sporlar ayrı takılmak mikromanipülatör kullanır. Son olarak, bireysel sporlar sporlar arasındaki ilişkiyi korur bir ızgarah model halinde dizilirler, dört bir satırda, yani tüm döl aynı orijinal tetrat kardeş sporlar. Deneyimli bir maya araştırmacı 10 tetradların (genel kabul görmüş en az sayıda diseksiyon işlemini tamamlayabilirsinizYaklaşık 15 dakika içinde) haç başına.

Biz ¹ (BEST) T etrads arasında nabled S equencing B ARCODE E dediğimiz yeni bir yüksek verimli tetdar genotiplendirme yöntemi geliştirdik. İYİ izole döl çok sayıda, genotip, ve dört öz değişmesine ait ürünlerin kardeş spor ilişkileri geri olanak sağlayan bir şekilde, bireysel olarak muhafaza oluşumunu ve genotipleme sağlayarak yüksek verimli genetik mevcut yöntemler genişletmektedir. Bu üç temel strateji (Şekil 1) kullanılarak gerçekleştirilir. Üretim GFP ile mayoz geçirmiş hücreler etiketler ve onları (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile izole edilebilir sağlayan bir raportör konstruktunun giriştir. İkinci bir tetdar dört sporları iletilir ve rekombinant Progen bir DNA dizilemesi ile okunabilir bir biçimde son derece karmaşık bir DNA barkod eklenmesi (15 rasgele bir nükleotid string) olduğuBöylece y ve aynı tetrat ikinci kardeş sporlar tanımlar. Üçüncü genotiplendirme adımdır, ve en iyi yakalayan genomik işaretleri bir dizi yanı sıra tetdar özel barkod hem de çok sayıda genotiplendirme platformları ile uyumludur. Biz, böylece tutarlı, 2-3 döl soylarının genomunun% yanı sıra yakalama, bir kısıtlama alanı ile ilişkili etiket DNA dizilemesi (RAD-seq) belirli bir kısıtlama bölge ¹ için genom sekanslama yönlendirir ⁶ yöntemi kullanan plazmid kaynaklı barkod . Çapraz deneysel olarak türetilmiş genotipleme verileri ile birlikte tetrad ilişkilerinin geri düşük sıra kapsamı ile belirteçlerin durumu ve inviable (ve dolayısıyla kurtarılamaz) bireylerin dahil olmak üzere, komple genotip eksik bilgilerin doğru bir çıkarım sağlar. Burada, öz değişmesine ait eşleme için en yaygın olarak kullanılan mikroorganizma, maya S. yöntemin uygulanmasını tarif cerevisiae. Bununla birlikte, organizma özgü rea küçük ikameleri ileGent, GFP ile kaynaşmış, örneğin farklı sporlaşma-spesifik proteinler, yöntem, öz değişmesine ait eşleme yoğun ya da şu anda çok daha dirençli iş olduğu organizmalar dahil olmak üzere diğer mikroorganizmalar, kolaylıkla devredilecek olmalıdır.

Şekil 1. Iyi yöntem. (A) plazmid pCL2_BC bir sporülasyon özel GFP füzyon, G418'e karşı direnç ve bir 15-mer rastlantısal barkod ile 2 mikron plazmiddir. Plazmid kütüphane yapımı Ludlow et al ¹ 'de tarif edilmektedir. (B) Barkodlanan plasmidin bir havuz bir çapraz diploid soy dönüştürülmüştür. (C) Transformantlar daha sonra seçime yetiştirilir ve ~ 10000 dönüştürülmüş koloniler bir araya toplanmış ve sporule edilir. Mayoz bölünme sırasında tetrat her spor bir co devralırBarkodlanan plazmid py. (D) iki baştan FACS ile unsporulated hücrelerinden ayrılan ve sindirildi ve her spor bir koloni oluşturmak için izin bozulmuş agar plakaları üzerinde toplanır. (E) koloniler daha sonra, 96-gözlü levhalar içine toplanmıştır fenotiplenebilmektedir ve genotipleme edilir. Genotiplenmesi sırasında plasmid barkod okumak ve her tetrat dört üyelerini tespit etmek için kullanılır. Bu rakam Ludlow ark ¹ modifiye edilmiştir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Protocol

