Summary
単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。
Abstract
幹細胞集団の不均一性は、異なる系統に向けてその分化の傾向として、幹細胞生物学の詳細な理解を妨げる。単一細胞トランスクリプトーアッセイは、個人差を解剖するための新しいアプローチすることができます。我々は、単一細胞のqRT-PCR法を開発し、この方法は、いくつかの遺伝子発現プロファイルにうまく機能することを確認した。単一細胞レベルでは、OCT4並び順各ヒト胚性幹細胞、:: EGFP陽性細胞は、OCT4高発現であるが、NANOGの発現の異なるレベルを有する。我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、不均質集団に質問するのに有用であるべきである。
Introduction
ほとんどの高等真核生物の個体数は、プールされた人口の分析をこのように不均一であり、それはそれらの細胞の機能を解釈することは困難であることが多い。集団内の個々の細胞は微妙に異なっていてもよく、これらの違いは、全人口1,2の性質及び機能に重要な影響を有することができる。特に、ヒト胚性幹細胞（hESC）は微妙に独特のやり方3、4系統の仕様に多能性と多様な電位の異なるレベルを引き起こす、不均一であることが知られている。例えば、異なる細胞表面抗原は、未分化の多能性幹細胞を分類するために使用することができ、5オースティンスミス基は、それらの形態、分化傾向と経路6シグナルの依存性をもとにして、マウス胚性幹細胞における多能性の異なるレベルを提案した。この現象は、ヒト胚に仮定されたnicの幹細胞を7。全体的な研究は、異なる幹細胞株ではなく、個々の単一の幹細胞の中で行われたのに対し、それは潜在的に全ての体細胞系統に向かって分化能力に影響を与える単一細胞レベルで多能性の異なるレベルを分析することは非常に興味深いかもしれない。
細胞および分子不均一性は、 '単一細胞トランスクリプトーム」と呼ばれる、転写プロファイリングによって決定し、遺伝子発現レベルを8月10日を定量化するための新しいアプローチを強調している可能性があります。個々の細胞における遺伝子発現レベルの分析のために、我々は、単一細胞の定量的RT-PCRの、単純で堅牢なプロトコルを開発した。我々は最小限の技術的変動および相違点で、その結果、各単一細胞溶解物の半分だけでなく、ヒトES細胞の段階希釈した全RNAを比較することによって、我々のプロトコルの有効性と実現可能性を確認した。さらに、我々は均質なPを分離するために遺伝的レポーターラインを使用ジーンターゲッティングシステムを使用してhESCのopulation。 OCT4遺伝子座（OCT4-2A-EGFP-PGK-ピューロ構築物）およびTALENプラスミドの対を標的化するためのドナーベクター11を使用した。ドナーベクターとTALENプラスミドのペアは、私たちのクレオを使用してヒトES細胞（H9、WA09）に導入し、ヒトES細胞のクローン選択プロトコルおよびメンテナンスは私たちの日常的プロトコル12に基づいて実施された。我々は、この遺伝的レポーターラインは、OCT4にOCT4発現のために、EGFPを表現:: EGFPのhESCを確認した。
私たちの結果は（OCT4によって並べ替え:: EGFP強陽性細胞）は、個々のヒトES細胞は、OCT-4の発現レベルが高いが、Nanog発現の異なるレベルを保持することを実証している。したがって、我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、多能性幹細胞の集団の不均一性を研究するのに有用であるべきである。
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Protocol
96ウェルプレートの1の調製
- 9μlの単一細胞溶解溶液に単セルDNase1の1μLを混ぜる。
- 96ウェルPCRプレートの各ウェルに10μlの混合溶液を入れた。
FACS精製のために2。の切り離したhESC
- ヒトESメディアで中和し、37℃で20分間、1ミリリットルをAccutase 60 mmディッシュ、、からOCT4 :: EGFP ES細胞株を取り外します。
- FACS緩衝液1ml中に細胞集団を調製し、1×10 6細胞/ mlに細胞を調節する。
- 35μmのセルストレーナーキャップチューブを介して細胞試料を渡す。
- 細胞選別の前に氷の中にチューブに保管してください。
96ウェルプレートの各ウェルにおけるFACS精製した単一細胞の3。溶解
