Summary
방법은 식물 추출물의 박층 크로마토 그래피 (TLC) 분리 및 항균 대사 물질을 식별하는 접촉 bioautography에 대해 설명합니다. 방법은 소의 반추위 네이티브 하이퍼 암모니아를 생산하는 박테리아 (HAB)를 억제 레드 클로버 페놀 화합물의 심사에 적용됩니다.
Abstract
식물 항균 화합물의 일반적인 화면 (예를 들어 곰팡이 또는 세균 국물이나 한천), 미생물에 대한 시간이 성장 할 수 있도록 미생물 현탁액에 크로마토 그램을 노출, 종이 또는 얇은 층 크로마토 그래피 (PC 또는 TLC)에 의해 식물 추출물을 분리 구성 다습 한 환경, 알 수없는 미생물의 성장 영역을 시각화. bioautography로 알려진이 검사 방법의 효과는, 크로마토 그래피 분리의 품질과 미생물의 배양 조건과 함께 찍은 치료 모두에 따라 달라집니다. 이 논문은 산 발효 세균을 아미노산하는 새로운 응용 프로그램과 TLC와 접촉 bioautography을위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 추출물은 유연한 (알루미늄 백업) 실리카 TLC 판에서 분리하고, 밴드는 자외선 (UV) 빛 아래에서 시각입니다. 영역은 시험 미생물을 접종 한천에 잘라 얼굴을 배양하고 있습니다. 억제 밴드는 한천 플레이트를 염색하여 시각화의와 테트라 졸 레드. 이 방법은 레드 클로버의 분리 (붉은 토끼풀의 이력서. Kenland) 페놀 화합물 및 클로스 트리 디움 sticklandii, 소의 반추위에 네이티브 하이퍼 암모니아를 생산하는 세균 (HAB)에 대한 활동에 대한 자신의 심사에 적용됩니다. TLC 방법은 (호기성 또는 혐기성)뿐만 아니라 진균 식물 추출물 및 다른 세균 종의 많은 유형에 적용되는 배양 조건은 종의 성장 요건에 맞도록 수정하는 경우, 시험 유기체로서 사용될 수있다.
Introduction
식물에서 항균 화합물 시금 것은, 식물 추출물의 성분을 분리하는 이러한 구성 요소에 시험 미생물을 노출하고, 미생물의 성장은 임의의 화합물에 의해 억제되는지 여부를 결정할 필요하다. 많은 화합물은 평면상에서 분리 할 수 있기 때문에 종이 또는 박층 크로마토 그래피 (TLC 또는 PC)에 의해 분리가 편리하다. 분리 일부 화합물은 흡착제 (PC의 경우는 셀룰로오스, 및 TLC의 경우 흡착제의 종류)에 긴밀하게 결합하고 다른 하나 미만 이주와 극성에 기초한다.도 1의 상대 위치의 예를 제공한다 실리카 TLC 판에 분리 후 극성과 비극성 페놀 화합물.
그림 1. 실리카 박층 크로마토 그래피 (TLC) 접시에 분리 후 다른 극성의 화합물의 분포를 설명하는 다이어그램. 레드 클로버 (붉은 토끼풀 L.)의 페놀 화합물은 예로서 사용된다. 같은 clovamide 등의 극성 화합물은, 실리카와 같은 극성 흡착제에 대한 강한 친화력을 가지고 원점 (OR) 근처에 남아있는 동안 같은 용매 전면 근처의 세 가지 이소 플라본 (SF), 파티션보다 쉽게 용매에 덜 극성 화합물, (물, 산, 또는 염기가 포함되지 않는 실리카보다 극성되는) 멀리 플레이트까지 이동한다.