1.. Gerilme İnşaat ve Karakterizasyonu

1. Haploid suşları çiftleşme ve diploid ² seçerek veya doğal olarak oluşan bir heterozigot suşu kullanılarak çapraz kullanılacak heterozigot diploid soy oluşturun. Suşları GFP liman olmamalı.
2. Gerginlik YPD ² + 200 ug / ml G418 üzerinde büyümek mümkün olduğunu onaylayın.
3. Gerilme sporlanmalanna mümkün olduğunu onaylayın. İYİ düşük sporulasyon verimlilik haçlar ile uyumlu, ancak düşük frekanslı sporulasyon artar FACS sıralama süre gereklidir.
   1. 5 ml YPD suşun bir O / N kültür ayarlamak ve 30 ° C'de çalkalama ile büyür
   2. PBS (pH 7.4) ile O / N kültürünün 0.5 ml üç kez yıkayın.
   3. Yıkanan hücreler Pelet, 2 mi sporlaşma ortamının ^7'de süpernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
   4. Oda sıcaklığında hücreleri kışkırtmak ve 40X objektif ile bir faz kontrast ışık mikroskobu kullanılarak tetdar oluşumu için günlük kontrol edin.
   </ Ol>
   5. Tetratların az sayıda (~ 20) geleneksel diseksiyonu ^2,3 ile haç spor canlılığı tahmin. Farklı arka planlar arasında gerginlik melezlerde spor canlılığı yaygın ve beklenmeyen değişir. Ancak, spor canlılığı önsel beklentileri önceki suşları tasarrufu ve genotiplenmesi emek ve maliyet-yoğun adımlara BEST deney etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenle, bu adım son derece tavsiye edilir.

   Barkodlu Plazmitlerin Kütüphanesi ile diploidlerin 2. Dönüşüm

   1. Aşağıdaki modifikasyonlarla Gietz ve Woods ⁸ içerisinde tarif edilen transformasyon protokolü kullanılarak heterozigot diploid soy içine pCL2_BC Barkodlanan plazmid yerleştirin.
      1. Hücreler, 20 dakika boyunca 30 ° C de dönüşüm karışımı ile inkübe edildikten sonra, transformasyon karışımı hacminin% 8 DMSO ilave edin. DMSO ilavesi dönüşüm etkinliği i geliştirmek için bulunmuşturn Biraz gerginlik arka ^9.
      2. Isı şoku aşamasından sonra, kısa bir santrifüj ile pelet hücreleri dönüşüm karışımı süzün ve YPD yavaşça hücreleri yıkayın. Daha sonra, 1 ml YPD hücreleri tekrar süspansiyon ve onları çalkalama olmaksızın, 3 saat boyunca oda sıcaklığında kurtarmak için izin verir.
   2. Agar plakaları YPD + G418 (200 ug / ml) üzerine kaplama ile transformantların seçin. Plasmid barkodlar karmaşık bir havuz sağlamak için, koloni çok sayıda plaka başına ~ 2500 koloni ile örneğin 5 plakaları hasat.
   3. Koloniler (30 ° C'de 2-3 gün büyüme) görebilir sonra, dikkatli bir şekilde, sıvı YPD + G418 (200 ug / ml) +% 15 gliserol içine plaka onları kazınarak transformantların havuz. Vortex Bu hücre süspansiyonu, bir kriyokoruma şişeye aktarın ve C. her plaka için ayrı bir donmuş stok sağlayın -80 ° C'de dondurun. Bu dondurulmuş stokları Aşama 3.1 için başlangıç ​​suşlar olarak görev yapar ve ayrıca arzu edildiği takdirde, daha sonraki bir tarihte fazla iki baştan oluşturmak için de kullanılabilir.

      3.. Barkodlu tetradların Edinme Dönüştürülmüş Hücreleri Kütüphanesi sporlanan

      1. Çalkalama ile 30 ° C'de 5 ml YPD + G418 (200 ug / ml) içerisinde O / N büyüme 2.3 oluşturulan donmuş stoktan hücreleri canlandırmak.
      2. O, hücreleri yıkanır / N kültürler PBS (pH 7.4) içinde 3 kat ve sporlaşma ortamının ⁷ artı 200 ug / ml G418 içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
      3. Oda sıcaklığında sporulasyon kültürleri kışkırtmak ve yeni tetradların oluşturan durduruldu kadar günlük sporulasyon ilerlemeyi izlemek.
      4. Kültür iyi biçimli iki baştan ve nispeten daha az dyads içerir sonra, ajitasyon kültürleri kaldırma ve en az 7 gün boyunca oda sıcaklığında bırakın. Bazı haçlar (7.3 'de açıklandığı gibi değerlendirilen) kısa sürede tetradların oluşmuş gibi plaka sindirim ve bozulma üzerinde mükellef olsa da, ilave inkübasyon (bizim deneylerde 7-10 gün), diğer haç için gereklidir. Bu nedenle, bu adım son derece tavsiye edilir.

