Summary
وهناك حاجة واحدة الجين الخلية التعبير مقايسة لفهم التغاير الخلايا الجذعية.
Abstract
عدم تجانس السكان الخلايا الجذعية يعوق فهم مفصل لبيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل التمايز ميلها نحو الأنساب مختلفة. وحيد الخلية Transcriptome على الفحص يمكن أن يكون نهجا جديدا لتشريح الاختلاف الفردية. قمنا بتطوير خلية واحدة طريقة QRT-PCR، وأكد أن هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد في العديد من ملامح التعبير الجيني. في مستوى خلية واحدة، كل خلية الجذعية الجنينية البشرية، تم الفرز حسب OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP، لديه عالية في التعبير OCT4، ولكن على مستوى مختلف من NANOG التعبير. وينبغي أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لاستجواب التغاير السكان.
Introduction
السكان حقيقي النواة معظم العالي غير متجانسة وبالتالي مع تحليل من سكان المجمعة، غالبا ما يكون من الصعب تفسير خصائصها الخلوية. الخلايا الفردية ضمن مجموعة من السكان قد تكون مختلفة بمهارة، ويمكن لهذه الاختلافات لها عواقب هامة للخاصية وظيفة من إجمالي عدد السكان 1، 2. خاصة، ومن المعروف عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أن تكون غير متجانسة، والذي يسبب مستويات مختلفة من تعدد القدرات والإمكانات المتنوعة لمواصفات النسب في طرق مميزة بدقة 3 و 4. على سبيل المثال، تختلف مستضدات سطح الخلية يمكن استخدامها لتصنيف الخلايا الجذعية المحفزة غير متمايزة، (5) ومجموعة أوستن سميث المقترحة مستويات مختلفة من تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية، استنادا على التشكل، الميل التمايز وتبعية يشير مسار 6. وقد افترض هذه الظاهرة في الجنين البشريالخلايا الجذعية شركة الاستثمارات الوطنية 7. في حين أجريت الدراسات الشاملة بين مختلف خطوط الخلايا الجذعية، وليس الخلايا الجذعية فرد واحد، ويمكن أن تكون مثيرة للغاية لتحليل مستويات مختلفة من تعدد القدرات على مستوى خلية واحدة، والتي يحتمل أن يؤثر على قدرات التمايز تجاه كل الأنساب الخلية الجسدية.
يمكن أملت عدم التجانس الخلوية والجزيئية من خلال التنميط النسخ، وهو ما يسمى 'Transcriptome على خلية واحدة' ويؤكد نهج جديدة لقياس مستويات التعبير الجيني 8-10. لتحليل مستويات التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وضعنا بروتوكولا بسيطة، ولكن قوية من خلية واحدة الكمي RT-PCR. أكدنا على فعالية وجدوى من بروتوكول لدينا من خلال مقارنة كل نصف لست] خلية واحدة، وكذلك مجموع الرنا المخفف متسلسل من hESCs، مما أدى إلى الاختلافات التقنية والحد الأدنى من الخلافات. علاوة على ذلك، استخدمنا خط مراسل الوراثية لعزل ع متجانسةopulation من hESCs باستخدام نظام استهداف الجينات. استخدمت ناقلات المانحة لاستهداف OCT4 موضع (OCT4-2A-EGFP-PGK-بورو بناء) وزوج من البلازميدات TALEN 11. أدخلت ناقلات المانحة وزوج من البلازميدات TALEN في hESCs (H9، WA09) باستخدام لدينا nucleofection وبروتوكول اختيار نسيلي وصيانة أجريت hESCs استنادا لدينا بروتوكول روتين 12. أكدنا هذا الخط مراسل الوراثية التعبير عن EGFP لOCT4 التعبير في OCT4 :: EGFP hESCs.
