Summary
方法は、植物抽出物の薄層クロマトグラフ（TLC）分離および抗菌性代謝物を同定するためのコンタクトバイオオートグラフィーのために記載されている。方法は、ウシ第一胃にネイティブ過剰のアンモニア産生菌（HAB）を阻害レッドクローバーフェノール化合物のスクリーニングに適用される。
Abstract
植物の抗微生物化合物のための共通の画面（ 例えば 、真菌又は細菌ブロスまたは寒天）、微生物のための時間には成長させる微生物の懸濁液にクロマトグラムを露出させる、紙又は薄層クロマトグラフィー（PC又はTLC）によって植物抽出物を分離することから成り湿った環境、無微生物の増殖のゾーンを可視化する。バイオオートグラフィーとして知られているこのスクリーニング方法の有効性は、クロマトグラフィー分離の品質および微生物の培養条件で撮影されたケアの両方に依存する。本稿では、酸発酵菌アミノための新しいアプリケーションと、TLCおよびコンタクトバイオオートグラフィーのための標準的なプロトコルについて説明します。抽出液を可撓性（アルミニウムで裏打ち）シリカTLCプレート上で分離し、バンドを紫外線（UV）光下で可視化する。ゾーンは、試験微生物を接種した寒天上に切り出し、表面を下にインキュベートする。阻害バンドは寒天プレートを染色することによって可視化されるsのテトラゾリウム赤。この方法は、レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）フェノール性化合物およびクロストリジウムsticklandii、ウシ第一胃にネイティブなハイパーアンモニア生産菌（HAB）に対する活性のための彼らのスクリーニングの分離に適用されます。 TLC法は、（好気性または嫌気性）、ならびに菌類植物抽出物及び他の細菌種の多くの種類に適用される培養条件は、種の成長要件に適合するように変更された場合に、試験生物として使用することができる。
Introduction
植物中の抗菌性化合物をアッセイすることは、植物抽出物の成分を分離するこれらのコンポーネントに試験微生物を露出し、微生物の増殖が化合物のいずれかによって阻害されるかどうかを決定する必要である。多くの化合物は、平坦な表面上で分離することができるので、紙又は薄層クロマトグラフィー（PC又はTLC）による分離が便利である。分離は、いくつかの化合物が吸着剤（パソコンの場合には、セルロース、およびTLCの場合、吸着剤の品種）に強固に結合し、他の1未満の移行で、極性に基づいています。 図1の相対位置の例を示していますシリカTLCプレート上で分離した後、極性および非極性のフェノール化合物。
図1。シリカ薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート上の分離後に異なる極性の化合物の分布を示す図。アカツメクサ（ トリフォチモシー L.）のフェノール化合物は、実施例として使用される。パーティションより容易なclovamideなどの極性化合物、シリカのような極性の吸着剤への強い親和性を有し、原点（OR）の近くに残っている、そのような溶媒先端（SF）に近い3イソフラボンなどの極性の低い化合物、しばらく、溶剤へ（水、酸、または塩基が含まれている場合を除き、シリカよりも極性である）と、遠くプレートまで移動する。
TLCプレート上で抽出物を分離した後、試験微生物は、このように抽出物2の活性成分の同定を迅速化、プレート上の全ての化合物に暴露することができる。真菌や細菌培養がクロマトグラムにさらされている場合は、微生物の増殖は、成長阻害剤を用いた領域上を除いてどこでも発生しますYの化合物。真菌細胞を生きた4により低減又は加水分解されたときに色を変更する化合物を噴霧することにより3または適用された場合に阻害ゾーンは、その後、菌糸体の成長および増殖を含まない領域とのコントラストを観察することによって視覚化することができる。抗菌性アッセイのための紙又は薄層クロマトグラムの使用は、第5の抗生物質及び殺菌剤3,6に適用したが、植物抽出物は、現在、頻繁に、しばしばバイオオートグラフィーと称されるこの方法では、抗菌性化合物についてスクリーニングされる。ここに記載されたプロトコルは、薄層クロマトグラムのバイオオートグラフィーに適用されます。それは比較的迅速であり、異なる吸着剤（ 例えば 、シリカ、デンプン、アルミナ）、ならびに良好な解像度及び感度1を提供することで行うことができるので、TLCが広く用いられている。
