Summary
Enkelt celle genekspression analyse er nødvendig for at forstå stamcelle heterogene.
Abstract
Heterogenitet stamceller befolkning hæmmer detaljeret forståelse af stamceller biologi, såsom deres differentiering tilbøjelighed mod forskellige slægter. En enkelt celle transkriptom assay kan være en ny metode til dissekering individuel variation. Vi har udviklet enkelt celle QRT-PCR-metode, og bekræftede, at denne metode fungerer godt i flere genekspressionsprofiler. I enkelt celle niveau, hver humane embryonale stamceller, sorteret efter OCT4 :: EGFP positive celler, har høj udtryk i OCT4, men et andet niveau af NANOG udtryk. Vores enkelt celle genekspression analyse skal være nyttigt at afhøre befolkningsgrupper heterogeniteter.
Introduction
De fleste højere eukaryote befolkninger er heterogene således med analyse af de samlede befolkning, er det ofte vanskeligt at fortolke deres cellulære funktioner. Individuelle celler i en population kan være subtilt anderledes, og disse forskelle kan have vigtige konsekvenser for ejendommen og funktion af hele befolkningen 1, 2. Især er humane embryonale stamceller (hESCs) kendt for at være heterogen, hvilket forårsager forskellige pluripotency og forskellige potentialer til afstamning specifikation delikat særprægede måder 3, 4. For eksempel kan forskellige celleoverfladeantigener anvendes til at kategorisere udifferentierede pluripotente stamceller, 5 og Austin Smith gruppe foreslået forskellige niveauer af pluripotency i muse embryonale stamceller, baseret på deres morfologi, differentiering tilbøjelighed og afhængigheden af signalvejen 6. Dette fænomen blev hypotese i menneskelige embryonic stamceller 7. Mens de samlede undersøgelser blev udført mellem forskellige stamcellelinjer, ikke individuelle enkelt stamceller, kunne det være meget spændende at analysere forskellige niveauer af pluripotency på enkelt celle niveau, som potentielt påvirker deres differentiering kapacitet mod alle somatiske cellelinier.
Cellulære og molekylære heterogenitet kan være dikteret af transskription profilering, som kaldes 'enkelt celle transkriptom' og understreger nye tilgange til kvantificering genekspressionsniveauer 8-10. Til analyse af genekspressionsniveauer i individuelle celler, har vi udviklet en simpel, men robust protokol enkelt celle kvantitativ RT-PCR. Vi bekræftede effekten af og muligheden for vores protokol ved at sammenligne hver halvdel af enkelt cellelysater samt seriefortyndede totale RNA'er af hESCs, hvilket resulterer i minimal tekniske variationer og forskelle. Desuden brugte vi en genetisk reporter linje at isolere homogen population af hESCs bruger gene targeting system. Donoren vektor til målretning OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruere) og et par af talen plasmider blev anvendt 11. Den donorvektoren og et par Talen plasmider blev indført i hESCs (H9, WA09) ved hjælp af vores nucleofection og klonselektion protokol og vedligeholdelse af hESCs blev udført baseret på vores rutine protokol 12. Vi bekræftede denne genetiske reporter linje udtrykker EGFP for OCT4 udtryk i OCT4 :: EGFP hESCs.
Vores resultat viser, at individuelle hESCs (sorteret efter OCT4 :: EGFP stærkt positive celler) holder høje niveauer af OCT4 udtryk, men forskellige niveauer af NANOG udtryk. Så skal vores enkelt celle genekspression assay være nyttigt at studere befolkningsgrupper heterogeniteter af pluripotente stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af en 96-brønds plade
- Bland 1 ml af Single Cell DNase1 til 9 pi Single Cell Lysis Solution.
- Sætte 10 ul blandede opløsning i hver brønd af 96-brønds PCR-plade.
2.. Aftagning hESCs for FACS Oprensning
- Frigør OCT4 :: EGFP ES cellelinje fra 60 mm skål med 1 ml Accutase i 20 minutter ved 37 ° C, hvilket blev neutraliseret med humane ES-medier.
- Forbered cellepopulation i 1 ml FACS buffer og justere cellen til 1 x 10 6 celler / ml.
- Celleprøven passere gennem en 35 um cellefilter cap rør.
- Opbevar glasset i is før celle sortering.
3.. Lyse af FACS-oprensede Single Cell i hver brønd af 96-brønds plade
- Sortere prøven til EGFP positive celler på en celle sorteringsanlæg med en uddannet operatør. Sæt enkelt celle i Single Cell Lysis/DNase1 opløsning i 96-brønds PCR-plade. Hvis det er nødvendigt, den 9.6-brønds plade med prøven kan opbevares i en -80 ° C fryser mindre end en måned.
