Summary
Fremgangsmåte for kvantifisering av nøytrofil adhesjon er rapportert. Denne metoden gir et dynamisk strømningsmiljø lik den som er oppstått i et blodkar. Den tillater undersøkelse av neutrofil adhesjon til enten renset adhesjonsmolekyler (ligand) eller endotelial celle substrat (HUVEC) i en forbindelse som ligner på den in vivo miljø med ren stress.
Abstract
Nøytrofile firmaet vedheft til endotelceller spiller en avgjørende rolle i betennelse i både helse og sykdom. Prosessen med nøytrofil fast adhesjon involverer mange forskjellige adhesjonsmolekyler, inkludert medlemmer av β 2 integrin familie og deres mot-reseptorer av ICAM-familien. Nylig, naturlig forekommende genetiske varianter i både β 2 inte og ICAMs er rapportert å være assosiert med autoimmune sykdommer. Således er den kvantitative klebekapasiteten av neutrofiler fra individer med forskjellige alleliske former av disse adhesjonsmolekyler viktig å studere i forhold til mekanismene bak utviklingen av autoimmunitet. Vedheft studier i strømningskammersystemer kan skape et miljø med væske skjærspenning lik den som ble observert i blodåren miljø in vivo. Her presenterer vi en fremgangsmåte ved bruk av en strømningskammeret bestemmelsessystem for å studere de kvantitative adhesive egenskaper til humant perifert blod nøytrofils til human umbilical vene endotel-celler (HUVEC) og rensede ligand substrater. Med denne metoden kan de nøytrofile selvklebende kapasiteter fra givere med ulike allele varianter i adhesjonsreseptorer bli vurdert og sammenlignet. Denne metoden kan også bli modifisert for å vurdere adhesjonen av andre primære celletype eller cellelinjer.
Introduction
Genetiske varianter i begge β 2 integriner, og i ICAM-ligander er nå kjent for å være assosiert med utvikling av autoimmune sykdommer 1,2. Bestemmelsen av de funksjonelle konsekvenser av disse variantene i celler som stammer fra individer med disse variantene er nødvendig for forståelsen av hvordan disse variantene bidrar til autoimmun sykdom patogenesen. Slike funksjonelle studier gir mulighet for bestemmelse av de mekanismer som naturlig forekommende genetiske varianter forme immunrespons i både helse og sykdom. I den konkrete eksempel på SLE, vet vi nå at varianter i ITGAM (CD11b) og dens ligand, ICAM-1, sterkt forbinder med utvikling av sykdom 1,2. Fordi nøytrofile er kritiske i betennelsesreaksjoner, kan den kvantitative studien av nøytrofile vedheft gi mekanistisk innsikt i hvordan genetiske varianter i ITGAM / ICAM endre betennelse.
NeutropHil fast vedheft til endotelceller (EC) er en svært regulert prosess, og spiller en viktig rolle i inflammatoriske responser 3,4. Firmaet vedheft av nøytrofile følger innledende nøytrofile rullende og fangst på EC og til slutt kan resultere i sjele in vivo. Disse prosesser involverer flere forskjellige adhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1, ICAM-2, P-selektin, E-selektin i endotelceller, og β 2 integriner på nøytrofile 5-9. Dermed vil imidlertid kvantifisering av nøytrofil adhesjon fra donorer med forskjellige alleliske varianter av adhesjonsmolekyler være viktig for å forstå de funksjonelle og patologiske konsekvenser av disse genetiske varianter.
Eksperimentell bruk av en strømningskammeret kan skape en in vitro miljø med fluidskjærspenning lik den som er observert i blodkaret miljøet in vivo 10-12. Faktisk, et strømningskammer assay kombinert med human navlestrengcal vene endotelceller (HUVEC) kan etterligne in vivo miljøet på en blodåre. Ved hjelp av denne metoden, kan man studere de generelle cellulære selvklebende egenskaper mot endotelceller. I tillegg gjør den svært kontrollert miljø av strømningskammeret også vurdering av cellebinding til renset adhesjons-ligander slik som ICAM-1 for å forenkle studiet av spesifikke reseptor-ligand interaksjoner.
Her presenteres en metode for å benytte en strømningskammeret adhesjon bestemmelsessystem for å studere de adhesive egenskaper av humane perifere blodneutrofiler til HUVEC og rensede ligand substrater. Ved hjelp av denne metoden med celler fra givere som uttrykker ulike adhesjonsmolekylekspresjon allele varianter tillater oss å vurdere hvordan disse genetiske variantene kan endre menneskelig nøytrofile firmaet vedheft.