植物抽出物は、多くの方法でTLCのために調製することができる。一般的な方法は、ALCで抽出植物材料を含むそのような可能性の酸または塩基9を添加し、80％エタノール、7,8、等ohol -水の混合物である。彼らは最小容量のTLCプレートに適用することができるように、いくつかの水を含んでいて、おそらく酸性または塩基性であり、このような溶媒中で抽出後、抽出液を濃縮する必要があります。アルコール-水抽出物の濃度は、水非混和性有機溶媒8または例えば酢酸エチル-エチルエーテル（1:1、v / v）の10,11のような溶媒の混合物を分割することによって達成することができる。異なる植物代謝産物は、その極性に応じて、異なる有機溶媒中に抽出される。その植物有機酸または塩基がこの段階で有機溶媒中に抽出されるように、アルコール - 水抽出物のpHを上昇またはその後であり、それらの非解離形へと解離した分析物を変換するための水溶性の酸または塩基を低下させることができる中性有機溶剤に可溶で9。有機相をEすることができます減圧下、または窒素下でvaporatedとTLC用所望の容量に調整した。抽出液のpHを中性溶剤、小さな最終容量、および分離前にTLCプレート上の抽出物の蒸発への検体のパーティショニングによるバイオアッセイの微生物に対して致死的になることはほとんどありません。
真菌および細菌の両方は、植物抽出物2のバイオオートグラフィーの試験微生物として使用される。栄養溶液中でプレート上に噴霧し、数日3湿潤環境でインキュベートした場合などクラドスポリウムククメリヌムなどの一部の真菌の胞子は、TLCプレート（別に阻害化合物を用いた地域からの）上で発芽する。 Cの暗い菌糸非阻害性のゾーンにククメリヌムは菌糸成長のフリーゾーンに鋭い対照を提供しています。細菌は、同様に4,12薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートに適用されてきたが、細菌はまた、TLC上に注ぐ寒天オーバーレイ中の板面13,14。例えば、 カンジダ·アルビカンス（Candida albicans）などの酵母は、、ならびに14寒天オーバーレイを適用することができる。あるいは、TLCプレート10,15は、細菌または酵母8、コンタクトバイオオートグラフィー2として知られている方法で接種した寒天上にフェイスダウンで載置することができる。
私たちは、レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）から抗菌フェノール化合物をスクリーニングするために、コンタクトバイオオートグラフィーのための方法が記載されている。試験微生物は、 クロストリジウム·sticklandii、第一胃ハイパーアンモニア生産菌（HAB）で、嫌気性菌を義務づける。使用分離は抽出物のすべてのコンポーネントを解決しないが、彼らはこのように可能な抗菌性化合物のプールを狭め、抗菌活性のゾーンの識別を容易にする。プロトコルは、TLC 1のための標準的な手順を利用しています。プロトコルは、培養obliに必要な技術のいくつかを説明このようなアッセイのためのゲート嫌気性菌、生細胞2,4を染色するテトラゾリウム塩、接触バイオオートグラフィー15と可視化手法の利用。
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Protocol
1。植物エキスの調製
- アカツメクサの CVからのフェノール化合物の抽出にケーガンとFlythe 10を参照してください。 Kenland。
- 他の植物に他の化合物を抽出するために、（多くは説明されている）植物または代謝固有の抽出方法のための植物化学物質の分析資料を確認するか、ワイドで多くの化合物を分離するようなKhurram ら 7,8のもののようなプロトコルを探す極性の範囲。
2。薄層プレートの作製
- 現像所のゾーンから吸着された汚染物質を移動させるために、1種以上の極性、中性溶媒中で現像したクリーンTLCプレート。
