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Biology

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

doi: 10.3791/51408 Published: May 29, 2014

Summary

Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Abstract

L'hétérogénéité de la population des cellules souches entrave compréhension détaillée de la biologie des cellules souches, telles que leur propension de différenciation vers les différentes lignées. Une analyse du transcriptome d'une cellule unique peut être une nouvelle approche pour disséquer la variation individuelle. Nous avons développé la méthode qRT-PCR seule cellule, et a confirmé que cette méthode fonctionne bien dans plusieurs profils d'expression génique. En niveau de la cellule unique, chaque cellule souche embryonnaire humaine, triées par OCT4 :: cellules positives à l'EGFP, a une forte expression dans OCT4, mais un niveau d'expression de NANOG différente. Notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile pour interroger des hétérogénéités de la population.

Introduction

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Populations eucaryotes plus élevés sont hétérogènes donc à l'analyse de la population mis en commun, il est souvent difficile d'interpréter leurs fonctions cellulaires. Les cellules individuelles au sein d'une population peut être légèrement différente, et ces différences peuvent avoir des conséquences importantes pour la propriété et la fonction de l'ensemble de la population 1, 2. Surtout, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont connus pour être hétérogène, ce qui entraîne différents niveaux de la pluripotence et potentiels divers aux spécifications de la lignée dans délicatement façons distinctes 3, 4. Par exemple, les différents antigènes de surface cellulaire peuvent être utilisées pour classer les cellules souches pluripotentes indifférenciées, 5 et le groupe Austin Smith a proposé différents niveaux de la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris, en fonction de leur morphologie, la différenciation propension et la dépendance de la voie 6 de signalisation. Ce phénomène a émis l'hypothèse d'un embryon humaincellules souches nic 7. Considérant que les études globales ont été effectuées entre les différentes lignées de cellules souches, et non pas des cellules souches simples particuliers, il pourrait être très intéressant d'analyser les différents niveaux de la pluripotence au niveau d'une seule cellule, ce qui affecte potentiellement leurs capacités de différenciation vers toutes les lignées de cellules somatiques.

Hétérogénéité cellulaire et moléculaire pourrait être dicté par profilage de transcription, qui est appelé le «transcriptome d'une cellule unique» et met l'accent sur ​​de nouvelles approches pour quantifier les niveaux d'expression des gènes 8-10. Pour l'analyse des niveaux d'expression de gènes dans des cellules individuelles, nous avons développé un protocole simple mais robuste de la cellule unique de RT-PCR quantitative. Nous avons confirmé l'efficacité et la faisabilité de notre protocole en comparant chaque moitié de lysats de cellules individuelles ainsi que ARN totaux dilués en série de CSEh, résultant des variations techniques minimales et les différences. En outre, nous avons utilisé une ligne de reporter génétique pour isoler p homogèneopulation de CSEh à l'aide de système de ciblage de gène. Le vecteur donneur pour cibler OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construire) et une paire de plasmides ont été utilisés Talen 11. Le vecteur donneur et une paire de plasmides Talen ont été introduits dans les CSEh (H9, WA09) à l'aide de notre nucléofection et protocole de sélection clonale et l'entretien des CSEh a été réalisée sur la base de notre protocole de routine 12. Nous avons confirmé cette ligne de reporter génétique exprimer EGFP pour l'expression de OCT4 dans OCT4 :: EGFP CSEh.

Notre résultat démontre que les CSEh individuelles (classés par OCT4 :: cellules fortement positives à l'EGFP) détiennent des niveaux élevés d'expression de OCT4, mais différents niveaux d'expression de NANOG. Ainsi, notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile d'étudier les hétérogénéités de la population de cellules souches pluripotentes.

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Protocol

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1. Préparation d'une plaque de 96 puits

  1. Mélanger 1 pl de Single Cell DNase1 à 9 pi Single Cell Lysis Solution.
  2. Mettez le 10 ul solution mixte dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR.

2. Retrait CSEh pour FACS Purification

  1. Détachez OCT4 :: lignée cellulaire EGFP ES à partir de la boîte de 60 mm avec 1 ml Accutase pendant 20 min, à 37 ° C, qui ont été neutralisés avec les médias ES humaine.
  2. Préparer population de cellules dans 1 ml de tampon FACS et ajuster la cellule à 1 x 10 6 cellules / ml.
  3. Passez l'échantillon de cellules à travers un tamis cellulaire tube à bouchon de 35 um.
  4. Stocker le tube dans la glace avant tri cellulaire.

3. Lysis de FACS purifié cellule unique dans chaque puits de la plaque de 96 puits

  1. Trier l'échantillon pour les cellules positives à l'EGFP sur un trieur de cellules avec un opérateur qualifié. Mettez la cellule unique dans une solution Lysis/DNase1 Single Cell dans la plaque PCR 96 puits. Si nécessaire, le 9Plaque à 6 puits à échantillon peut être stocké à -80 ° C un congélateur inférieur à un mois.
  2. Incuber les échantillons 5 min à température ambiante pendant la lyse des cellules.
  3. Ajouter 1 ul de solution d'arrêt pour arrêter la réaction de lyse.
  4. Incuber 2 min à température ambiante.