TLC 플레이트의 추출물을 분리 한 후, 시험 미생물 따라서이 추출물의 활성 성분의 식별을 가속화 접시에 모든 화합물에 노출 될 수있다. 곰팡이 나 세균의 문화 크로마토 그램에 노출되어있는 경우, 미생물의 성장은 성장 억제와 지역에 제외한 모든 발생합니다Y 화합물. 억제의 영역은 곰팡이가 3 적용된 경우 균사 생장과 성장없는 영역 사이의 대비를 관찰 또는 셀 4 살아있는 감소 또는 가수 분해 할 때 색상을 변경 화합물로 분사하여 시각화 할 수있다. 항균 분석 종이 또는 얇은 층 크로마토 그램의 사용이 처음 항생제 5 살균제 3,6에 적용되었지만, 식물 추출물은 이제 자주 자주 bioautography이라이 방법으로 항균 화합물에 대한 검사를하고 있습니다. 설명하는 프로토콜은 여기에 박층 크로마토 그램의 bioautography에 적용됩니다. 비교적 신속하고 상이한 흡착제 (예 : 실리카, 전분, 알루미나)뿐만 아니라, 좋은 해상도와 감도를 제공하는 일에 수행 될 수 있기 때문에 TLC가 널리 사용된다.
식물 추출물은 여러 가지 방법으로 TLC를 위해 제조 될 수있다. 일반적인 방법은 ALC에서 추출 식물 물질을 포함그러한 가능성이 산 또는 염기의 첨가 15 80 % 에탄올 7,8 등 ohol - 물 혼합물을 포함한다. 그들은 최소한의 볼륨에 TLC 판에 적용 할 수 있도록 물을 포함 할 가능성이 산성 또는 염기성이다 이러한 용매에서 추출 후, 추출물을 집중해야합니다. 알코올 - 물 추출물의 농도는 물 - 비혼 화성 유기 용매 에이트 또는 에틸 아세테이트 - 에틸 에테르 (1:1, V / V) 10, 11와 같은 용매의 혼합물로 분할함으로써 달성 될 수있다. 다른 식물 대사는 극성에 따라 다른 유기 용매로 추출된다. 그 식물 유기 산 또는 염기가이 단계에서 유기 용매로 추출되도록하기 위해, 알코올, 물 추출물의 pH가 발생하거나 다음 그들의 nondissociated 형태로 해리 분석을 변환하는 수용성 산 또는 염기로 낮출 수있다 중립 유기 용제 9에있는 가용. 유기상은 E 일 수있다감압 하에서 또는 질소 하에서 vaporated 및 TLC의 원하는 볼륨으로 조정. 추출물의 pH는 중성 용매, 작은 최종 부피 및 분리하기 전에 TLC 판에 추출물의 증발에 분석의 분할에 의한 생물 검정 미생물에 치명적인 수 없을 수도 있습니다.
곰팡이와 세균은 모두 2 추출물 식물의 bioautography에서 시험 미생물로 사용된다. 영양소 솔루션의 판에 분사하고 몇 일 3 축축한 환경에서 배양하면 같은 클라도 스포의 cucumerinum 일부 곰팡이의 포자는, (떨어져 억제 화합물과 지역에서) TLC 판에 발아. C.의 어두운 균사체 noninhibitory 영역에 cucumerinum은 균사 생장의 자유 지역에 날카로운 대조를 제공합니다. 박테리아가 동일하게하여 4,12에서 박층 크로마토 그래피 (TLC) 플레이트에 적용되었지만, 세균도 TLC 위에 부었다한천 플레이트 표면은 13, 14를 오버레이. 예 칸디다 알비 칸스 등 효모뿐만 14 한천 오버레이에 적용 할 수있다. 또한, TLC 판은 박테리아 10,15 또는 효모 8, 연락처 bioautography 2로 알려진 방법으로 접종 한천에 내려 얼굴을 배치 할 수 있습니다.
우리는 레드 클로버 (붉은 토끼풀의 이력서. Kenland)에서 항균 페놀 화합물에 대한 화면으로 접촉 bioautography하는 방법을 설명합니다. 시험 미생물은 클로스 트리 디움 sticklandii, 반추위 하이퍼 암모니아를 생산하는 세균 (HAB) 및 혐기성을 의무입니다. 사용되는 분리 추출 할 모든 구성 요소가 해결되지 않지만, 그들은 것이 가능 항균 화합물의 풀을 축소, 항균 활성의 영역의 식별을 용이하게한다. 이 프로토콜은 TLC 1 표준 절차를 사용합니다. 이 프로토콜은 또한 배양 obli에 필요한 기술에 대해 설명이러한 분석을위한 게이트 혐기성 균, 살아있는 세포 2,4 얼룩 테트라 졸 소금, 연락처 bioautography (15)와 시각화 방법의 사용.