      4. KurmakTetrad Sıralama için FACS kapıları

      Meiotically pCL2_BC plazmid üzerinde SPS2-GFP füzyon sporülasyon kültüründe iki baştan tespit edilir ve floresan ile kültürden izole edilmesini sağlar ifade edilmiştir. Aşağıdaki protokol, bir FACSAria II için geliştirilmiştir.

      
      Dört ardışık kapılarının Şekil 2.. FACS kapılar. Bir dizi iki baştan izole etmek için kullanılır. (A) gösterilen kapıları ve (B) kümeleri sayısını azaltmaya yardımcı olur. Floresan olaylar (C) 'de kapı ile seçilir. (D) 'de histogram iki tepe vardır. Sol zirve olaylar öncelikle tetradların (sol inset görüntü), ve sağ altta olaylar genellikle bağlı bir tomurcuk (sağ inset görüntü) ile tetradların vardır. Son bir kapısıçoğunlukla tetradların (kırmızı bar) olan olayları seçmek için bu histogramına uygulanır. Bu rakam ark ^1, Ludlow modifiye edilmiştir.

      1. FACS sıralayıcı üzerine sporlu kültürünü yükleyin ve enkaz, clumped hücreleri ve damlacık başına birden hücreleri hariç iki ileri dağılım ve yan dağılım kapıları kurmak (Şekil 2A ve 2B).
      2. SPS2-GFP raportör yapıyı kullanırken dyads ve tetradların ¹⁰ dahil floresan hücreler, bir nüfus var olmalıdır. Kapısı bu floresan olayları (Şekil 2C) dahil FSC vs GFP.
      3. Soy arka bağlı olarak, iki baştan ve diğer hücreler bulunmaktadır kümeleri kaldırmak için ilave bir kapısı dahil etmek için gerekli olabilir. Bu gerekli ise, floresan olayların FSC histogramı incelemek ve alt FSC (Şekil 2B, kapı olaylar kırmızı olan) ile olayları içeren bir kapı belirtin.
      4. T verimliliğini kontrol edin o bir mikroskop lamı üzerine ~ 1500 tetradların sıralama ve 400X büyütmede faz kontrast mikroskop kullanılarak olmayan tetratların için tetratların oranını sayarak rejimini yolluk. Tetratların yüzdesi doğru sadece ~ 200 sıralanmış olayları sayarak tahmin, ama ~ 1.500 süreyi azaltır sıralama mikroskop lamı üzerine hücreler arıyor geçirmiş olabilir. Seçenek olarak ise, non-tetratların için tetratların oranının Aşama 4.5 sırasında değerlendirilebilir.
      5. Periyodik sıralayıcı doğru bir mikroskop lamı üzerine 25 tetradların sıralama ve 400X büyütmede faz kontrast mikroskop kullanarak damlacık bulunan hücreleri inceleyerek olayların raporlama numarası olup olmadığını kontrol edin. Damlacık 25 iki baştan olmalıdır. FACS aletin varyansını değerlendirmek için 3-4x tekrarlayın.

      Bir Agar Plate üstüne 5. Sıralama tetradların

      p_upload/51401/51401fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
      FACS sıralayıcı agar levhasının Şekil 3.. Yerleştirme. Standart (dairesel) agar plakası, standart bir (100 mm dikdörtgen) ortasına yerleştirilen askiyle sonuçlanır ki, küçük bir çözelti damla içine iki baştan sıralamak için 96 oyuklu plaka ilk hücre sıralayıcı sahnede yerleştirilir ve sıralayıcı (bu durumda D5 olarak) belirli bir kuyuya tetradların yatırmak için programlanmıştır. Daha sonra, dairesel agar plakası 96 oyuklu plaka üzerine yerleştirilir ve askiyle sonuçlanır ki içinde damla belirtilen aşkın ortalanacak şekilde hizalanır.