- 訓練されたオペレータとのセルソーターにEGFP陽性細胞のためのサンプルをソートします。 96ウェルPCRプレートの単一のセルLysis/DNase1液に単一のセルを置く。必要に応じて、9サンプル6ウェルプレートは一月未満-80℃の冷凍庫に保存することができる。
- 細胞溶解を室温でサンプルを5分間インキュベート。
- 溶解反応を停止させる停止溶液1μLを加える。
- 室温で2分間インキュベートする。
4。逆転写
- 20μMのSMA-T15、SMA-Aの各0.5μlのアリコートに追加します。
- 各ウェルに4μL5Xバッファー、2μlのDTT、1μL逆転写酵素、および1μlのdNTPを追加します。
- サーマルサイクラーに逆転写を行う。
- 90分×42℃の熱プログラムを設定し、85℃×5分で逆転写酵素を不活性化する。
5。増幅
- 各逆転写されたサンプルにExoSAP-IT試薬4を添加する。
- ExoSAP-IT試薬を不活性化する15分間、15分間および80℃で、37℃でサンプルをインキュベートする。
- PCR反応混合物Wを準備するSMA-P2（2 nM）のi番目
- 各逆転写されたサンプルにPCR反応混合物10μlを追加します。
- 変性の20サイクル（30秒94°C）からなる増幅を行う、アニーリング（30秒、57°C）、及び（10分間68°C）伸長。
6。定量RT-PCR性能
- 各ウェルに2倍のSYBR Green PCRマスターミックス、1μLの増幅したcDNA、2 nMのプライマー、および7μlの水を10μlを加える。
- ×40サイクル30秒、3秒、95℃に続いて、プログラムを設定し、60℃。
- 技術的なエラーのために二重に行う。
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Representative Results
効率的かつ堅牢な単一細胞RNA増幅
ヒトES細胞の中で転写変動を最小限に抑えるために、我々は、OCT4を使用:: FACS精製用のEGFPのhESCクローン。 SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）プライマーを用いてSMA-A（ACATGTATCCGGATGTGGGで固定96ウェルプレートにOCT4 :: EGFP陽性細胞を選別した後、各細胞を溶解緩衝液で溶解し、完全長cDNAにポリ（A）+ RNAに変換）SMARTテンプレートスイッチング技術を用いることによって。過剰オリゴヌクレオチドは、SMA-P2とのcDNAのPCR増幅（GACATGTATCCGGATGT）13の18〜20サイクル行った後、ExoSAP-IT試薬で消化し た。我々は定量RT-PCRの鋳型（ 図1）を作成するために増幅されたcDNAを使用していました。細胞の低量および単細胞3、図14、図15を用いて、完全長RNA配列決定およびRNAの変動を測定するためのいくつかの研究がある。 OへURの知識は、我々は、ナノとピコグラムレベルまでhESCの全RNA（マイクログラム量）で希釈し、全RNAの低量に差の技術的変動および検出を評価するために我々のプロトコルを適用した。我々は、希釈されたRNAおよび個々の細胞から生成された遺伝子発現レベルにおける再現性を決定した。希釈されたRNAの分析は、直列に各サンプル間の相関を示し、いくつかの単一細胞とのqRT-PCRの結果はGAPDH遺伝子における類似のCt値（ 図2）を示す。
単一細胞の遺伝子プロフィールの定量的評価
逆転写反応の異なるバッチ間の整合性を検証するために、我々は半分に、FACS精製した単一細胞溶解物を分割し、バッチ比較のための溶解物の各半分に別々に我々のプロトコルを適用した。我々は、FACS分取器（ 図3）を使用して強力なEGFP陽性細胞をソートし、これOCT4発現レベルは、EGFPに高かった陽性細胞が、NANOGの発現レベルは、様々である。結果は、単一の細胞溶解物の各半分（ 図4）のOCT4 Ct値との間の有意な相関を示す。
胚性幹細胞の遺伝子プロフィールの分析
我々は、個々のヒトES細胞を選別し、OCT4発現の一貫したレベルを示す我々のプロトコルを使用して、それらの遺伝子発現レベルを分析し、その後、我々は、hESCの別の幹細胞マーカー遺伝子NANOGをチェックした。その結果、OCT4遺伝子の発現レベルは、すべての単一の細胞において高かったが、NANOGは異なるパターン（ 図5）を示す。
図1。のFACS精製後の単一のヒト胚性幹細胞定量RT-PCR法の概略図。
図2 GAPDHのリアルタイムRT-PCRプールしたヒト胚性幹細胞の連続希釈したmRNAを用いて、各点は、連続的に希釈したmRNAおよびFACSによってソート単一細胞mRNAのCt値を示す。全RNAを10 ngの/ ULから0.1 PG / ULに希釈した。私たちは、比較と作ら線形プロットに同じ実験を繰り返した。