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Protocol
1. 식물 추출물의 제조
- 붉은 토끼풀의 이력서에서 페놀 화합물의 추출을 위해 케이건과 Flythe 10를 참조하십시오. Kenland.
- 다른 식물에 다른 화합물을 추출하려면, (대부분이 설명되어 있습니다) 식물 또는 대사 산물 별 추출 방법에 대한 식물 화학적 인 분석 문학을 확인하거나 넓은으로 많은 화합물을 분리 등 Khurram 등. 7,8의 그와 같은 프로토콜을 찾습니다 극성의 범위.
2. 박층 판의 제조
- 멀리 전개 영역에서 흡착 된 오염 물질을 이동시키기 위해, 하나 이상의 극성 중성 용매에서 개발하여 클린 TLC 플레이트.
- 흄 후드에서 충분히 세정액을 제조 (아세트산 에틸 - 메탄올 2:1 예 15-100 ㎖, V / V) TLC 현상 챔버의 바닥뿐만 아니라 TLC 플레이트의 하부 에지 세트 다루 챔버 내부.
- 상업적를 사용cially 가능한 유리 TLC는 또는 호 덮인 파이렉스 비커 또는 보존 항아리 (뚜껑과 함께 사용할 수있는 다양한 사이즈) 챔버를 개발.
- 알루미늄 또는 가능한 현상 실에 맞게 다양한 크기 (20cm × 옆 20 센티미터 작은)에 와서 플라스틱 백업 (유연한) 실리카 겔 접시, 가위로 잘라 사용합니다. (주의 :. 실리카는 흡입하면 흄 후드에서 작업 폐 손상 및 실리카에 피부의 기름을 얻고 피하기 위해 장갑 TLC 판을 처리 할 수 있습니다.)
- 챔버 벽에 기대어 상판과 함께, 챔버에 플레이트를 삽입합니다. 플레이트는 서로 접촉하지 않아야합니다. 챔버 커버하고 용매를 모세관 작용에 의해 플레이트를 이동 할 수 있습니다.
- 용매 플레이트의 상단에 도달하면, 실에서 접시를 제거하고 용매가 증발 할 때까지 흄 후드 내에서 서있는 위치에 배열한다.
- 불순물이 볼 아래에 노란색 밴드를 찾아 TLC 판의 위쪽에 마이그레이션 한 경우 확인빛, 또는 자외선에서 형광 밴드 (UV) 빛 (그림 2B에서 "불순물 앞에"또는 경우 참조). 플레이트의 대다수가 여전히 황색 기미가있는 경우, 세정 공정을 반복한다.
- 챔버로부터 TLC 플레이트를 제거한 후, 용매를 버린다. 잔류 용매는 프로토콜 2 챔버를 사용하기 전에 완전히 증발 할 수 있습니다.
- X 20cm 플레이트 20cm, 및 X 10cm 플레이트 7cm에 대한 5 분 실리카 16 화합물의 이동에 영향을 미칠 수있는 잔여 수분을 제거하고, 100 ° C에서 건조 오븐에서 똑바로 판 소품 (10 ~ 15 분 ).
- 100 ° C의 건조 오븐을 사용할 수없는 경우, 낮은 온도 (60 ° C에서, 즉 40 분)에서 시간의 긴 기간 동안 열 접시.
- 플레이트는 건조 후, 그들을 적재하기 전에 주위 온도로 냉각 할 수 있습니다.
3. 추출 분리 챔버를 개발 준비
4. TLC 플레이트의로드 및 개발
- 가볍게 연필로 원산지를 표시합니다. TLC 판 흡착제 부드럽고 쉽게 손상의 경우, 가장자리에 표시를합니다. 화합물은 TLC 플레이트 챔버 내로 삽입되는 현상 용제의 표면 위에 있어야한다.