- ドラフト内で、十分な洗浄溶剤を作製し（酢酸エチル-メタノール2:1、例えば 15〜100ミリリットル、v / v）でTLC現像室の底部、並びにTLCプレートの下縁組覆うようにチャンバー内。
- 商業を使うcially可能なガラスTLCは、箔で覆われたパイレックスビーカーや保存瓶（蓋で利用可能なさまざまなサイズ、）チャンバを開発する。
- アルミニウムまたは利用可能な現像室に合わせて、様々なサイズ（20センチのX 20センチメートル以下）に来るプラスチック担保（フレックス）シリカゲルプレートを、カットするはさみを使用してください。 （注意：吸入するとシリカは、肺の損傷を引き起こす可能性シリカに皮脂が出るのを避けるためにドラフト内で作業し、手袋をTLCプレートを処理します。）
- チャンバ壁に立てかけトップスと、チャンバー内にプレートを挿入します。プレートは互いに接触しないようにしてください。室内をカバーし、溶媒を毛細管現象によって、プレートを上に移動してみましょう。
- 溶媒をプレートの上部に到達したときに、チャンバからプレートを取り外し、溶媒が蒸発するまでヒュームフード内で起立位置に配置する。
- 不純物が目に見えるの下に黄色の帯を探すことによって、TLCプレートの上部に移動したかどうかを確認します光、紫外線（UV）光下での蛍光バンド（「不純物前」または図2BのIFを参照してください）。プレートの大部分は依然として黄色味を有する場合に、洗浄工程を繰り返す。
- チャンバーからTLCプレートを除去した後、溶剤を捨てる。残留溶媒は、プロトコル2用のチャンバーを使用する前に完全に蒸発することができます。
- シリカ上の化合物16の移動に影響を与えることができる残留水分を除去するために、100°C（19センチ×20センチ板10〜15分間、7センチメートル×10cmプレートで5分間の乾燥オーブン中で直立板を支える）。
- 100℃の乾燥炉を使用できない場合は、より低い温度（60℃、 即ち 40分）でのより長時間熱板。
- プレートが乾燥した後、それらをロードする前に、周囲温度まで冷却してみましょう。
3。抽出分離のためのチェンバースを開発する準備
4。 TLCプレートのロードと開発
- 軽く鉛筆で起源をマーク。 TLCプレートの吸着剤は柔らかく、容易に破損している場合は、エッジにマークを作る。 TLCプレートをチャンバー内に挿入されたときの化合物は、現像溶媒の表面上にあるべきである。
- 代わりに濁っの濃縮溶液を持つように十分な有機溶剤（この場合は、メタノール）での抽出物を溶解させるサスペンション。
- プレートの側面に1cmのボーダーを残しマイクロシリンジまたはキャピラリーマイクロピペットと狭帯域などの負荷サンプルと標準。バンドは（ドラフト内でプレートをあおるか、それをロードすることができます）乾燥させます。
- サンプルの高い濃度は、乾燥したバンドで再度サンプルをロードすることによって、プレート、「overspot」に必要な場合。
- ピンセットやトングで、飽和TLC室内プレート（複数可）を設定します。それはこのように、化合物の移行のパスを変更すること、接触点でプレートに溶剤を提供する可能性があるため、プレートを芯に触れないようにしてください。室内をカバーし、プレートを開発してみましょう。
5。バイオアッセイ用プレートの作製
- 溶媒先端がプレートの最上部に到達する前に、TLCタンクからプレートを取り外して、鉛筆で溶媒先端の高さをマーク。ドラフト内でプレートを乾燥させる。
- GEと同じTLCチャンバー内に残っているTLCプレートを開発閉じたままかどう全体の日のnerally使える。チャンバ内の溶媒の量が顕著に減少した場合TLCチャンバーのための溶媒の混合物を作り直す。
- プレートが乾燥した後、可視光または紫外光の下でバンドを可視化し、鉛筆でバンドを描く。ポータブルUVランプで表示する室は、ランプが254ナノメートル（短波長紫外線）と365 nmの（長波長紫外線）の両方で化合物を検出することができる場合は特に便利です。