- Inkuber prøverne i 5 min ved stuetemperatur i cellelyse.
- Tilsæt 1 ul Stop løsning til at stoppe lysis reaktion.
- Inkuber 2 minutter ved stuetemperatur.
4.. Revers transkription
- Tilføj til hver en 0,5 gl portion på 20 uM SMA-T15, SMA-A.
- Tilsæt 4 ul 5X buffer, 2 pi DTT, 1 pi revers transkriptase, og 1 pi dNTP til hver brønd.
- Udfør revers transkription i en termisk cycler.
- Indstil det termiske program ved 42 ° C × 90 min inaktivere revers transkriptase ved 85 ° C x 5 min.
5.. Amplification
- Tilsæt 4 ul ExoSAP-IT reagens til hver reverse transkriberet prøve.
- Inkuber prøverne ved 37 ° C i 15 min og 80 ° C i 15 min for at inaktivere ExoSAP-IT reagens.
- Forbered PCR wed SMA-p2 (2 nM)
- Der tilsættes 10 ul af PCR-reaktionsblanding til hver reverse transkriberet prøve.
- Udfør forstærkning, bestående af 20 cyklusser af denaturering (94 ° C i 30 sek), annealing (57 ° C i 30 sekunder) og forlængelse (68 ° C i 10 min.)
6.. QRT-PCR ydeevne
- Tilsæt 10 ul 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 gl forstærkes cDNA, 2 nm primere og 7 pi vand til hver brønd.
- Indstille programmet efterfulgt af 95 ° C i 3 sekunder, 60 ° C i 30 sek x 40 cyklusser.
- Udfør i to eksemplarer for tekniske fejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv og robust enkelt celle RNA forstærkning
For at minimere den transkriptionelle variation blandt hESCs, vi brugte OCT4 :: EGFP embryonale klon for FACS oprensning. Efter sortering OCT4 :: EGFP-positive celler i en 96-brønds plade, er hver celle lyseret i lysisbuffer og omdannes poly (A) + RNA til cDNA i fuld længde ved hjælp af SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT)-primer og forankring med SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) ved hjælp af SMART skabelon switching teknologi. De overskydende oligonukleotider blev fordøjet med ExoSAP-IT reagens efterfølges af 18-20 cyklusser af PCR-amplifikation af cDNA med SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13.. Vi anvendte det amplificerede cDNA til at skabelon for QRT-PCR (figur 1). Der er flere undersøgelser, for fuld længde RNA sekventering og måling af RNA variabilitet ved hjælp af små mængder af celler og enkelte celler 3, 14, 15. Til our viden, vi fortyndet total RNA af hESCs (mikrogrammængder) ned til nano-og pico-gram niveauer og anvendt vores protokol for at vurdere teknisk variation og detektion af forskel på lave mængder af total RNA. Vi bestemt reproducerbarhed i genekspression niveauer genereret fra fortyndet RNA og de enkelte celler. Analyse af den fortyndede RNA viser serielt korrelationen mellem hver prøve og QRT-PCR-resultater med flere enkelte celler viser lignende Ct-værdier i GAPDH-genet (figur 2).
Kvantitativ vurdering af de enkelte celle gen-profiler
For at validere sammenhængen mellem forskellige partier af revers transkription reaktioner, vi delt FACS-oprensede enkelt cellelysater i halve og anvendt vores protokol separat til hver halvdel af lysater til batch sammenligninger. Vi sorteret stærke EGFP-positive celler ved anvendelse af FACS sorteringsanlæg (figur 3), så OCT4 ekspression var højt i EGFPpositive celler, men NANOG ekspressionsniveau er forskellige. Resultatet viser signifikant korrelation mellem OCT4 Ct-værdi af hver halvdel af enkelt cellelysater (figur 4).
Analyse af embryonale stamceller gen-profiler
Vi sorteres individuelle hESCs og analyseret deres genekspression niveau ved hjælp af vores protokol, som viser ensartet OCT4 udtryk, og så har vi tjekket en anden stamcelle markør gen NANOG i hESCs. Som et resultat, OCT4 genekspression var højt i hver enkelt celle, men NANOG viser forskellige mønstre (figur 5).
Figur 1.. Skematisk oversigt over enkelt humane embryonale stamceller qRT-PCR efter FACS rensning.