- 대신 혼탁의 농축 된 용액이 충분히 유기 용매 (여기서는 메탄올)에 추출 녹여서스펜션.
- 플레이트의 측면에 1cm의 경계를 떠나 마이크로 리터 주사기 또는 모세관 마이크로 피펫 좁은 밴드로 부하 시료와 표준. 밴드 (흄 후드에서 플레이트를 패닝하거나로드 할 수 있습니다) 건조하도록 허용합니다.
- 샘플의 큰 농도는 건조 밴드에 다시로드 샘플에 의해 플레이트, "overspot"에 필요한 경우.
- 핀셋이나 집게로, 포화 TLC 챔버 내부 플레이트 (들)을 설정합니다. 이 때문에 복합 마이그레이션 경로를 변경, 접촉 지점에서 접시에 용매를 제공 할 수 있기 때문에 플레이트 심지를 만지지해야합니다. 실을 커버 플레이트를 개발하자.
5. 생물 검정을위한 플레이트의 제조
- 용매 전면 판의 상단에 도달하기 전에 TLC 탱크에서 플레이트 (들)을 제거하고 연필로 용매 앞의 높이를 표시합니다. 흄 후드에서 플레이트를 건조 시키십시오.
- GE의 것과 동일한 TLC 챔버에 남아있는 TLC 판을 개발유지하는 경우 전체 하루 nerally 사용할 마감했다. 챔버 내의 용매의 양이 현저하게 감소하는 경우 TLC 챔버를위한 용매 혼합물을 개작.
- 플레이트는 건조 후, 가시 광선 또는 UV 빛의 밑에 밴드를 시각화하고, 연필로 밴드를 묘사. 램프는 254 nm의 (단파 UV) 및 365 nm의 (긴 파장의 UV) 모두에서 화합물을 검출 할 수있다 특히 휴대용 UV 램프와 볼 챔버, 편리합니다.
참고 :이 시점에서 또는 다음 단계 후, 접시 호일로 덮여 플라스틱 랩에 싸서 할 수 있으며, -20 ℃에 저장 최대 저장 시간은 화합물의 안정성에 따라 달라집니다. 실리카가 중립이 아니기 때문에, 일부 화합물은 TLC 판에있는 동안이 저하 될 수 있습니다. - 번호판을 사진이나립니다.
- 오버 헤드 UV 및 / 또는 표시 등 장착 가능한 경우 젤 photodocumentation 시스템을 사용합니다.
- 상업적인 photodocumentation 시스템을 사용할 수없는 경우, 상자의 내부 사진 플레이트는 위스콘신, 어두운 종이 또는 천으로 줄 지어삼각대에 카메라를 고정 및 휴대용 자외선을 토륨 17 링 스탠드에 고정. 더 형광 표시가없는 번호판을 촬영할 때, 밴드 모양 (17)을 개선하기 위해 카메라 렌즈를 통해 푸른 빛을 필터를 사용합니다.
- , 밴드의 특징을 보조 화합물 및 용매 전면이 이동 거리를 측정하고, 후자 (도 2a)에 의해 전자를 분할함으로써 고정 계수 (R의 F) 값을 계산한다.
6. 균 배양 및 분석
- 준비하고 혐기성 조건에서 미디어를 접종. 이 경우에 사용되는 문화는 제임스 B. 러셀, 코넬 대학교, 이타카, 뉴욕의 문화 컬렉션에서 얻은 클로스 트리 디움 sticklandii 변형 SR했다.
- Flythe 및 케이건 (13)와 HAB 미디어에 대한 설명 자료 목록을 참조하십시오.
- 지수 또는 정지 단계로 문화를 성장. 멸균 혐기성 techniqu을을 사용하여에스 혐기성 미생물로 작업 할 때.
