Summary
Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.
Abstract
A heterogeneidade da população de células-tronco dificulta compreensão detalhada da biologia de células-tronco, tais como a sua propensão para a diferenciação diferentes linhagens. Um ensaio de transcriptoma única célula pode ser uma nova abordagem para dissecar variação individual. Desenvolvemos o método de uma única célula de qRT-PCR, e confirmaram que o método funciona bem em vários perfis de expressão de gene. Em nível de uma única célula, cada célula-tronco embrionárias humanas, classificado por OCT4 :: células positivas EGFP, tem alta expressão no OCT4, mas um nível diferente de expressão NANOG. Nosso ensaio de expressão único gene da célula deve ser útil para interrogar heterogeneidades da população.
Introduction
Populações eucariotos maioria superiores são heterogêneos, assim, com a análise da amostragem populacional, muitas vezes é difícil de interpretar as suas características celulares. As células individuais dentro de uma população pode ser sutilmente diferente, e essas diferenças podem ter consequências importantes para a propriedade ea função de toda a população 1, 2. Especialmente, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são conhecidos por ser heterogêneo, o que provoca diferentes níveis de pluripotência e diversas potencialidades para especificação das linhagens em delicadamente e distintas formas 3, 4. Por exemplo, os antigénios de superfície de células diferentes podem ser usados para classificar as células estaminais pluripotentes indiferenciadas, 5 e o grupo Austin Smith propostos diferentes níveis de pluripotência em mastócitos embrionários de ratinho, com base na sua morfologia, propensão diferenciação e dependência da via de sinalização 6. Este fenômeno foi levantada a hipótese de embrião humanoAs células estaminais nic 7. Considerando que os estudos gerais foram realizadas entre as diferentes linhas de células estaminais, e não células-tronco único indivíduo, que poderia ser muito interessante para analisar diferentes níveis de pluripotência no nível da célula única, o que potencialmente afeta as suas capacidades de diferenciação em relação a todas as linhagens de células somáticas.
Heterogeneidade celular e molecular pode ser ditada pela transcrição de perfil, que é chamado de 'transcriptoma única célula' e destaca novas abordagens para quantificar os níveis de expressão do gene 8-10. Para a análise dos níveis de expressão de genes em células individuais, foi desenvolvido um protocolo simples, mas robusta de uma única célula RT-PCR quantitativo. Foi confirmada a eficácia e viabilidade do nosso protocolo, comparando cada metade de lisados de células individuais, bem como RNAs totais diluídas em série de hESCs, resultando em variações técnicas mínimas e diferenças. Além disso, foi utilizada uma linha repórter genética para isolar homogênea população de hESCs utilizando sistema de metas de gene. O vector dador de segmentação OCT4 lócus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construção) e um par de plasmídeos talen foram usadas 11. O vetor doador e um par de plasmídeos Talen foram introduzidos hESCs (H9, WA09) usando nosso nucleofection e protocolo de seleção clonal e manutenção de hESCs foi realizada com base no nosso protocolo de rotina 12. Nós confirmamos esta linha repórter genética expressar EGFP para a expressão OCT4 em OCT4 :: EGFP hESCs.
Nosso resultado demonstra que hESCs individuais (classificadas por OCT4 :: EGFP células fortemente positivas) manter altos níveis de expressão OCT4, mas diferentes níveis de expressão NANOG. Então, o nosso ensaio de expressão único gene de células deve ser útil para estudar as heterogeneidades da população de células-tronco pluripotentes.
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Protocol
1. Preparação de uma placa de 96 poços
- Misture 1 ml de Single Cell DNase1 a 9 mL Single Cell Lysis Solution.
- Coloque a solução mista de 10 mL em cada poço da placa de 96 poços de PCR.
2. Detaching hESCs para FACS Purificação
- Separar OCT4 :: linha de células ES a partir de EGFP o prato de 60 mm e 1 ml de Accutase durante 20 min, a 37 ° C, as quais foram neutralizadas com meio ES humano.
- Prepare a população de células em 1 ml de tampão de FACS e ajustar o celular para 1 x 10 6 células / ml.
- Passar a amostra de células através de um coador de células de 35 mM tampão tubo.
- Armazenar o tubo em gelo antes de separação de células.
3. Lise de FACS purificado célula única em cada poço da placa de 96 poços
- Classificar a amostra para células positivas EGFP em um classificador de células com um operador treinado. Coloque a única célula em solução Lysis/DNase1 única célula em placa de 96 poços PCR. Se necessário, a 96 poços da placa com a amostra pode ser armazenada num congelador a -80 ° C de profundidade inferior a um mês.