4. Transcription inverse

  1. Ajouter à chacun une aliquote de 0,5 ul de 20 uM SMA-T15, SMA-A.
  2. Ajouter 4 ul de tampon 5X, 2 yl de DTT, 1 pi de transcriptase inverse, et 1 ul de dNTP à chaque puits.
  3. Effectuer une transcription inverse dans un thermocycleur.
    1. Réglez le programme thermique à 42 ° C × 90 min et inactiver la transcriptase inverse à 85 ° C × 5 min.

5. Amplification

  1. Ajouter 4 pi de réactif ExoSAP-IT pour chaque échantillon transcrit inverse.
    1. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min et 80 ° C pendant 15 min pour inactiver le réactif ExoSAP-IT.
  2. Préparer mélange réactionnel PCR wvec SMA-p2 (2 nM)
  3. Ajouter 10 ul de mélange réactionnel de PCR pour chaque échantillon transcription inverse.
  4. Effectuer l'amplification, constitué de 20 cycles de dénaturation (94 ° C pendant 30 sec), annelage (57 ° C pendant 30 s) et extension (68 ° C pendant 10 min).

6. Performance qRT-PCR

  1. Ajouter 10 ul de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul d'ADNc amplifié, 2 nM d'amorces, et 7 ul de l'eau dans chaque puits.
    1. Régler le programme suivi par 95 ° C pendant 3 sec, 60 ° C pendant 30 sec x 40 cycles.
  2. Effectuer en double pour des erreurs techniques.

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Representative Results

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Efficace et robuste simple amplification de l'ARN cellulaire

Pour minimiser la variation de la transcription chez les CSEh, nous avons utilisé OCT4 :: EGFP CSEh clone pour la purification FACS. Après le tri oct4 :: cellules positives à l'EGFP dans une plaque de 96 puits, chaque cellule est lysée dans un tampon de lyse et converti poly (A) + ARN à ADNc pleine longueur à l'aide SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) amorce et d'ancrage avec SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) en utilisant la technologie de commutation de modèle SMART. Les excès oligonucléotides ont été digérés avec réactif ExoSAP-IT, puis suivi par 18-20 cycles d'amplification PCR de l'ADNc avec SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. Nous avons utilisé l'ADNc amplifié pour rendre le modèle de qRT-PCR (Figure 1). Il existe plusieurs études pour le séquençage complet de l'ARN de la longueur et de la mesure de la variabilité de l'ARN en utilisant de faibles quantités de cellules et de cellules individuelles 3, 14, 15. Pour our connaissances, nous dilué ARN total de cellules hES (montants microgrammes) à des niveaux de nano-et pico-grammes et appliqué notre protocole pour évaluer la variabilité technique et la détection de la différence sur de faibles quantités d'ARN total. Nous avons déterminé la reproductibilité dans les niveaux d'expression de gènes générées à partir d'ARN dilué et de cellules individuelles. Analyse de l'ARN dilué montre en série corrélation entre chaque échantillon et les résultats qRT-PCR avec plusieurs cellules individuelles montrent des valeurs similaires Ct dans le gène de la GAPDH (Figure 2).

L'évaluation quantitative des profils génétiques des cellules individuelles

Pour valider la cohérence entre les différents lots de réactions de transcription inverse, nous avons divisé lysats cellulaires simples FACS purifiés en deux et appliqué notre protocole séparément pour chaque moitié de lysats pour les comparaisons de lots. Nous avons trié les cellules positives EGFP fortes en utilisant FACS trieur (figure 3), de sorte que le niveau d'expression de OCT4 était élevé dans EGFPcellules positives, mais le niveau d'expression de NANOG est divers. Le résultat montre une corrélation significative entre la valeur de Ct OCT4 chaque moitié de lysats de cellules uniques (figure 4).

L'analyse des profils de gènes de cellules souches embryonnaires

Nous avons trié les CSEh individuelles et analysé leur niveau d'expression des gènes en utilisant notre protocole, qui indique le niveau d'expression cohérente de OCT4, puis nous sommes arrivés un autre gène NANOG marqueur de cellules souches dans les CSEh. En conséquence, OCT4 niveau d'expression du gène était élevée dans chaque cellule, mais NANOG montre différents motifs (Figure 5).

Figure 1
Figure 1. Vue d'ensemble schématique de cellule souche embryonnaire humaine qRT-PCR après purification FACS.

Figure 2
Figure 2. Temps réel RT-PCR de GAPDH en utilisant l'ARNm dilué en série de cellules groupées souches embryonnaires humaines. Chaque point représente la valeur Ct de la dilution en série de l'ARNm et l'ARNm de la cellule unique triés par FACS. Les ARN totaux ont été dilués de 10 ng / ul de 0,1 pg / ul. Nous avons répété les mêmes expériences de comparaison et fait intrigue linéaire.