Protocol
Alle givere rekruttert til denne studien ga skriftlig informert samtykke og studien ble godkjent av University of Alabama i Birmingham Institutional Review Board.
En. HUVEC Initial Kultur og subkultur
- Kultur human umbilical vene endotel-celler (HUVEC) in vitro i fullstendig vekstmedium som består av endotelcelle basalmedium (se liste over materialer) supplert med endotel-cellevekstfaktorer.
Merk: De vekstfaktorer benyttet i denne studien er: 5 ng / ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (hEGF), 1,0 mg / ml hydrokortison, 50 mg / ml gentamicin og 50 ng / ml amfotericin-B (GA-1000), 2 % kalvefosterserum (FBS), 0,5 ng / ml, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), 10 ng / ml human fibroblast vekstfaktor-Basic med heparin (hFGF-B), 20 ng / ml humant rekombinant insulin-lignende vekstfaktor ( R3-IGF-1), 1 ug / ml askorbinsyre, og 22,5 ug / ml heparin. Den komplette mediumfremstilles først ved 37 ° C og kan deretter lagres ved 4 ° C til bruk innen 1 måned etter tilberedning. - For å fremstille en kolbe for cellene, er komplett vekstmedium tilsatt til en 75 cm2 vevskultur-kolbe (1 ml / 5 cm 2) og kolben tillatt å ekvilibrere til 37 ° C / 5% CO2 i en fuktig inkubator i minst 30 min. Humant HUVEC blir sådd direkte inn i denne ekvilibrert kulturkolbe med en tetthet på 2,500-5,000 celler / cm 2.
- Mens media er equilibrating, raskt tine lager HUVEC cryovial i et 37 ° C vannbad. Disperse cellene i den opprinnelige lagrings ampulle ved virvling og deretter legge dem direkte til kulturkolbe inneholdende den pre-ekvilibrert HUVEC komplett vekstmedium for å oppnå en densitet på 2,500-5,000 celler / cm 2. Rist flasken for å fordele cellene og deretter returnere flasken til inkubatoren. Disse cellene representerer nå den 1. passering. <li> Medium bør endres hver to dager før cellene er 70-80% konfluent.
- Den HUVECs kan nå høstes fra dyrkningskolben med trypsin / EDTA. Det dyrkningsmedium suges fra kulturflasker, etterfulgt av en skylling PBS for å fjerne eventuelt gjenværende protein-og kalsium fra cellene. 0,25% Trypsin-EDTA-løsning tilsettes, og i løpet av 2-6 min celle løsgjøring bør være innlysende, vurdert ved lysmikroskopi.
- Da 90% av cellene er avrundet opp av platen, stopp trypsinering ved å tilsette et likt volum av 2x trypsin inhibitor. For å lette innhøstingen av cellene, legge til en annen lik mengde komplett vekstmedium. Overfør de løsnede celler til et sterilt 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger de løsnede celler ved 225 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten, og resuspender cellene i 2-3 ml komplett vekstmedium. Bestem cellekonsentrasjon og levedyktighet ved hjelp av et hemacytometer og Trypan blå.
- For å utnytte the høstet celler for undersøkelse, re-frø ytterligere 75 cm 2 kolber med celler ved en tetthet på 10.000 celler / cm 2 og fortsett med trinn 2.2. Alternativt kan cellene fryses ved dette punkt for fremtidige studier. For celle frysing, pelletere cellene ved sentrifugering ved 225 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer av supernatanten og cellepelleten suspenderes i FBS inneholdende 10% DMSO ved en konsentrasjon på 1 x 10 til 6 celler / ml. Cellesuspensjonen blir deretter overført til cryovials og lagret ved -80 ° C etter frysing av cellene i et celleinnfrysningskar.
2. HUVEC Layer Forberedelse
- Bruk av frosne 2 nd passasje HUVECs: vekkelse og kultur. Hvis du bruker aktivt voksende celler, fortsett til trinn 2.2.
- Tine cryovial inneholdende 2 nd passasje HUVECs fra trinn 1.8 raskt i et 37 ° C vannbad. Overfør celler fra cryovial til en 15 ml sterilt sentrifugerør og tilsett 10 ml vekst medium.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min ved romtemperatur og suge supernatant for å fjerne gjenværende DMSO.