- Incubar as amostras 5 min à temperatura ambiente para a lise celular.
- Adicionar 1 ml de solução de paragem para parar reação de lise.
- Incubar 2 min à temperatura ambiente.
4. Transcrição reversa
- Adicione a cada uma alíquota de 0,5 mL de 20 mM SMA-T15, SMA-A.
- Adicionar tampão 4 uL de 5X, 2 uL de DTT, 1 ul de transcriptase reversa, e 1 ul de dNTP em cada poço.
- Realizar a transcrição reversa num termociclador.
- Definir o programa térmico a 42 ° C x 90 min e inactivar transcriptase reversa a 85 ° C x 5 min.
5. Amplificação
- Adicionar 4 mL de reagente ExoSAP-IT para cada amostra transcrita reverter.
- Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min e 80 ° C durante 15 min para inactivar o reagente ExoSAP-IT.
- Preparar a mistura de reacção de PCR wom SMA-p2 (2 nM)
- Adicionam-se 10 ul de mistura de reacção de PCR para cada uma das amostras de transcrição reversa.
- Realizar a amplificação, consistindo em 20 ciclos de desnaturação (94 ° C durante 30 seg), emparelhamento (57 ° C durante 30 seg) e extensão (68 ° C durante 10 min).
6. Desempenho de qRT-PCR
- Adicionar 10 ul de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul de amplificado de ADNc, os iniciadores 2 nM, e 7 mL de água a cada poço.
- Definir o programa seguido por 95 ° C durante 3 seg, 60 ° C durante 30 seg x 40 ciclos.
- Realiza-se em duplicado por erros técnicos.
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Representative Results
Amplificação de RNA única célula eficiente e robusta
Para minimizar a variação transcricional entre hESCs, usamos OCT4 :: EGFP hESC clone para FACS purificação. Após a separação de células positivas Oct4 :: EGFP em uma placa de 96 poços, cada célula é lisadas em tampão de lise e convertido poli (A) + RNA para cDNA de comprimento completo utilizando o SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) e iniciador de ancoragem com o SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) usando a tecnologia Smart modelo de comutação. Os oligonucleótidos foram digeridas com excesso de reagente ExoSAP-IT, seguida por 18-20 ciclos de amplificação por PCR de cDNA com o SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. Utilizou-se o ADNc amplificado para fazer o molde de qRT-PCR (Figura 1). Existem vários estudos para o pleno seqüenciamento RNA comprimento e medição da variabilidade da RNA usando baixas quantidades de células e células individuais 3, 14, 15. Para our conhecimento, diluído RNA total de hESCs (valores microgramas) para níveis nano e pico-gram e aplicado nosso protocolo para avaliar a variabilidade técnica e detecção de diferença em baixas quantidades de RNA total. Foi determinada a reprodutibilidade dos níveis de expressão de genes gerados a partir de RNA diluído e as células individuais. Análise do ARN diluída serialmente mostra correlação entre cada uma das amostras e os resultados de qRT-PCR com várias células individuais mostram os valores de Ct semelhantes no gene GAPDH (Figura 2).
Avaliação quantitativa de perfis único gene celular
Para validar a consistência entre diferentes lotes de reações de transcrição reversa, dividimos lisados unicelulares FACS purificadas em metade, e aplicado o nosso protocolo separadamente para cada metade de lisados para comparações de lote. Nós classificados células positivas para EGFP fortes usando FACS classificador (Figura 3), de modo nível de expressão OCT4 foi elevada em EGFPcélulas positivas, mas o nível de expressão NANOG é vária. O resultado mostra correlação significativa entre o valor de Ct OCT4 de cada metade de lisados de células individuais (Figura 4).
Análise de perfis de genes de células-tronco embrionárias
Separamos hESCs individuais e analisaram seu nível de expressão de genes usando o nosso protocolo, que mostra o nível consistente de expressão OCT4, em seguida, fizemos o check outro NANOG gene marcador de células-tronco em hESCs. Como resultado, o nível de expressão do gene OCT4 foi elevada em todas as células, mas NANOG mostra diferentes padrões (Figura 5).
Figura 1. Visão esquemática de única célula-tronco embrionária humana qRT-PCR após FACS purificação.
Figura 2. Em tempo real de RT-PCR de GAPDH utilizando diluída em série de mRNA de células estaminais embrionárias humanas reunidas. Cada ponto mostra o valor Ct do ARNm diluídos em série e de ARNm de célula única classificadas por FACS. Os ARNs totais foram diluídos a partir de 10 ng / ul de 0,1 pg / ul. Repetimos mesmos experimentos para a comparação e enredo linear feita.