Figure 3
Figure 3. Analyse FACS de cellules positives PTOM. Nous avons trié cellule positif EGFP en utilisant un trieur FACS. OCT4 :: EGFP lignée de CSEh rapporteur montre environ 60% EGFP population positif par rapport à la population négatif (B). Nous avons choisi de cellules positives EGFP solides (A).

Figure 4
Figure 4. Comparaison du niveau d'expression du gène dans chaque moitié de lysats de cellules uniques. Pour valider la cohérence entre les différents lots de réactions de transcription et amplification inverse, nous avons classé lysats de cellules individuelles en deux, et appliqué notre protocole pour la comparaison des lots.

Figure 5
Figure 5.60;. Carte chaleur présentation de simple expression génique des cellules souches embryonnaires humaines simple analyse de l'expression génique des cellules purifiées par FACS montre l'expression robuste en OCT4, mais le niveau d'expression différent dans NANOG.

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Discussion

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Seul gène cellulaire profilage pourrait être un outil important pour prédire la fonctionnalité d'une seule cellule ou une population entière. En raison de limitations techniques, toute l'analyse de profilage génétique a été limitée aux moyennes de la population. Variations dans les modes et les niveaux entre les cellules individuelles et les sous-populations expression génique ont été proposés pour entraîner une interprétation erronée. Ces aspects cellulaires diverses peuvent être trouvés dans les CSEh et leur hétérogénéité provoque capacité légèrement différente pour le maintien de la pluripotence et sort processus de spécification.

Nous avons développé et validé pour quantitative de la cellule unique RT-PCR, qui fournit la méthode simple, mais robuste pour l'étude de l'expression des gènes dans des cellules individuelles. Pour valider notre protocole, les lysats de cellule unique FACS purifié a été divisé en deux et appliquées à cette méthode pour le contrôle des précisions. Notre résultat avec des cellules individuelles a été corroboré par d'échantillons d'ARN totaux dilués en série et nous avons trouvé des résultats cohérents bntre chaque moitié de lysat cellulaire (Figure 4). Cependant, avec notre protocole, il ya quelques limitations. Nous pourrions détecter le niveau d'expression de plus de 40 gènes, mais des informations spécifiques de la transcription (par exemple, les ARNm non-polyadénylées, miRNA, transcriptions inconnus, etc) peut ne pas être détectable. En outre, il ya des possibilités d'optimiser les amorces de gènes cibles. La longueur est généralement accepté amorce 18 à 22 paires de bases. Les températures d'hybridation d'amorces fonctionnent généralement dans l'intervalle de 50 à 60 ° C. Le contenu en GC des amorces peuvent être affectés par la capacité d'hybridation de l'amorce. Dans ce papier, nous avons supprimé l'étape de recuit dans qPCR pour réduire l'erreur de l'hybridation des amorces. Nous ne montrons le gène de la GAPDH comme contrôle, mais l'autre maison en gardant les gènes peut être utile en tant que témoin. Actuellement, nous optimisons notre protocole pour l'ARN approche de séquençage, qui va découvrir transcriptome plus détaillée des cellules individuelles isolées dans un avenir proche. L'autre limitation est accuracé de purification FACS pour isoler des cellules uniques. La machine FACS attribue la plupart des cellules individuelles dans chaque puits, mais nous ne pouvons pas exclure la possibilité que chaque puits peut contenir plus d'une cellule, qui peut être compris avec l'avance technique de FACS système de purification. Néanmoins, notre protocole peut être directement applicable à tout laboratoire avec un minimum d'efforts et le coût moyen efficace pour le profilage de l'expression génique unique de cellule.

Comme le montre la Figure 5, OCT4 :: EGFP cellules individuelles positives par FACS triés maintenir le niveau d'expression du gène OCT4 similaire, mais NANOG montré motif d'expression diverse, qui pourrait penser le statut différent de la pluripotence des CSEh ou processus de reprogrammation 1 . On peut profiler une autre expression du gène de la pluripotence dans des cellules individuelles de CSEh à l'aide de différents marqueurs de surface cellulaire, et / ou système de journaliste génétique (NANOG, RE (, SSEA3, ICAM1, CD44 TRA-1-60)X1, STELLA, ESRRB, etc) 5-7 . En utilisant ce protocole, seule l'approche de l'expression des gènes de la cellule est la méthode simple et puissant pour des populations hétérogènes tels que les CSEh ou d'autres types de cellules souches.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plate USA scientific 1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit Life Technologies 4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase Clonetech 639536
ExoSAP-IT USB 78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Invitrogen 11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade Invitrogen 18427
SYBR Universal 2X Master Mix Kapa biosystem KR0389
Accutase Innovative Cell Tech S-1100-1
FACS buffer 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235

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References

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Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G. Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR. J. Vis. Exp. (87), e51408, doi:10.3791/51408 (2014).More

Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G. Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR. J. Vis. Exp. (87), e51408, doi:10.3791/51408 (2014).

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