- 이하 60 ° C로 감소 한천 (V가 승 / 0.75 %)의 온도 후 용융 한천로 (1 % V / V) 문화를 접종 부드럽게 혼합 즉시 부어 (HAB 미디어의 95 % CO 2 5 %의 H 2 분위기) 혐기성 챔버로 가져옵니다.
- 15mm X 100mm 플라스틱 배양 접시에 부어 응고 할 수 있습니다.
- 가위, 관심 대역 (들)을 포함하는 영역으로 TLC 판을 잘라. 밴드 TLC 판에 원래의 위치를 추적 할 판 뒷면에 밴드를 표시, 한천 플레이트에 얼굴을 아래로 놓습니다. 컨트롤로 한천 플레이트에 사용하지 않는 TLC 스트립을 놓습니다.
- 한천 플레이트, 아래로 한천면, 혐기성 챔버 (24 시간, 39 ° C)를 품어.
7. Bioassayed 한천 플레이트의 시각화
- 그들은 혐기성 챔버에있는 동안 집게로, 한천 플레이트에서 밴드를 제거합니다.
- 1 %를 추가 (w / v)의 테물에서 제조 trazolium 빨강, 한천 플레이트의 표면 상에 적가 하였다. 제어 판은 혐기성 챔버에서 제거하기 전에 완전히 빨간색으로 바뀔 때까지 색상이 적어도 20 분 동안 개발, 또는 할 수 있습니다. 혐기성 박테리아는 즉시 혐기성 챔버에서 제거 후 생존 능력을 상실하기 시작합니다, 그러나 색깔 이상 24 시간 동안 안정하다.
- 가시광 사진.
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Representative Results
레드 클로버 (붉은 토끼풀의 이력서. Kenland) 추출물, 페놀 화합물을 함유, 대표 실리카 TLC 분리는 그림 2에 나타내었다. 에틸 아세테이트 - 헥산에서 레드 클로버 추출물의 분리 (9:1, V / V), 8.5 cm 이상은 5 밴드, 불완전 원점에서 해결 한 (그림 2A)로 만들었습니다. 그러나,도 2b는 레드 클로버 추출물 (같은 품종에서,하지만, 같은 농장에서 별도의 플롯에서 재배)의 다른 샘플이 더 먼 거리를 통해 분리 (15cm 대신 때 두 배 정도 많은 밴드가 발표 된 것을 보여줍니다 8.5 CM) 및 다른 용매 시스템에서 두 개의 연속적인 발전과 함께. 도 2B의 크로마토 그램은 (9:1, V / V), 후 건조시키고, 아세트산 에틸 - 메탄올 분리 아세트산 에틸 - 헥산으로 처음 개발 하였다 (78:22, V / V). 이러한 결과는 보여 솔벤트 시스템 (또는 용매의 일련의 접시 크기 및 선택 모두ystems) 크로마토 그램에서 분리 된 화합물의 수에 영향을 줄 수 있습니다. 특히이 경우, 용출과 동일한 추출의 다른 TLC 분판에서 밴드의 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 원점에 또는 근처에 남아있는 화합물은 주로 극성 잔기에 접합 페놀 화합물 (페놀 산 또는 이소 플라본)로 이루어져 있음을 확인 아미노산 유도체, 당류 또는 말산 등. 반면에, 극성 부분에 접합하지 이소 플라본은 멀리 TLC 플레이트 (10)까지 마이그레이션.
클로스 트리 디움 sticklandii, 반추위 하이퍼 암모니아 - 생성 박테리아 (HAB)와도 2a에 도시 된 TLC 플레이트의 생물 검정의 결과를도 3에 나타낸다. 살아있는 세포를 염색 할 때 (V / W) 24 시간 배양 한 후 한천 플레이트에 테트라 졸 레드의 수용액은 밝은 붉은 색 결과 1 % 추가. 밴드 1의 인큐베이션 (바이오 카닌 A)과 바의 일부ND 2 박테리아 시드 한천에 (포르 모노 네틴)는 억제의 잘 정의 된 영역 (그림 3A)의 결과. 그러나, 밴드 3, 4와 함께 밴드 2의 나머지의 배양은 박테리아의 성장 (그림 3B)를 억제하지 않았다. 이러한 결과는 바이오 카닌 A가 C의 억제 정도였다 sticklandii 성장하지만, 포르 모노 네틴은 아니었다.
