Summary
Enkel celle genekspresjon assay er nødvendig for forståelse av stamcelle heterogeniteter.
Abstract
Heterogenitet av stamcelle befolkningen vanskelig detaljert forståelse av stamcellebiologi, slik som deres differensiering tilbøyelighet mot forskjellige linjene. En enkelt celle transcriptome analysen kan være en ny tilnærming for å dissekere individuell variasjon. Vi har utviklet en enkel celle QRT-PCR-metoden, og bekreftet at denne metode fungerer bra i flere genekspresjonsprofiler. I celle-nivå, har hvert menneske embryonale stamceller, sortert etter OCT4 :: EGFP positive celler, høy uttrykk i OCT4, men et annet nivå av NANOG uttrykk. Vår enkelt celle genuttrykk analysen bør være nyttig å forhøre befolknings heterogeniteter.
Introduction
De høyere eukaryote populasjoner er heterogene og dermed med analyse av sammenslåtte populasjonen, er det ofte vanskelig å tolke deres cellulære funksjoner. Individuelle celler i en populasjon, kan være litt forskjellig, og disse forskjeller kan ha viktige konsekvenser for egenskapen og funksjonen av hele populasjonen 1, 2. Spesielt er humane embryonale stamceller (hESCs) kjent for å være heterogene, noe som fører til ulike nivåer av pluripotency og ulike potensialer til avstamning spesifikasjon i delikat særegne måter tre, fire. For eksempel kan forskjellige celleoverflateantigener anvendes til å kategorisere udifferensierte pluripotente stamceller, 5 og Austin Smith-gruppen foreslått forskjellige nivåer av pluripotency i mus embryonale stamceller, basert på deres morfologi, differensiering og tilbøyelighet til avhengighet av signalveien 6.. Dette fenomenet ble antatt i menneskelige embryonic stamceller 7. Mens de samlede studiene ble utført blant ulike stamcellelinjer, ikke individuelle enkelt stamceller, kan det være svært interessant å analysere ulike nivåer av pluripotency på celle-nivå, noe som potensielt påvirker deres differensiering kapasiteter mot alle somatiske celle slektslinjer.
Cellulært og molekylært heterogenitet kan bli diktert av transkripsjon profilering, som kalles 'enkelt celle transcriptome' og fremhever nye tilnærminger for å kvantifisere genuttrykk nivåer 8-10. For analyse av genuttrykk nivåer i enkeltceller, har vi utviklet en enkel, men robust protokoll for enkelt celle kvantitativ RT-PCR. Vi bekreftet effekten og gjennomførbarheten av vår protokollen ved å sammenlikne hver halvdel av enkelt cellelysater samt seriefortynnet totale RNA av hESCs, noe som resulterer i minimale tekniske variasjoner og forskjeller. Videre brukte vi en genetisk reporter linje å isolere homogen population av hESCs bruker genet targeting system. Donor vektor for målretting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruere) og et par Talen plasmider ble brukt 11. Donor vektor og et par av talen plasmider ble innført i hESCs (H9, WA09) ved bruk av vår nucleofection og klonal valg protokoll og vedlikehold av hESCs ble utført basert på rutinemessig protokoll 12.. Vi bekreftet denne genetiske reporter Line Express EGFP for OCT4 uttrykk i OCT4 :: EGFP hESCs.
Vårt resultat viser at enkelte hESCs (sortert etter OCT4 :: EGFP sterkt positive celler) holder høye nivåer av OCT4 uttrykk, men ulike nivåer av NANOG uttrykk. Så, bør vår enkelt celle genuttrykk analysen være nyttig å studere befolknings heterogeniteter av pluripotente stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling av en 96-brønns plate
- Bland 1 mL av Single Cell DNase1 til 9 mL Single Cell Lysis Solution.
- Sett på 10 pl blandet løsning i hver brønn av 96-brønners PCR-plate.
2. Løsriving hESCs for FACS Rensing
- Ta OCT4 :: EGFP ES-cellelinje fra 60 mm skål med en ml Accutase i 20 min, ved 37 ° C, som ble nøytralisert med human ES media.
- Forbered cellepopulasjon i en ml FACS-buffer og justere cellen til 1 x 10 6 celler / ml.
- Før celleprøven gjennom et 35 mikrometer celle sil kork.
- Oppbevar rør i isen før celle sortering.
Tre. Lysis av FACS-renset eneste celle i hver brønn på 96-brønns plate
- Sortere prøven for EGFP positive celler på en celle sorter med en trenet operatør. Sett den eneste celle i Single Cell Lysis/DNase1 løsning i 96-brønns PCR plate. Hvis det er nødvendig, den 96-brønns plate med prøven kan bli lagret i en -80 ° C dypfryser mindre enn en måned.