- Resuspender cellepelleten med komplett vekstmedium og overføre cellene til en 75 cm2 kolbe. Legg vekstmedium til et totalvolum ca 20-25 ml og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2.
- Visuelt undersøke cellekultur for samløpet hver dag med medie endringer hver dag. Vanligvis i løpet av 2-4 dager, vil cellene når 80-90% sammenløp ved hvilket tidspunkt de vil være klar til bruk i strømningskammeret analysen.
- For å fremstille dyrkningsskål som vil bli brukt i strømningskammeret (se seksjon 5), tilsett 1 ml 10 pg / ml fibronectin og 0,05% (w / v) gelatin til en 35 mm vevskultur fatet og pipette flere ganger for å gjøre at hele platen overflaten er belagt. Fjern dreven fibronektin-og gelatin-løsning og luft tørke platen i minst 30 min for å optimalisere proteinmatriks formasjonen. Den fibronectin og gelatin løsning kan brukes om igjen opptil 10x.
- Høste HUVEC-celler fra trinn 2.2 ved hjelp av trypsin-EDTA som beskrevet i trinn 1.5 til 1.7. Seed 500 000 celler i hvert belagt vev kultur parabolen. Legg 2 ml vekstmedium i hver tallerken og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO 2.
- Tillat celler til å vokse til konfluens som i trinn 2.2. Cellene skal inspiseres visuelt daglig med middels endringer hver dag. Før strømningskammeret assay prime HUVEC med 20 ng / ml humant TNF-α i 4-6 timer for å oppregulere og stimulere adhesjonsmolekylekspresjon.
Tre. Renset Ligand Coating
- Tegn en sirkel med 0,5 cm diameter med en markør eller pennen midt på en 35 mm vevskultur fatet.
- Plate 20 pl av 20 pg / ml protein A i den markerte området. Bruk pipettespissen å fordele protein A-løsning for å dekke hele området innenfor 0,5 cm diameter sirkel. Det er viktig å ikke ta på eller riper i overflaten på dish. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Vask de protein-A belagte plate 3x med 1 ml PBS (pH 8,0).
- Plate 50 ul 1% BSA i det merkede området for å blokkere ikke-spesifikk binding på plate. Inkuber i 2 timer ved 4 ° C.
- Vask de blokkerte plate 3x med 1 ml PBS som i trinn 3.3.
- Forbered Fc-adhesjonsreseptor ligand kimære protein løsninger for belegg. I dette forsøk, en ICAM-1/Fc chimera-løsning ved 25 pg / ml og en P-Selectin/Fc chimera 0.5 ug / ml i PBS (pH 8,0) ble anvendt.
- Smør merket område med 50 pl av underlaget. Inkuber over natten ved 4 ° C. Retten bør brukes innen to dager og belagt området bør ikke få lov til å tørke ut. Legg PBS om nødvendig for å opprettholde den 50 ul løsning på platen.
4. Neutrofil Separation (Alle trinnene utført ved romtemperatur)
- Etter innhenting av informert samtykke, samle deltaker blod ved blodprøvetaking i enn antikoagulerende blodprøverøret eller vacutainer (EDTA eller heparin). Etter blodprøvetaking, fortynne blodet 1:01 med PBS før separasjon.
- Forbered en to lags Ficoll for å separere PBMC og nøytrofile i 50 ml sentrifugerør. Først legge 15 ml tung Ficoll (se liste over materialer, ρ = 1,118 til 1,120), og deretter nøye lag 10 ml lys Ficoll (se liste over materialer, ρ = 1,077 til 1,080) på toppen av den tunge Ficoll. Det bør være en skarp grense mellom lyset Ficoll og tunge ficoll lag. Til slutt forsiktig lag 25 ml av den fortynnede blodprøven på toppen av lyset Ficoll uten å forstyrre den Ficoll lag.
- Sentrifuger røret ved 250 xg i 30 min ved romtemperatur. Merk: sentrifugerotor bremsen må slås av ved disse spinn for å minimalisere potensiell forstyrrelse av celleseparasjon under rotor retardasjon ved slutten av sentrifugeringen. Etter sentrifugering, er følgende lag (fra topp til bunn) er tilstede: den øverste laget er plasma følwed av PBMC-lag på toppen av lys Ficoll-lag, er det nøytrofile sjikt med noen røde blodceller (RBC) mellom de lette og tunge Ficoll etterfulgt av den tunge Ficoll sjiktet og RBC-er i bunnen av røret.