注：この時点で、または次の工程の後に、プレートをホイルで覆い、プラスチックラップでラップすることができ、-20℃で保存最大蓄積時間は、化合物の安定性に依存している。シリカは中立的ではないので、いくつかの化合物は、TLCプレート上でしばらく低下することがあります。 - 写真やプレートを描く。
- オーバーヘッドUVおよび/または可視光を搭載した1が利用可能な場合はゲルphotodocumentationシステムを使用しています。
- 商用photodocumentationシステムが使用できない場合、暗い紙や布を敷いた箱の内部写真プレート、ウィスコンシン州三脚にカメラをセットし、携帯用のUV光を17番目のリングスタンドにクランプ。全く蛍光指示薬を持っていないプレートを撮影すると、バンドの外観17を改善するためにカメラのレンズを介して青色光フィルターを使用しています。
- 特徴付けるバンドを助けるために、化合物および溶媒先端が移動した距離を測定し、後者（ 図2A）によって、前者を分割して保持係数（R f）の値を計算する。
6。細菌培養およびアッセイ
- 準備し、嫌気的条件下でメディアを接種する。この場合に使用される文化は、ジェームズ·B.ラッセル、コーネル大学、ニューヨーク州イサカの培養コレクションから得られたクロストリジウムsticklandiiひずみSR、だった。
- Flytheとケーガン13とHABの媒体の説明のための材料のリストを参照してください。
- 指数関数的または定常期に文化を育てる。無菌嫌気techniquを使用ES嫌気性微生物を扱う。
- 60℃未満まで減少した寒天（V / Wの0.75％）の温度が溶融寒天に（1％v / v）の培養物に接種穏やかに混合し、すぐに注ぐた めに嫌気性チャンバー（HABメディアの95％がCO 2 -5％H 2雰囲気）に持ち込む。
- 15ミリメートル×100ミリメートルのプラスチックペトリ皿に注ぎ、固化することを可能にする。
- はさみで、目的のバンドを含有するゾーンにTLCプレートをカット。バンドは、TLCプレート上に元の方向を追跡するために、バッキングプレート上にマーキングバンドを、寒天プレート上に下向きに横たわっ。コントロールとして寒天プレート上に未使用のTLCストリップを置く。
- 嫌気性チャンバー（24時間、39℃）で、ダウン寒天プレートをインキュベートし、寒天側。
7。バイオアッセイ寒天プレートの可視化
- 彼らは嫌気室にいる間鉗子で、寒天プレートからバンドを削除します。
- 1％の追加（w / v）のテ水中で調製trazolium赤は、寒天プレートの表面に滴下した。色は、少なくとも20分間開発できるようにするか、制御板は、嫌気性チャンバーから取り外す前に、完全に赤に変わるまで。嫌気性細菌はすぐに嫌気槽から取り出し、実行可能性を失い始めますが、色は24以上の時間安定している。
- 可視光下で撮影しています。
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Representative Results
レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）抽出物、フェノール化合物を含有する、の代表的なシリカTLC分離は、 図2に示されている。酢酸エチル-ヘキサン中レッドクローバー抽出物の分離は（9:1、v / v）で、8.5を超えるセンチメートル、5つのバンド、不完全原点から解決一方（ 図2A）をもたらした。しかし、 図2（b）は、レッドクローバーエキス（同じ品種、同じ農場で別々のプロットで栽培さ）の異なるサンプルはより長い距離にわたって分離（15センチメートルの代わりにしたときの約2倍の多くのバンドが明らかにされたことを示している8.5センチメートル）と異なる溶媒系における2つの連続発展とともに。次いで、酢酸エチル-ヘキサン中で最初に開発された図2Bのクロマトグラム（9:1、v / v）を、乾燥させ、酢酸エチル-メタノールで分離（78:22、v / v）であった。これらの結果は、溶媒系（溶媒又は複数の一連のプレートサイズと選択の両方ystems）クロマトグラム上で分離した化合物の数に影響を与えることができます。この特定のケースでは、溶出およびその抽出物の他のTLC分離からのバンドの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、原点またはその付近残りの化合物は、主に極性部分にコンジュゲートフェノール化合物（フェノール酸又はイソフラボン）からなることが確認されアミノ酸誘導体、糖、またはリンゴ酸など。これとは対照的に、イソフラボンはTLCプレート10まで遠くに移行した極性部分と結合していない。