붉은 토끼풀의 이력서의 추출물의 그림 2. 실리카 박층 크로마토 그래피 (TLC) 분리. 동일한 용매 (78:22, V / V). 거리는 의해 이주 아세트산 에틸 - 메탄올 개발 하였다 것이 (A), 에틸 아세테이트 - 헥산 (9:1 V / V), 또는 (B)에서 개발 Kenland, 원점 (OR) 및 용매 전면 (SF) 사이 용매 근처 표시된두 경계 사이의 브라켓. 그림 2B, "불순물 앞"에서 (IF는, 불순물의 위치가 극성 용매에 예비 세탁을하여 판을 이동)은 플레이트의 상단 어두운 밴드로 볼 수 있습니다. 180-250 mg의 동결 건조 레드 클로버 잎 및 줄기로부터 제조 된 추출물을 메탄올에 용해하고, 추출물 (A) 또는 32 % (B)의 10 %을 실리카 플레이트 상에 로딩 하였다. 로드 표준이 A (BA, 7.4 nmol의) 바이오 카닌, (F, 7.1 nmol의)를 포르 모노 네틴했다, 제니스테인 (g, 9.8 nmol의), 그리고 clovamide 된 (C1, 그림 2B 만, 8.7 nmol의). 254 NM (단파 UV) 및 365 nm의 (장파장 UV)에서 휴대용 UV 램프 아래 참고하면서 밴드는 선회 하였다. 디지털 카메라는 단파 UV 하에서 플레이트를 촬영하기 위해 사용되었다. 그림 2A의 클로버 추출물 밴드 영역을 참조의 오른쪽에있는 숫자는 생물 검정에 잘라. 고정 요소 (R f를, 거리 traveleSF로 여행 밴드 / 거리)로 D는 그림 2A의 밴드 번호 뒤에 괄호에 있습니다.
그림 3. (A) 밴드 1과 그림 2A, 및 (B) 밴드 같은 TLC 판에서 2-4의 TLC 판에서 밴드 2의 불완전 해결 상부의 TLC 판 생물 검정 결과. 밴드는 아래로 얼굴을 마련했다 HAB 매체는 클로스 트리 디움 sticklandii 접종하고 39 ℃에서 24 시간 혐기 배양에 이 배양 기간의 끝에서, 대역은 제거하고, 한천 플레이트를 1 % 수용액 (w / v) 테트라 졸륨 적색 가시광 하에서 촬영하여 염색 하였다.
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Discussion
이 프로토콜은 화합물의 하위 집합으로 추출물을 분리하고 접촉 bioautography에 의해 그 하위 집합을 시금위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 임질을 일으키는 세균 억제 식물 대사에 대한 화면 Chomnawang 등. (15)에 의해 사용되는 것과 매우 유사합니다. 항균성 식물 화합물 화면으로 채용 bioautography의 분류는 시험 미생물 실험실 셋업 및 생물학적 검정을 수행하는 사람 (들)의 설정 등 여러 요인에 따라 달라진다. 접점 bioautography, 본 연구에 사용 된 방법은 접종 미디어 (12)에 확산시키는 화합물의 능력에 따라 비판되었다. 성장이 diffusate 아래의 한천에 발생하는 경우 낮은 농도의 화합물에 억제, 또는 미디어로 확산 거의 기능과의 영역이 검출되지 않을 수 있습니다. 또한, 하나의 밴드에 의해 생성 억제의 영역은 밴드의 초기 넘어 확산 할 수 있습니다경계, 따라서 아마도 인접 화합물 (14)에 의해 생성 억제 영역을 마스킹. 그러나, 접촉 bioautography 사용하기 쉬운 방법으로, 배양 플레이트를 적층 할 수있는 능력이 필요한 공간을 최소화한다. 또한, 한천에 TLC 밴드를 세우고 밴드 용해와 TLC 판을 접종 한천와 겹쳐 또는 테스트 미생물 살포 될 때 발생할 수 있습니다 확산의 위험을 제거합니다.