- Harvest og overføre nøytrofile sjikt til et nytt 50 ml rør med et overføringspipetten, tilsett PBS til et sluttvolum på 50 ml og sentrifugert ved 225 xg i 10 min ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering, kan det fortsatt være RBCs blandet med nøytrofiler. Aspirer supernatanten ned til 10 ml merket. Resuspender nøytrofil-RBC-pellet ved forsiktig omrøring av røret (eller en kort lav hastighet virvling), og deretter vaskes på nytt med 50 ml PBS.
- Etter den andre vask, suge supernatanten. For å fjerne de forurensende RBCs, resuspender den pelleterte celler i den gjenværende PBS ved omrøring (eller kort virvling), tilsett 25 ml H2O og forsiktig vortex i 10 sek for å lysere RBC.
- Tilsett 25 ml av 1,8% NaCl og umiddelbart blandesved sentrifugering ved 225 xg i 10 min ved romtemperatur. Den forurensende RBC skal nå lysert og etterlot et hvitt neutrofil cellepelleten.
- Vask nøytrofile cellen pellet med PBS.
- Resuspender de isolerte neutrofiler i RPMI medium med 10% FBS og bestemme cellekonsentrasjonen under lett mikroskop med et hemocytometer.
- Juster celletetthet på 500 000 celler / ml med komplett RPMI-10% FBS-medium.
5. Flow Chamber Adhesion analysen
- Monter flyten kammeret. Plasser 35 mm fatet inneholder konfluente HUVECs eller renset vedheft reseptorligander på mikroskopet bordet. Koble parallell plate flyt kammer med sprøytepumpe, vakuumsystem og la en linje åpen for nøytrofile innspill. Sett i strømningskammeret på toppen av platen og festes strømningskammermontasjen 13.. (Se figur 1)
- Start videoopptaksprogrammet på datamaskinen som er koblet to mikroskopet. Juster-feltet og fokusering av mikroskopet inntil en klar felt med fullt utvokste HUVEC-celler eller et felt innenfor ligand belegg region er synlig.
- Ved hjelp av sprøytepumpen, skyll flyten kammer med RPMI medium. Pass på at det ikke er luftbobler i kammeret eller nøytrofile linjeinngang.
- Om ønsket kan de nøytrofile primes med lav dose (10 -8 M) fMLP i 10 min. Dette vil gi rom for en matchende av basalnivået nøytrofile aktivering mellom ulike givere 14.
- Bruk sprøytepumpe for å injisere de nøytrofiler inn i strømningskammeret ved definerte hastighet (en hastighet på 350 mL / min, hvilket tilsvarer en skjærspenning på 1,5 dyn / cm 2 er brukt i denne studien). Spille inn video. Fordi nøytrofile vedheft kan skje raskt, er vanligvis tilstrekkelig til å kvantifisere vedheft hendelser for analyse en video med en lengde på 4-5 min.
- En heftende celle er definert som en celle som beveger seg under en cellediameterinnen 5 sek på HUVEC eller ligand belagt overflate 15,16. Tell antall adherente celler i felten til stede i det innspilte video ved hjelp av denne regelen. Ved å ta opp lignende lengde videoer med ulike givernes nøytrofile, kan man beregne tilhenger celler / min for å sammenligne vedheft egenskaper mellom ulike givere.
Representative Results
Eksempler på neutrofil binding til et renset ligand (ICAM-1/P-Selectin) belagt strømningskammeret (figur 2) eller av neutrofil binding til et HUVEC belagt strømningskammeret analysen (figur 3) er vist. Som vist på figurene, nøytrofile fortsette å akkumulere / følge den belagte overflate eller HUVEC under betingelser med kontinuerlig strømning. Under våre typiske eksperimentforholdene, kan vi observere 50-70 menneskelige nøytrofile fast med belagt overflate eller HUVEC løpet av en fire-minutters opptaksperiode. Men allele varianter av nøytrofile adhesjonsmolekyler eller allele varianter i underlaget (renset ligand eller HUVEC), kan vesentlig endre kvantitativ nøytrofile vedheft 14.
Vi har også vurdert den tiden avhengighet av nøytrofile vedheft hendelser observert i våre studier. Mens vi å opprettholde konstant strømningsforhold, er det mulig at de adhesive egenskaper av cellene endres over tid. Hsom fører til, i løpet av de relativt korte tids kurs i våre studier, har vi ikke observere noen konsistente forskjeller i frekvensen av vedheft over tid. For eksempel vurdere vedheft på 1-2 minutters tidspoeng i forhold til vedheft observert mellom 3-4 min tidspunkter er ikke konsekvent annerledes. Selvfølgelig, hvis celler blir stimulert under adhesjonen eksperimentet, endres deretter i adhesive egenskaper over tid kunne forventes.