لدينا نتيجة يدل على أن hESCs الفردية (تم الفرز حسب OCT4 :: EGFP الخلايا إيجابية بقوة) عقد مستويات عالية من OCT4 التعبير، ولكن مستويات مختلفة من NANOG التعبير. لذلك، يجب أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لدراسة التغاير السكان من الخلايا الجذعية المحفزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد اللوحة 96 جيد
- مزيج 1 ميكرولتر من خلية واحدة DNase1 إلى 9 ميكرولتر وحيد الخلية تحلل الحل.
- وضع 10 ميكرولتر حل مختلطة في كل بئر من 96 لوحة جيدا PCR.
2. فصل hESCs لنظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية
- فصل OCT4 :: خط الخلية EGFP ES من 60 ملم صحن مع 1 مل Accutase لمدة 20 دقيقة، عند 37 درجة مئوية، والتي كانت متعادلة مع وسائل الاعلام الإنسان ES.
- إعداد السكان خلية في 1 مل FACS العازلة وضبط خلية إلى 1 × 10 6 خلية / مل.
- تمرير عينة الخلية من خلال مصفاة الخلية 35 ميكرومتر غطاء الأنبوب.
- تخزين أنبوب في الجليد قبل الفرز الخلية.
3. تحلل من نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية خلية واحدة في كل بئر من لوحة 96 جيدا
- فرز عينة للخلايا إيجابية EGFP على فارز الخلية مع المشغل المدربين. وضع خلية واحدة في خلية واحدة Lysis/DNase1 حل في 96 لوحة جيدا PCR. إذا لزم الأمر، و9لوحة 6 جيدا مع عينة يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية التجميد العميق أقل من شهر واحد.
- احتضان العينات 5 دقائق على RT لتحلل الخلية.
- إضافة 1 ميكرولتر من وقف الحل لوقف رد فعل تحلل.
- احتضان 2 دقيقة في RT.
4. عكس النسخ
- إضافة إلى كل قسامة 0.5 ميكرولتر من 20 ميكرومتر SMA-T15، SMA-A.
- إضافة 4 ميكرولتر 5X العازلة، 2 ميكرولتر DTT، 1 ميكرولتر الناسخ العكسي، و 1 ميكرولتر dNTP إلى كل بئر.
- أداء النسخ العكسي في cycler الحرارية.
- ضبط البرنامج الحراري في 42 ° C × 90 دقيقة وتعطيل الناسخ العكسي في 85 ° C × 5 دقائق.
5. التضخيم
- إضافة 4 ميكرولتر من كاشف ExoSAP-IT لكل عكس العينة كتب.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى تعطيل كاشف ExoSAP-IT.
- إعداد PCR مزيج التفاعل ثإيث SMA-P2 (2 نانومتر)
- إضافة 10 ميكرولتر من مزيج PCR رد فعل على عكس كل عينة كتب.
- أداء التضخيم، ويتألف من 20 دورات تمسخ (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، الصلب (57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، والإرشاد (68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة).
6. الأداء QRT-PCR
- إضافة 10 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر ميكس ماجستير PCR، 1 ميكرولتر تضخيم [كدنا]، 2 الاشعال نانومتر، و 7 ميكرولتر المياه إلى كل بئر.
- ضبط البرنامج تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية × 40 دورات.
- أداء في مكررة لأخطاء فنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كفاءة وقوية واحدة تضخيم الحمض النووي الريبي الخلية
لتقليل التباين بين النسخي hESCs، استخدمنا OCT4 :: EGFP HESC استنساخ لتنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد فرز OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP في لوحة 96 جيدا، وهي lysed كل خلية في تحلل العازلة وتحويلها بولي (A) + RNA إلى كامل طول كدنا] باستخدام SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) التمهيدي وترسيخ مع SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) باستخدام التكنولوجيا الذكية قالب التبديل. تم هضم أليغنوكليوتيد الزائدة مع كاشف ExoSAP-IT، ثم تليها 18-20 دورات PCR التضخيم من [كدنا] مع SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. استخدمنا كدنا] تضخيم لجعل قالب لQRT-PCR (الشكل 1). هناك العديد من الدراسات للحصول على كامل طول تسلسل الحمض النووي الريبي وقياس تقلب الحمض النووي الريبي باستخدام كميات منخفضة من الخلايا والخلايا واحد 3 و 14 و 15. إلى سالمعرفة اور، فإننا المخفف الحمض النووي الريبي مجموع من hESCs (كميات ميكروجرام) وصولا الى مستويات النانو وبيكو جرام وتطبيق بروتوكول لدينا لتقييم التباين الفني والكشف عن الفرق على كميات منخفضة من الحمض النووي الريبي مجموع. نحن مصممون على استنساخ في مستويات التعبير الجيني المتولدة من الحمض النووي الريبي والمخفف الخلايا الفردية. تحليل الحمض النووي الريبي المخفف متسلسل يوضح العلاقة بين كل عينة والنتائج QRT-PCR مع العديد من الخلايا واحد إظهار القيم ط مماثلة في GAPDH الجين (الشكل 2).