bioautography의 위 유형의 정보를 얻기 크로마토 그래피 조건, 시험 미생물 농도, 문화 / 배양 조건에 따라 달라집니다. 항균 밴드의 크로마토 그래피 해상도는 필수는 아니지만 감도는 잘 해결 밴드 6에 대한 더 클 수있다. 밴드는 90도 개발하기 전에 TLC 판을 돌려서 하나의 차원 (그림 2B)에서, 또는 두 가지 차원에서 더 이상 접시 또는 여러 용매 시스템의 개발에 의해 분리 될 수있다제 2 용매 16,19합니다. 극성 화합물은 산 또는 염기를 함유하는 용매 혼합물을 사용하지 않고 실리카상에서 분리하기 어려울 수있다. 산의 적은 양의 사용은 14,15보고되어 있지만, 이들은 시험 미생물 (12)에 치명적일 수있다. 대체 용매 시스템 구성 요소 (20, 21)로 물이나 메탄올을 포함 할 수있다. 극성 화합물은 또한 C 18 흡착제 또는 셀룰로오스로 코팅 된 플레이트로 TLC 판의 다른 유형에 해결할 수 있습니다. 그러나, 성장 12 시각화 제 14 감도는 부정적인 이러한 흡착제의 일부에 영향을 줄 수 있습니다.
시험 미생물 및 미디어의 많은 다른 조합 bioautography 사용할 수 있습니다. 미생물 및 미디어를 선택하는 경우에는 여러 가지 요인이 고려되어야한다. 미디어 TET를 줄이기에는 구성 요소가 있는지 확인하기 위해 테스트해야소금을 razolium 및 비 생물학적 색상 변화의 원인이됩니다. 한천은 또한 염색 된 세포와 억제의 흠없는 영역 사이의 대조를 제공하기 위해 색상에 충분한 빛이 있어야합니다. 만 한천의 표면에 성장할 수있는 미생물은 TLC 밴드와 함께 제거하거나 염색을하는 동안 씻어 수 있습니다. 또한, 가스 생산을 최소화 미생물 / 매체 배합의 선택은 한천에 기포를 감소시킬 것이다. 반추위 HAB는 성장 기판 등의 아미노산 또는 펩티드의 혼합물과 카보네이트 버퍼, 탄수화물이없는 배지에서 성장한다. 한천 플레이트 라이트 골드와 투명합니다. 때 C. sticklandii이 배지에서 성장되고, 제품의 대부분은 (휘발성 지방산, 암모니아) 용해된다. 약간의 가스가없는 거품과 부드러운 한천 플레이트에서 발생하는 생산된다.
이 생물 검정은 잠재적 인 응용 프로그램의 몇 가지가 있습니다. 억제 영역의 크기는 대략적으로 사용될 수있다억제 성 화합물의 양이 억제 영역의 반경 이후 17,22 저해를 일으키는 화합물의 양의 대수에 비례한다. 아마도 TLC 판 생물 검정의 가장 일반적인 사용은 식물 추출물 가능 항균 화합물의 범위를 좁힐 수 있습니다. 억제 영역은 생물학적 검정에 의해 식별 된 후에 중복 된 TLC 플레이트에 대응하는 영역은 예를 들면, 메탄올 또는 에틸 아세테이트와 같은 용매로 용출하고, 생체 활성 화합물보기 10,14 특징 시작하는 자외선 분광 검출과 함께 HPLC로 분석 될 수있다.
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Disclosures
문서의 상표명 또는 상업적 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하는 목적으로 만하고 USDA에 의해 추천이나 승인을 의미하지는 않습니다. 저자는 더 경쟁 금융이자를 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우리가이 연구를 위해 자신의 레드 클로버 플롯에서 샘플을 사용할 수 있도록 위해, 후반 박사 규범 테일러, 소속 공장과 켄터키 대학의 토양 과학을 감사합니다. 이 프로젝트는 미국 농무부에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
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