I våre studier har vi kontrollert for isolasjon indusert nøytrofile aktivering ved forsettlig grunning cellene med lav dose fMLP (10 -8 M) for 10 min før for å studere. Endotelceller (HUVEC i våre studier) krever også før aktivering å oppregulere adhesjonsmolekylekspresjon for optimal leucocyte firmaet vedheft. I fravær av pre-behandling, vil endotelceller (HUVECs) støtter svært lite nøytrofile vedheft. I våre studier har vi brukt 10 ng / ml TNF behandling for 4-6 timer før bruk. IL-1β (10 ng / ml), og LPS (0,5-1 ug / ml) kan også brukes til å pre-aktiveres de endotelcellene. Viktigere, kan ubehandlet HUVEC anvendes som negativ kontroll for å sikre at celleadhesjon er forårsaket av spesifikke (reseptor-mediert) nøytrofil-endotel-celle interaksjoner. Alternativt kan anti-reseptor-antistoffer kan brukes for å blokkere spesifikke reseptorer for å vurdere spesifisiteten til adhesjon.
Figur 1. Flow kammer konfigurasjon på mikroskopet scenen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
. Figur 2 Skjermbilder fra en prøve video av nøytrofile fulgte en politikk ICAM-1/P-Selectin belagte overflaten på ulike tidspunkter (A: 0 tidspunkt, B: 1 min tidspunkt, C: 2 min tidspunkt, og D: 4 min tidspunkt). Konsentrasjonen av ICAM-1 er 25 ug / ml, og P-selektin er 0,5 mikrogram / ml. Neutrofil strømningshastighet på 350 mL / min med nøytrofil tetthet på 500.000 celler / ml.
. Figur 3 Skjermbilder fra en prøve video av nøytrofile man følger HUVEC belagte overflaten ved ulike tidspunkt (A: 0 tidspunkt, B: 1 min tid punkt, C: 2 min tid punkt, og D: 4 min tidspunkt).Neutrofil strømningshastighet på 350 mL / ml med nøytrofil tetthet på 500.000 celler / ml.
| Arter | Beliggenhet | Skjærspenning (dynes / cm 2) |
| Menneskelig | Felles caroid arterie | 11.6 |
| Menneskelig | Branchial arterie | 6.5 |
| Menneskelig | Felles lårarterie | 4,3 |
| Menneskelig | Suprarenal aorta | 7.3 |
| Menneskelig | Supraceliac aorta | 4.2 |
| Menneskelig | Overflatisk fermoral arterie | 4.4 |
| Menneskelig | Venules | 0,5-5,0 |
| Menneskelig | Retinal første arterioler | 40,2 |
| Menneskelig | Retinal andre arterioles | 0.001 |
| Menneskelig | Retinal første venules | 23.2 |
| Menneskelig | Retinal andre venules | 0,43 |
| Dog | Felles caroid arterie | 15.8 |
| Kanin | Felles caroid arterie | 23,3 |
| Rat | Felles caroid arterie | 46,6 |
| Mus | Felles caroid arterie | 64,8 |
| Dog | Felles lårarterie | 9.8 |
| Kanin | Felles lårarterie | 156.8 |
| Rat | Felles lårarterie | 65.9 |
Tabell 1. Sample skjærspenning i ulike organer og ulike arter.
* Oppsummert fra referanser 13, 16, 19, og 20..
Discussion
Denne protokollen guider separasjon og isolering av minimalt aktiverte nøytrofile for den forsiktig kvantifisering av nøytrofile vedheft henhold stupbratte stress forhold. Neutrofil adhesjon er en kritisk prosess i inflammasjon. Fordi genetiske varianter i flere molekyler i denne prosessen har vist seg å disponere for utvikling av autoimmune sykdommer 1,2, er et bestemmelsessystem i stand til kvantitativt å vurdere human neutrofil fast adhesjon kreves. Fremgangsmåten som beskrives i denne protokollen tillater forsiktig og kvantitativ bestemmelse av den faste klebe potensialet av nøytrofiler på en kontrollert in vitro miljø under flor stress. Denne metoden gir dermed direkte sammenligning av kvantitative nøytrofile vedheft mellom genotypede individer å fastslå betydningen av genetisk variasjon i adhesjonsmolekyler 14.