- Inkuber prøvene i 5 min ved RT i cellelyse.
- Legg en mL av stoppløsning for å stoppe lyse reaksjon.
- Inkuber i 2 min ved RT.
4. Revers transkripsjon
- Legg til hver av en 0,5 pl alikvot av 20 mM SMA-T15, SMA-A.
- Tilsett 4 pl 5X buffer, 2 pl DTT, 1 pl revers transkriptase, og 1 ul dNTP til hver brønn.
- Utfør revers transkripsjon i en termosykler.
- Sett termisk program ved 42 ° C x 90 min og inaktivere revers transkriptase ved 85 ° C x 5 min.
5. Amplification
- Tilsett 4 mL av ExoSAP-IT-reagens til hvert revers transkribert prøven.
- Inkuber prøvene ved 37 ° C i 15 min og 80 ° C i 15 min for å inaktivere ExoSAP-IT-reagens.
- Forbered PCR reaksjon blanding with SMA-p2 (2 nM)
- Tilsett 10 pl av PCR-reaksjonsblanding til hver revers transkribert prøven.
- Utfør den forsterkning, som består av 20 sykluser med denaturering (94 ° C i 30 sek), annealing (57 ° C i 30 sek), og forlengelsen (68 ° C i 10 min).
6. QRT-PCR Ytelse
- Tilsett 10 ul av 2X SYBR grønn PCR Master Mix, 1 pl amplifisert cDNA, 2 nM primere, og 7 mL vann til hver brønn.
- Sette programmet etterfulgt av 95 ° C i 3 sekunder, 60 ° C i 30 sek x 40 sykluser.
- Utfør i to eksemplarer for tekniske feil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv og robust enkelt celle RNA forsterkning
For å minimere transkripsjons variasjon blant hESCs, brukte vi OCT4 :: EGFP hESC klone for FACS rensing. Etter sortering Oct4 :: EGFP-positive celler i en 96-brønns plate, er hver celle lysert i lyseringsbuffer og konvertert poly (A) + RNA til full lengde-cDNA ved hjelp av SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer og forankring med SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) ved å bruke SMART mal bytte teknologi. Det overskytende oligonukleotider ble spaltet med ExoSAP-IT-reagens, og deretter etterfulgt av 18 til 20 sykluser med PCR-amplifikasjon av cDNA med SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. Vi brukte amplifisert cDNA for å gjøre mal for QRT-PCR (figur 1). Det er flere studier for full lengde RNA-sekvensering og måling av RNA variasjon ved å bruke små mengder av celler og enkeltceller 3, 14, 15. Å our kunnskap, utvannet vi total RNA av hESCs (mikrogram mengder) ned til nano-og pico-gramnivå og anvendt vår protokoll for å vurdere teknisk variabilitet og påvisning av forskjell på lave mengder av total RNA. Vi har fastslått at reproduserbarhet i genekspresjon nivåer som genereres fra fortynnet RNA og individuelle celler. Analyse av RNA fortynnet serielt viser korrelasjonen mellom hver prøve, og QRT-PCR-resultater med flere enkeltceller viser tilsvar Ct-verdiene i GAPDH-genet (figur 2).
Kvantitativ vurdering av enkeltcelle genet profiler
For å validere konsistens mellom ulike grupper av revers transkripsjon reaksjoner, vi delt FACS-rensede enkle cellelysater i halv og anvendt vår protokoll separat til hver halvdel av lysates for batch sammenligninger. Vi sortert sterke EGFP positive celler ved hjelp av FACS sorter (figur 3), så OCT4 uttrykk nivået var høyt i EGFPpositive celler, men NANOG ekspresjonsnivået er ulike. Resultatet viser signifikant korrelasjon mellom OCT4 Ct-verdien for hver halvdel av enkelt cellelysater (figur 4).
Analyse av embryonale stamcelle genet profiler
Vi sortert individuelle hESCs og analysert deres genuttrykk nivå ved hjelp av vår protokoll, som viser konsistent nivå av OCT4 uttrykk, og da vi sjekket en annen stamcelle markør genet NANOG i hESCs. Som et resultat, OCT4 genekspresjon var høy i hver enkelt celle, men NANOG viser forskjellige mønstre (figur 5).
Figur 1. Skjematisk oversikt over enkelt humane embryonale stamceller QRT-PCR etter FACS rensing.