      1. FACS sıralayıcı yakınında konumlanmış bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde en az 1.5 saat için YPD + G418 (200 ug / ml) plakaları istenilen sayıda ısıtın.
      2. Sıralama protokolü önemli bir özelliği doğru FACS askiyle sonuçlanır ki çözümün bir yüzme havuzu içeren bir agar plaka üzerinde belirli bir yere tetradların kriteri hedef yeteneğidir. T Bunu yapmak için, bir "dönüm noktası" koyun 96-plakao sıralayıcının hücre birikimi birimi (ACDU) otomatik. 96-iyi bir formatta bir kuyuya 25 tetradların sıralamak bir tür düzen hazırlayın. Seç de plakanın ortasına yakın, örneğin iyi D5. Şekil 3, bir hücre sıralayıcı üzerine yüklendi bir kap ve 96-çukurlu bir levhayı gösterir. Plaka başına 25 tetradların Sınıflandırma iyi ayrılmış koloniler verir.
      3. Sıralayıcı için 37 ° C inkübatör 10 agar plakaları istifini getirin.
      4. Plakasının merkezine yakın agara askiyle sonuçlanır ki bu çözeltisinin bir agar plakası ve pipet 25 ul (0.7 M sorbitol içinde 1 mg / ml) al. Sonra, Adım 5.2, örneğin iyi D5 iyi hedef üzerinde askiyle sonuçlanır ki damlacık hizalama, dönüm noktası 96-plaka üzerinde plaka koyun.
      5. Çeşit başlangıç ​​ve agar plaka üzerinde askiyle sonuçlanır ki damlanın ortasına 25 tetradların yatırmak. Sonra çıkarın ve kapak plakası.
      6. Tekrar 5.4 Adımları 5.5 25 kadar tetradların yığını her tabakta askiyle sonuçlanır ki damlacıklar halinde tasnif edilmiştir. 37 ° C inkübatör tetrad içeren plakaların geri koyun.
      7. Tüm plakalar tetradların bulana kadar 5,7 ile 5,3 Adımları tekrarlayın.

      6.. Ayırma Sporlar

      1. 1.5 saat boyunca 37 ° C 'de dörtlü ihtiva eden agar plakaları her bir yığın inkübe edin.
      2. , Inkübatörden plakaları çıkarın plaka başına 15-25 steril 3 mm cam boncuk ekleyin ve 3-5 dakika için bir yığın (ya da 5 plakaları iki istif gibi) halinde plakalar çalkalanır. En iyi spor ayırma arka ya da ön yan yana katı plakaları hareket ile elde edilir. Bu tür plakanın dış kenarında boncuk "girdap" bu plakaları hareket etmeyin. Bittiğinde plakalar üzerinde boncuk bırakın.
      3. Boncuk 30 ° C inkübatör kadar yüz plakalarının yığını yerleştirin. 37 ° C inkübatör sonraki yığın plakaları almak ve Adım 6.2 tekrarlayın.
      4. 30 ° C'de plakalar O / N inkübe

      7. Hasat Kolonileri

      1. Sonra30 ° C'de, bir O / N inkübasyon, küçük koloniler plakalar üzerinde oluşturulmuş olmalıdır. Dikkatle cam boncuk bozmadan inkübatör plakaları kaldırmak.
      2. Dikkatle tarafından cam boncuk çıkarın ve hızlı bir şekilde derin kabın üzerinde plakaları tersini. Konteyner onları yukarı sıçrama ve agar plaka vurmak için izin vermeden boncuk yakalamak için yeterince derin olmalı. Bu ters çevrilir ise plakanın alt dokunulduğunda plakasına sıkışmış boncuk çıkarmak yardımcı olabilir. Bu boncuklar, iyonu giderilmiş su ile durulama ve otoklavlama ile sterilize, sabun ile iyice yıkanarak yeniden kullanılabilir.
      3. Her plaka üzerinde kolonilerin sayısını ve spor ayırma ve geri kazanım verimini tahmin etmek kolonilerin numarasını kullanabilirsiniz. Örneğin, yakın% 100 canlılığı ile bir haç için plaka başına 25 tetradların plaka başına 100 koloni toplam verim verebilecek.
      4. Her Colo yeterli kolonilerin sayıları (yüksek-canlılığı haçlar için> 65), transfer hücreleri ile plakalardan+ G418 YPD sıvı ihtiva eden 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyunun içine ny. Ayrıca, kuyular aynı agar plaka koloniler içerdiğini not edin; Bu bilgi tetrad atama programına yardımcı olmak için kullanılır.
      5. Genotipleme için ve donmuş gliserol stokları olarak suşları kaydetmek için tohum kültürleri 96 oyuklu sıvı plakaları kullanın. RAD-tag dizileme ve dizi analizi Detayları Ludlow ark ¹ bulunabilir.