التقييم الكمي للجينات خلية واحدة لمحات
للتحقق من صحة الاتساق بين دفعات مختلفة من التفاعلات النسخ العكسي، ونحن ينقسم نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقيته-لست] خلية واحدة إلى النصف وتطبيق بروتوكول لدينا بشكل منفصل لكل نصف لست] لمقارنات دفعة واحدة. قمنا بفرز الخلايا EGFP إيجابية قوية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية فارز (الشكل 3)، لذلك كان مستوى OCT4 التعبير عالية في EGFPالخلايا إيجابية، ولكن مستوى NANOG التعبير هو مختلف. نتيجة يظهر ارتباط كبير بين قيمة OCT4 ط كل نصف لست] خلية واحدة (الشكل 4).
تحليل الجينات الجنينية ملامح الخلايا الجذعية
قمنا بفرز hESCs الفردية وتحليل مستوى التعبير الجيني وذلك باستخدام بروتوكول لدينا، مما يدل على مستوى ثابت من OCT4 التعبير، ومن ثم بحثنا علامة الخلية الجذعية NANOG جين آخر في hESCs. ونتيجة لذلك، كان مستوى التعبير الجيني OCT4 عالية في كل خلية واحدة، ولكن NANOG يبين أنماط مختلفة (الشكل 5).
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي واحد من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية QRT-PCR بعد تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية.
الرقم 2. في الوقت الحقيقي RT-PCR من GAPDH باستخدام المخفف متسلسل مرنا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المجمعة. يبين كل نقطة قيمة ط من المخفف متسلسل مرنا ومرنا وحيدة الخلية الفرز حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية. كانت مخففة مجموع الرنا من 10 نانوغرام / أيار إلى 0.1 جزء من الغرام / شباط. كررنا نفس التجارب للمقارنة وجعل مؤامرة الخطية.
الشكل 3. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا إيجابية أكتوبر. نحن فرز الخلايا إيجابية EGFP باستخدام فارز FACS. يظهر OCT4 :: EGFP مراسل خط HESC حوالي 60٪ EGFP إيجابية السكان مقارنة مع عدد السكان السلبية (B). اخترنا الخلايا EGFP إيجابية قوية (A).
الشكل 4. مقارنة بين مستوى التعبير الجيني في كل نصف لست] خلية واحدة. للتحقق من صحة الاتساق بين دفعات مختلفة من النسخ والتضخيم ردود الفعل العكسي، قسمنا لست] خلية واحدة في النصف، وتطبيق بروتوكول لدينا للمقارنة دفعة واحدة.
الرقم 5.60؛. خريطة الحرارة عرض واحد الإنسان الجنينية التعبير الجيني في الخلايا الجذعية واحدة تحليل التعبير الجيني الخلايا تنقيته من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية يظهر التعبير القوي في OCT4، ولكن مستوى التعبير المختلفة في NANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واحد التنميط الجيني الخلايا يمكن أن تكون أداة رئيسية للتنبؤ وظيفة من خلية واحدة أو شعب بأكمله. بسبب قيود تقنية، وقد تم تقييد التحليل التنميط الجيني بأكمله إلى المتوسطات السكان. وقد اقترحت الاختلافات في أنماط التعبير الجيني ومستويات بين الخلايا الفردية والمجموعات السكانية الفرعية للتسبب التفسير الخاطئ. هذه الجوانب الخلوية المتنوعة يمكن العثور عليها في hESCs ويسبب عدم التجانس قدرتها المختلفة بمهارة للحفاظ على تعدد القدرات والمواصفات مصير العملية.