Figur 2.. Real-time RT-PCR af GAPDH hjælp seriefortyndes mRNA af poolede humane embryonale stamceller. Hver prik viser Ct værdien af seriefortyndes mRNA og enkelt celle mRNA sorteres ved FACS. Totale RNA'er blev fortyndet fra 10 ng / ul til 0,1 pg / ul. Vi gentog samme forsøg til sammenligning og gjort lineær plot.
Fig. 3. FACS-analyse af oktober positive celler. Vi sorteret EGFP positive celler ved hjælp af en FACS sorter. OCT4 :: EGFP reporter embryonale linje viser omkring 60% EGFP positive population sammenlignet med negativt population (B). Vi valgte stærke EGFP positive celler (A).
Figur 4.. Sammenligning af genekspression niveau i hver halvdel af enlige cellelysater. At validere sammenhængen mellem forskellige partier af revers transkription og amplificeringsreaktioner, vi delt single cellelysater i halve, og anvendt vores protokol til batch sammenligning.
Figur 5.60;. Zonekort præsentation af enkelt humane embryonale stamceller genekspression Enkelt celle genekspressionsanalyse renses ved FACS viser robust udtryk i OCT4, men forskellige udtryk niveau i NANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkelt celle gen profilering kunne være et vigtigt redskab til at forudsige funktionalitet en enkelt celle eller en hel befolkning. På grund af tekniske begrænsninger, har helt gen profilanalyse været begrænset til befolkningens gennemsnit. Variationer i genekspression mønstre og niveauer mellem de enkelte celler og subpopulationerne er blevet foreslået at forårsage fejlagtig fortolkning. Så forskellige cellulære aspekter kan findes i hESCs og deres forskelligartethed bevirker subtilt anderledes evne til at opretholde pluripotency og skæbne specifikation proces.
Vi udviklet og valideret til enkelt-celle kvantitativ RT-PCR, som giver enkel, men robust metode til genekspression studie i de enkelte celler. For at validere vores protokol, blev lysater af FACS-oprensede enkelt celle opdelt i halve og anvendt denne metode til kontrol af nøjagtighed. Vores resultat med enkelte celler blev bekræftet med seriefortyndede samlede RNA-prøver og vi fandt konsistente resultater between hver halvdel af cellelysat (figur 4). Men med vores protokol, der er et par begrænsninger. Vi kunne detektere udtryk niveau af over 40 gener, men specifik transskription oplysninger (f.eks ikke polyadenylerede mRNA'er, miRNA, ukendte udskrifter osv.) må ikke kunne påvises. Der er også nogle muligheder for at optimere primere til målgener. De accepterede primer længde er normalt 18 til 22 basepar. De udglødningstemperaturer primere generelt arbejder i intervallet 50-60 ° C. GC-indholdet af primer kan påvirkes af annealing evne primeren. I dette papir, vi fjernede annealingstrinnet i qPCR at reducere fejl primerannealing. Vi viste kun GAPDH-genet som en kontrol, men det andet hus holde gener kan være nyttig som en kontrol. I øjeblikket er vi optimerer vores protokol for RNA sekventering tilgang, som vil afdække mere detaljerede transkriptom af isolerede enkelte celler i nær fremtid. Den anden begrænsning er accutighed på FACS oprensning for at isolere de enkelte celler. FACS maskine meste tildeler enkelte celler i hver brønd, men vi kan ikke udelukke muligheden for, at hver brønd kan indeholde mere end én celle, der kan være regnet med teknisk forud for FACS rensning system. Ikke desto mindre kan vores protokol direkte anvendelse på enhver laboratorium med minimal indsats og omkostningseffektiv måde til profilering enkelt celle genekspression.
Som vist i figur 5, OCT4 :: EGFP positive enkelte celler ved sorterede FACS opretholde tilsvarende niveau for OCT4 genekspression, men NANOG viste forskelligartede udtryk mønster, hvilket kan foreslår forskellige status af pluripotency af hESCs eller omprogrammering proces 1 . Man kan profilere andre pluripotency genekspression i enkelte celler fra hESCs ved hjælp af forskellige celleoverflademarkører (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44), og / eller genetiske reporter-system (NANOG, REX1, Stella, ESRRB osv.) 5-7 . Ved at bruge denne protokol, enkelt celle genekspression tilgang er nem og effektiv metode til heterogene populationer såsom hESCs eller andre typer af stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Lee laboratorium til værdifulde diskussioner om manuskriptet. Arbejdet i Lee lab blev støttet af tilskud fra Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation og fra Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