Representative Results

İYİ ölçüde tetratların gelen sporlar izole edilebilir hızını artırabilir. Bu yöntem teslim throughput bir örnek olarak, bir araştırmacı, 3 saat içinde 149 ¹ agar plakaları ile sıralama FACS ve spor ayırma (Aşama 5.1 ile 6.3) gerçekleştirilir. Bir eşdeğer verimi (yaklaşık 3.725 tetradların) manuel diseksiyon fazla 90 saat gerektirir. Ancak, pek çok yüksek üretim yöntemleri ile birlikte, yöntemin mevcut yineleme manuel diseksiyon kıyasla verimliliği bir zararı bulunmaktadır. Kolonilerin sayısı azalır manuel diseksiyon (Adım 1.4) tarafından belirlenen haç spor canlılığı, göre hesaplanan beklenti ile karşılaştırıldığında kurtarıldı olarak bu kayıp tezahür eder. Spor kaybının (Tartışma) nedenleri rastgele sporlar etkiler varsayılarak, tahmin geri koloniler, 1, 2, 3 ya da 4 sporlar geri edildiği tetratların üyesi olan (Şekil 4) ne kadar çok yapılabilir.

Tetrad düzeyde başarıyla (koloniler) sporlar kurtarmak için. Başarısızlık de yöntemde verim Şekil 4. Simülasyon Binom dağılımı kullanıldı vs spor inviability, cam boncuk spor yapışma, birbirinden sporlar ayırmak için yetmezliğine bağlı olabilir başarılı bir şekilde geri kazanılmış tüm sporların oranına göre 4, 3, 2 veya 1 koloni üreten (en az bir başarılı bir şekilde geri sporlu) tetratların beklenen oranını hesaplamak üzere. Ya da 4 - - spor tetradların Bu grafik sonuçta 3 içine monte edilecek suşların sayısında kaba bir rehber olarak hizmet edebilir. Plaka artar başına kolonilerin sayısı arttıkça, kazanılan tam tetratların sayısı yapar.

Deney yukarıda açıklanan,% 100 spor canlılığı yakın olan bir haç 25 tetradların (det olarak) manuel diseksiyon ermined ¹ 149 agar plakaları üzerine plakalanmıştır. Bu deneyde, plaka başına gözlenen koloni sayısı 20 sporlar ayrı koloniler oluşturmak için başarısız olduğunu gösteren, 80 oldu. Plaka başına kolonilerin ortalama sayısı 65 ya da daha çok koloni ihtiva eden plakalar 61 hasat edilmiştir ve dizilenmiştir 62. Koloniler oldu. Ya da 4 - - sıralama kalite kontrol geçti 3.700 suşların,% 72 hesaplama 3 ayrıldı olabilir spor tetradların.

Discussion

Karmaşık özellik eşleme ¹¹ DNA rekombinasyonu ¹² altında yatan mekanizmaların çalışmaya kadar genetik araştırma birçok alanda, döl son derece büyük sayıda ve DNA dizilimi yüksek hacim gerektirir. Yüksek verimli DNA sekanslama kapasiteli konvansiyonel yaklaşımlar gücünü evlenmek teknikler daha önce, tedaviye dirençli olan çalışma sağlamak için potansiyele sahiptir. Çeşitli yüksek verimli maya genetik yöntemler özel sorunları etkin bir şekilde tatbik edilmiş olmasına rağmen, geleneksel her tetrad çözümlemesiyle geniş uygulanabilirliği yetersiz kalmaktadır sınırlamaları vardır. Tetrad diseksiyonu birleştirerek yüksek verimlilik yaklaşımı istihdam ve maya haçlar soyunu genotiplenmesi ile İYİ adresleri bu zorlukları. Mültipleksli RAD-tag sıralama ile bağlantılı olarak, İYİ benzersiz tetdar barkod vasıtasıyla tetdar ilişkilerini koruyarak her döl suşu için genotip bilgi toplamaktadır için ucuz bir yol sunar.0; Tüm şu anda yüksek verim yöntemler kullanılır, EN İYİ en yakın bir elle disseke maya haç tarafından sağlanan bilgiler tartışıldı.