Figur 2. Sanntid RT-PCR av GAPDH mRNA ved hjelp av seriefortynnet av humane embryonale stamceller. Hvert punkt viser Ct-verdien for seriefortynnet mRNA og enkelt celle mRNA sortert ved FACS. Total RNA ble fortynnet fra 10 ng / pl til 0,1 pg / ul. Vi gjentok samme eksperimentene for sammenligning og gjort lineær tomten.
Figur 3. FACS analyse av oktober positive celler. Vi sortert EGFP positiv celle ved hjelp av en FACS sorter. OCT4 :: EGFP reporter hESC linje viser rundt 60% EGFP positive befolkningen sammenlignet med negativ befolknings (B). Vi valgte sterke EGFP positive celler (A).
Figur 4. Sammenligning av genuttrykk nivå i hver halvdel av single cellelysater. Å validere konsistens mellom ulike grupper av revers transkripsjon og amplifikasjonsreaksjoner, vi delt enkelt cellelysater i to, og anvendt vår protokoll for batch sammenligning.
Figur 5.60;. Varmekart presentasjon av enkelt humane embryonale stamceller genuttrykk Enkelt celle genekspresjonsanalyser renset ved FACS viser robust uttrykk i OCT4, men forskjellig uttrykk nivå i NANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkel celle genet profilering kan være et viktig verktøy for å forutsi funksjonaliteten til en enkelt celle eller et hele populasjonen. På grunn av tekniske begrensninger, har hele genet profilering analyse er begrenset til befolkningsgjennomsnitt. Variasjoner i genutrykksmønster og nivåer mellom de enkelte celler og subpopulasjoner har vært foreslått for å forårsake feilaktig tolkning. Så ulike cellulære aspekter kan bli funnet i hESCs og deres heterogenitet fører til litt forskjellig evne til å opprettholde pluripotency og skjebne spesifikasjonsprosessen.
Vi utviklet og validert for enkelt celle kvantitativ RT-PCR, som gir enkel, men robust metode for genuttrykk studie i enkeltceller. For å validere vår protokoll, ble lysates av FACS-renset enkelt celle delt inn i to og brukt på denne metoden for å sjekke nøyaktigheter. Vårt resultat med enkeltceller ble bekreftet med serielt utvannet total RNA prøver og vi fant konsistente resultater between hver halvdel av cellelysat (figur 4). Men med vår protokoll, er det noen begrensninger. Vi kunne oppdage uttrykk nivå på over 40 gener, men spesifikk transkripsjon informasjon (f.eks ikke-polyadenylerte mRNA, miRNA, ukjente transkripsjoner, etc.) kan ikke være synlig. Også, er det noen muligheter for å optimalisere primere for målgener. Den aksepterte primer lengde er vanligvis 18-22 basepar. Annealing temperaturer på primere som regel arbeide i området fra 50-60 ° C. De GC-innholdet i primeren kan bli påvirket av annealing evne av tennsatsen. I dette papiret, fjernet vi annealing skritt i qPCR for å redusere feil av primer annealing. Vi bare viste GAPDH-genet som en kontroll, men det andre huset holder gener kan være nyttig som en kontroll. For tiden er vi optimalisere vår protokoll for RNA sekvense tilnærming, som vil avdekke mer detaljert transcriptome av isolerte enkeltceller i nær fremtid. Den andre begrensningen er Accuracy av FACS rensing for å isolere enkeltceller. FACS maskin tildeler stort sett enkeltceller i hver brønn, men vi kan ikke utelukke at hver brønn kan inneholde mer enn én celle, som kan bli funnet med teknisk forkant av FACS rensesystem. Likevel kan vår protokoll være direkte relevant for noen lab med minimal innsats og kostnadseffektiv måte for profilering enkelt celle genuttrykk.
Som vist i figur 5, OCT4 :: EGFP positive enkelt-celler ved FACS sortering og opprettholde tilsvarende nivå av OCT4 genekspresjon, men NANOG viste mangfoldig uttrykksmønster, som kan antyder de forskjellige status pluripotency av hESCs eller omprogrammering prosess 1. . Man kan profilere andre pluripotency genuttrykk i enkeltceller av hESCs ved hjelp av ulike markører på celleoverflaten (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44), og / eller genetisk reporter system (NANOG, REX1, STELLA, ESRRB, etc.) 5-7 . Ved å bruke denne protokollen, er enkelt celle genuttrykk tilnærming enkelt og kraftig metode for heterogene populasjoner som hESCs eller andre typer stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmene av Lee lab for verdifulle diskusjoner om manuskriptet. Arbeid i Lee lab ble støttet med tilskudd fra Robertson Investigator Award of New York Stem Cell Foundation og fra Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