قمنا بتطوير والتحقق من صحتها عن الكمية خلية واحدة RT-PCR، والتي توفر طريقة بسيطة ولكن قوية لدراسة التعبير الجيني في الخلايا الفردية. للتحقق من صحة بروتوكول لدينا، تم تقسيم لست] من خلية واحدة FACS تنقيته-إلى النصف وتطبيق لهذه الطريقة لفحص الدقة. وقد أيد لدينا مع الخلايا نتيجة واحدة مع عينات الحمض النووي الريبي مجموع المخفف متسلسل ووجدنا نتائج متسقة بإلى صف كل شوط من المحللة الخلية (الشكل 4). ومع ذلك، مع بروتوكول لدينا، وهناك عدد قليل من القيود. نحن يمكن الكشف عن مستوى التعبير من أكثر من 40 الجينات، ولكن معلومات محددة النسخ (على سبيل المثال mRNAs وغير مذيل بعديد الأدينيلات، ميرنا، محاضر غير معروف، الخ) قد لا تكون قابلة للكشف. أيضا، هناك بعض الفرص لتحسين الاشعال عن الجينات المستهدفة. طول التمهيدي المقبول هو عادة 18-22 أزواج القاعدة. درجات الحرارة الصلب من الاشعال العمل عموما في حدود 50-60 درجة مئوية. يمكن أن تتأثر محتويات GC من التمهيدي من قدرة الصلب من التمهيدي. في هذه الورقة، ونحن إزالة الخطوة الصلب في QPCR لتقليل الخطأ من التمهيدي الصلب. أظهرنا فقط الجينات GAPDH كعنصر تحكم، ولكن المنزل الأخرى حفظ الجينات يمكن أن تكون مفيدة كمجموعة تحكم. حاليا نحن لدينا بروتوكول الأمثل لنهج التسلسل الحمض النووي الريبي، والتي سوف تكشف Transcriptome على أكثر تفصيلا من الخلايا وحيدة معزولة في المستقبل القريب. الحد الآخر هو المركز الثقافيمفعم بالحيوية من تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل الخلايا واحد. آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية يخصص معظمها الخلايا واحد في كل بئر، ولكن لا يمكننا استبعاد احتمال أن كل بئر قد تحتوي على أكثر من خلية واحدة، والتي يمكن أن أحسب مع التقدم التقني لنظام لتنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية. ومع ذلك، يمكن أن يكون لدينا بروتوكول تنطبق مباشرة على أي مختبر مع الحد الأدنى من الجهود وتكلف سيلة فعالة لالتنميط واحدة التعبير الجيني الخلية.
كما هو مبين في الشكل 5، OCT4 :: EGFP الخلايا واحد الإيجابية التي FACS فرزها حفاظ على مستوى مماثل من التعبير OCT4 الجينات، ولكن أظهرت NANOG نمط التعبير المتنوعة، الأمر الذي يوحي القوة حالة مختلفة من تعدد القدرات من hESCs أو عملية إعادة برمجة 1 . يمكن للمرء أن ملف تعدد القدرات الأخرى التعبير الجيني في الخلايا واحد من hESCs استخدام مختلف علامات سطح الخلية (TRA-1-60، SSEA3، ICAM1، CD44)، و / أو نظام مراسل الوراثية (NANOG، REX1، STELLA، ESRRB، الخ) 5-7 . باستخدام هذا البروتوكول، ونهج واحد التعبير الجيني الخلية هي طريقة سهلة وقوية بالنسبة للسكان غير متجانسة مثل hESCs أو أنواع أخرى من الخلايا الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