İYİ iki önemli özelliklere sahiptir. İlk hızla (Protokol 5-6 adımlar) uzaklıkta kültür içinde unsporulated hücrelerden izole etmek için iki baştan FACS kullanılmasıdır. Floresan olaylar (tetradların) binlerce izole yeteneği İYİ throughput en büyük kazanç sağlar. Bu otomasyon sayesinde görsel nadir olayları tanımlamak için gereken artan zaman, düşük sporulasyon verimlilik ile haç için manuel diseksiyon üzerinde daha büyük bir avantaj sağlamaktadır. İkinci önemli özelliği bir tetrat her kardeş sporun iletilir son derece karmaşık bir moleküler barkod (Protokol Adım 2) kullanılmasıdır. Bu barkod rasgele Elle, düzenli bir ızgara dizisi hücrelerin hafifletilen için, bir agar plaka üzerinde dağıtılmıştır sporlar arasındaki ilişkileri tetrad yeniden hesaplama için kullanılabilir çünkü. Son olarak,moleküler barkod ve sporlaşma spesifik GFP raportör geni fiziksel olarak (aynı plazmid üzerinde) bağlı olduğu için, moleküler barkod muhafaza yalnızca iki baştan FACS sıralama seçilir.

Kültürler sporlaşma ortamının inkübe edilmelidir süreyi yöneten iki önemli nokta vardır. Sporulasyon özel raportör (SPS2-GFP) erken mayoz ifade edilir, çünkü ilk, tek başına GFP mayoz (yani dyads) tamamlamamış hücrelerin tam 4-spor tetradların ayırt etmez. Ek FACS yolluk floresan, eksik tetratların sayısını azaltmak olsa da, bu istenmeyen olayları azaltmak için en kolay yolu sadece sporulasyon kültürünü izleme (3.3 Adım) ve bir kez yeni tetradların oluşturan durdurdu ilerlemektedir. Deneylerde, kriteri dyads sıklığı% 1'den daha az olan. İkincisi, ajitasyon olmadan oda sıcaklığında sporulasyon ortamda harcanan bazı haçlar ek süre SIG (Adım 3.4)istatistiksel olarak anlamlı oranda Aslında bu adım, bazı haçlar bozulması için kesinlikle gerekli olan kaplama sırasında cam boncuk tetratların ayrılması ((Protokol Adım 6). geliştirir.

Tüm yüksek verimli metotlar gibi, İYİ gelen geleneksel yaklaşımından daha "gürültülü" dir. Geleneksel tetrad diseksiyonu karşılaştırıldığında BEST verimliliğinde mütevazı azalma çeşitli faktörlerin kombinasyonları sonucu olabilir. Bir faktör, işlemin mekanik gerilimlere karşı spor ölüm ya da artmış yayılma esnasında cam tanelerine yapışma neden olabilir ki, aksi halde uygun sporların artan kaybıdır. İkinci faktör mayoz sırasında basit plazmid kaybı olabilir. Üçüncü faktör karışık genotipleri ile kolonilerden kaynaklanan kullanılabilir sömürgelerinde etkili bir azalma olabilir, bizim pilot kolonilerin yaklaşık ~ 5% ¹ geçer. Bu koloniler kardeş spor ayrılık başarısızlıklarını temsil olasıdır. Çünkü hızlı fluorçeşitli teda sıralama ve spor ayırma tetratların muazzam numaraları koleksiyon izin, İYİ de bu ölçekte verimlilik düşüşler aşmak için donatılmıştır. BEST gelecek tekrarlamalar manuel diseksiyon yaklaşan verimliliği artırmak olsa da, DNA dizileme kapasite mevcut üstel yörünge hızla kullanılabilir gerginlik kaybı bu düzeyde telafi edeceğini belki daha olasıdır. Ne olursa olsun, İYİ uygulanabilir için ölçekte tetdar analizini gerçekleştirmek için yeteneği şu anda manuel yöntemlerle olanaksız olan çalışmaları sağlayacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACSAria II (Special order unit)	BD Biosciences		Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488 nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto Petri dishes
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html