A Figura 3. Análise FACS de células positivas outubro. Nós classificados célula positiva EGFP usando um classificador de SCAF. OCT4 :: EGFP linha de células estaminais embrionárias humanas repórter mostra população positiva de cerca de 60% em comparação com a população de EGFP negativo (B). Nós selecionamos fortes células positivas EGFP (A).
Figura 4. Comparação do nível de expressão de genes em cada metade de lisados de células individuais. Para validar a consistência entre lotes diferentes da transcrição reversa e de amplificação de reacções, dividiu-se os lisados de células individuais em meio e aplicadas nosso protocolo para comparação de lotes.
Figura 5.60;. Análise de expressão gênica de células mapa de calor apresentação da expressão do gene de células-tronco embrionárias humanas Individual purificado por FACS mostra a expressão robusta em OCT4, mas diferentes níveis de expressão em NANOG.
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Discussion
Profiling gene célula única pode ser uma ferramenta importante para prever a funcionalidade de uma única célula ou uma população inteira. Devido a uma limitação técnica, análise de perfis gene inteiro tenha sido restrita às médias populacionais. As variações nos padrões de expressão dos genes e os níveis de entre as células individuais e as subpopulações foram propostos para fazer com que a interpretação errada. Tais aspectos celulares diferentes podem ser encontrados em hESCs e sua heterogeneidade faz com que a capacidade sutilmente diferente para a manutenção de pluripotência e processo de especificação destino.
Foi desenvolvido e validado para quantitativa única célula de RT-PCR, o que proporciona um método simples, mas robusta para estudar a expressão de genes em células individuais. Para validar o nosso protocolo, lisados de célula única FACS-purificada foi dividido em metade e aplicada a este método para verificar precisões. Nosso resultado com células individuais foi corroborada com amostras de RNA total diluídas em série e encontramos resultados consistentes bntre cada metade de lisado de células (Figura 4). No entanto, com o nosso protocolo, existem algumas limitações. Podemos detectar o nível de expressão de mais de 40 genes, mas informações específicas de transcrição (por exemplo, mRNAs não poliadenilados, miRNA, transcrições desconhecidos, etc) pode não ser detectável. Além disso, existem algumas oportunidades para otimizar os primers para os genes-alvo. O comprimento cartilha aceito é geralmente 18-22 pares de bases. As temperaturas de emparelhamento de primers trabalham geralmente na gama de 50-60 ° C. O conteúdo de GC dos iniciadores pode ser afectada pela capacidade de hibridação do iniciador. Neste trabalho, nós removemos a etapa de recozimento em qPCR para reduzir o erro de primer recozimento. Nós apenas mostrou o gene GAPDH como um controlo, mas o outro house keeping genes pode ser útil como um controlo. Atualmente, estamos otimizando nosso protocolo para RNA abordagem de seqüenciamento, que vai descobrir transcriptoma mais detalhada das células individuais isoladas no futuro próximo. A outra limitação é accuatrevido da FACS purificação para isolar células individuais. Máquina FACS principalmente aloca células individuais em cada poço, mas não podemos excluir a possibilidade de que cada poço pode conter mais de uma célula, que pode ser descoberto com o avanço técnico de sistema de purificação de FACS. No entanto, o nosso protocolo pode ser diretamente aplicável a qualquer laboratório com esforços mínimos e rentável forma de perfis de expressão gênica de células individuais.
Como mostrado na Figura 5, OCT4 :: EGFP células individuais positivas por FACS classificadas manter nível similar de expressão do gene OCT4, mas NANOG mostrou diversificada padrão de expressão, o que pode sugere o status diferente de pluripotência de hESCs ou processo de reprogramação 1 . Pode-se outro perfil de expressão gênica em células de pluripotência únicas de hESCs utilizando diferentes marcadores de superfície celular (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44) e / ou sistema de repórter genética (NANOG, REX1, STELLA, ESRRB, etc) 5-7 . Ao utilizar este protocolo, a abordagem única expressão génica em células é um método fácil e poderosa para populações heterogêneas, como hESCs ou outros tipos de células-tronco.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Lee pelas valiosas discussões sobre o manuscrito. Trabalho no laboratório Lee foi apoiada por doações de Robertson Investigator Award of New York Stem Cell Foundation e de Maryland Stem Cell Research Fund (Tedco).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
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