Flere trinn i denne metoden fortjener nøye overveielse på å oppnåe svært kvantitative og reproduserbare resultater. I HUVEC preparat, er det avgjørende å oppnå 100% celleløpet før de brukes i strømningskammeret. For ved hjelp av flater belagt med renset ligand, bør substratet beleggområdet aldri tillates å tørke ut for å unngå denaturering av ligand. I tillegg er fremstillingen av humane nøytrofiler kritisk for suksess for forsøket. Viktige problemer i å isolere neutrofiler fra blodet omfatter forsiktig håndtering ved å minimalisere virvling for å unngå aktivering, å holde cellene ved romtemperatur (dvs. blodet ikke skal lagres på is og sentrifugeringsfremgangsmåten bør bli utført ved romtemperatur) og fullføre isolasjonen og eksperimentet i minst mulig tid som mulig. Det er ytterligere neutrofil isoleringsmetoder, som også kan utnyttes for å forberede celler for disse assays 17,18.
Fra et praktisk perspektiv, vedheft analyser ved hjelp nylig isolerte humane nøytrofile skal påbegynnes innen 3-6 timer etter deltaker blodprøvetaking. Som neutrofiler er ekstremt følsomme for håndtering, kan forlengede tider mellom blodprøvetaking og bruk påvirker analyseresultatene. Nøye bestemmelse av nøytrofile celler konsentrasjon før strømningskammeret assay er også nødvendig for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater.
I strømningskammeret analysen, er det viktig å overvåke videoopptak nøye for å sikre at strømningshastigheten er jevn og det er ingen turbulens i hele lengden av forsøket. Endringer i strømningshastighet eller tilstedeværelse av turbulens ville nødvendiggjøre at forsøket gjentas. Etter eksperimentet, er det også viktig å vurdere de resterende nøytrofile mikroskopisk for å sikre at de nøytrofile celler ikke klumper. Klumping på dette tidspunkt skulle tilsi at de nøytrofile celler er blitt aktivert som i betydelig grad kan forandre nøytrofile tetthet i løpet av eksperimentet.
innhold "> Strømningskammeret skaper en tilnærmet homogen ren stress i kammeret (τ = 6Qμ / (wh 2), hvor Q = strømningshastighet, μ = dynamisk viskositet, og w = bredden av strømningskammeret, h = høyden av strømningskammeret 15). I våre undersøkelser har vi brukt en strømningshastighet på 350 mL / minutt for neutrofil adhesjon, noe som skaper en ren belastning på 1,5 dyn / cm 2 (b = 0,25 cm, H = 0,01 tommer, viskositeten av vann ved 37 ° C (0,007 poise) ble anvendt som en tilnærming av viskositeten av RMPI media). For en bestemt strømningskammeret, kan man endre strømningshastigheten for å oppnå forskjellige nivåer av ren belastning for å etterligne forskjellige fysiologiske tilstander. Typisk fysiologisk skjærspenning i humane blodårer kan varierer mellom 0,5-5,0 dynes / cm 13,16. Skjærspenning i andre blodårer og andre dyr ble oppført i tabell 1 113,16,19 20.Mens vår metode har fokusert på studiet av vedheft av menneskelig neutrophils, er denne metoden ikke er begrenset til neutrofiler og kan lett anvendes på adhesjon eller rullende studier av andre celletyper med enkle modifikasjoner. Dessuten kan substratene i denne metoden endres for forskjellige formål.
Selv om denne protokollen er lett å tilpasse til ulike studier, er det noen begrensninger. Protokollen som gjennomføres her krever stort antall primære celler for analyse. Dette kan være til hinder for analyse av primære celler fra små dyr. I tillegg kan behovet for å immobilisere rensede adhesjons-ligander i et aktivt / tilgjengelig konformasjon begrense omfanget av ligander. Anvendelse av Fc-fusjonsproteiner i stor grad forbedrer mulighetene for å oppnå korrekt ligand konformasjon på plate overflaten. Ikke desto mindre, har vår metode betydelig fleksibilitet til å tillate kvantitativ analyse av adhesjons-arrangementer. Disse studiene vil i stor grad øke vår forståelse av adhesjons-reseptor-ligand-par, og den potensielle funksjon betydningen av genetiske varianteri disse proteiner, i patogenesen av menneskelige sykdommer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er sponset av Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 og NIH UL1-TR00165. Vi takker Dr. Robert P. Kimberly for sin fortsatte støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