図3。10月陽性細胞のFACS分析。我々は、FACS選別機を使用することにより、EGFP陽性細胞を並べ替え。OCT4 :: EGFPレポーターのhESCラインが陰性集団（B）と比較して約60％のEGFP陽性集団を示している。我々は、強力な、EGFP陽性細胞（A）を選択した。
図4単一細胞溶解物の各半分における遺伝子発現レベルの比較。逆転写および増幅反応の異なるバッチ間の一貫性を検証するために、我々は半分に単一細胞溶解物を分割し、バッチ比較のために我々のプロトコルを適用した。
図5。60; FACSによって精製し、単一のヒト胚性幹細胞遺伝子発現のヒートマップ提示単一細胞の遺伝子発現解析は、OCT4において強い発現を示すが、NANOGの異なる発現レベル。
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Discussion
単一細胞遺伝子プロファイリングは、単一のセルまたは集団全体の機能性を予測するための主要なツールである可能性があります。技術的な制限により、全遺伝子プロファイリング解析は、人口の平均値に制限されています。個々の細胞亜集団との間の遺伝子発現パターンおよびレベルの変動は、誤った解釈を引き起こすことが提案されている。このような多様な細胞の側面はヒトES細胞で見つけることができますし、その異質性は多分化能と運命特定処理を維持するための微妙に異なる能力を引き起こします。
我々は開発し、個々の細胞における遺伝子発現の研究のために、単純でロバストな方法を提供する単一細胞の定量的RT-PCRのための検証。我々のプロトコルを検証するために、FACS精製した単一細胞の溶解物を半分に分け、精度をチェックするためにこの方法を適用した。単セルとの結果が連続的に希釈し、全RNAサンプルで確証された、我々は一貫性のある結果bを発見etween細胞溶解物の各半分（ 図4）。しかし、我々のプロトコルで、いくつかの制限があります。検出できない場合があり、我々は40以上の遺伝子の発現レベルが、特異的な転写情報（ 例えば非ポリアデニル化mRNAは、miRNAを、未知の転写産物など）を検出することができた。また、標的遺伝子のためのプライマーを最適化するためのいくつかの機会がある。可プライマーの長さは、通常18〜22塩基対である。プライマーのアニーリング温度は、一般に50〜60℃の範囲で働くプライマーのGC含量は、プライマーのアニーリング能力によって影響され得る。本論文では、プライマーアニーリングの誤差を低減するために定量PCRでのアニール工程を削除しました。私たちは、コントロールとしてGAPDH遺伝子を示したが、他のハウスキーピング遺伝子は対照として有用であり得る。現在、我々は近い将来に単離された単一細胞のより詳細なトランスクリプトームを明らかにします、RNAの塩基配列決定法のために我々のプロトコルを最適化している。その他の制限は、正確である単一細胞を単離するためのFACS精製の際どい。 FACSマシンは、主に各ウェルに単細胞を割り当てるが、我々は、各ウェルがFACS浄化システムの技術的進歩に把握することができる複数のセルを含むことができるという可能性を排除することはできない。それにもかかわらず、我々のプロトコルは、最小限の労力で任意の研究室に直接適用することが、単一細胞の遺伝子発現プロファイリングのための効果的な方法を要することができる。
図5に示すように、ソートされたFACSによるOCT4 :: EGFP陽性の単一細胞は、OCT4遺伝子発現の同様のレベルを維持するが、NANOGは全力をヒトES細胞やリプログラミング過程の多能性の異なるステータスを示唆している多様な発現パターン、示した1 。一つは、異なる細胞表面マーカー（TRA-1-60、SSEA3、ICAM1、CD44）、および/または遺伝的レポーター系（NANOG、REを用いてヒトES細胞の単一細胞における他の多能性遺伝子発現のプロファイルを作成することができX1、ステラ、ESRRBなど） 5-7 。このプロトコルを使用して、単一細胞の遺伝子発現のアプローチは、ヒトES細胞または幹細胞の他のタイプの不均一な集団のための簡単で強力な方法である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、原稿上で貴重な議論のためにイ·ラボのメンバーに感謝したいと思います。李研究室での作業は、細胞研究基金（TEDCO）を幹ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン研究者賞からメリーランド州からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
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