クロストリジウム·sticklandiiに図2Aに示すTLCプレート、第一胃過剰アンモニア生産菌（HAB）のバイオアッセイの結果は、 図3に示されている。 1％を添加し、24時間インキュベートした後の寒天プレートへのテトラゾリウム赤（w / v）の水溶液を、生細胞を染色したときに明るい赤色を生じた。バンド1のインキュベーション（ビオカニンA）及びBaの一部ND細菌を接種した寒天上2（フォルモノネチン）は阻害の明確に定義されたゾーン（ 図3A）となりました。しかし、バンド3と4と一緒にバンド2の残りのインキュベーションは、細菌の増殖（ 図3B）を阻害しなかった。これらの結果は、バイオチャニンAがCに抑制性であることが実証されたsticklandii成長が、ホルモノネチンはなかった。
アカツメクサ CV の抽出物の図2。シリカ薄層クロマトグラフィー（TLC）分離。 （A）酢酸エチル-ヘキサンで開発Kenland、（9:1、v / v）で、または（B）と同じ溶媒は、酢酸エチル-メタノール中で現像していること（78:22、v / v）であった。で移行距離原点（OR）、溶媒フロント（SF）間の溶媒が近くに表示されますこれらの2つの境界の間のブラケット。 図2B、（不純物の位置は、極性溶媒中で予洗でプレートを移動すると、）「不純物前」に、プレートの上部付近に濃いバンドとして見られている。 180〜250 mgの凍結乾燥レッドクローバーの葉および茎から調製した抽出物を、メタノールに溶解し、抽出物（A）または32％（B）10％のシリカプレートに負荷した。ロードされた規格は、A（BA、7.4ナノモル）、ゲニステイン（G、9.8ナノモル）、およびclovamide（CLのみ図2B、8.7ナノモル）ビオカニン、（F、7.1ナノモル）フォルモノネチンた。 254nmの（短波長UV）及び365nmの（長波UV）での手持ち式UVランプ下で観察しながら、バンドが円で囲まれた。デジタルカメラは、短波長UVの下にプレートを撮影するために使用した。 図2Aのクローバーエキスバンドの右にある数字は、バイオアッセイのために切り出されたゾーンを参照してください。保持係数（R fは 、距離traveleSFが移動したバンド/距離d）は、 図2Aのバンド番号の後の括弧内にある。
図3（A）、バンド1と図2（a）、（b）はバンドと同じTLCプレートから2-4のTLCプレートからバンド2の不完全に解決上部のTLCプレートバイオアッセイの結果。バンドは裏向きに置いたHAB媒体は、 クロストリジウム·sticklandiiを接種し、39℃で嫌気的に24時間インキュベートへこのインキュベーション期間の終了時に、バンドを除去し、寒天プレートを、1％水溶液（w / v）のテトラゾリウム赤色可視光下で撮影で染色した。
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Discussion
このプロトコルは、化合物の部分集合に抽出分離し、接触バイオオートグラフィーにより、これらのサブセットを分析するための簡単な方法を説明します。この方法は、淋病を引き起こす細菌に対する阻害植物代謝をスクリーニングするChomnawang ら 15によって使用されるものとよく似ています。抗菌植物化合物をスクリーニングするために使用されるバイオオートグラフィーのタイプは、試験微生物、実験のセットアップ、およびバイオアッセイを行う人（S）の好みを含む多くの要因に依存します。コンタクトバイオオートグラフィー、本研究で用いた方法は、接種されたメディア12内に拡散する化合物の能力に応じてのために批判されている。成長が透析物下の寒天中に発生した場合に、低濃度での化合物の上阻害、またはメディア内に拡散するために少し機能を備えたのゾーンは、検出できないことがあります。また、一つのバンドが作成した阻害ゾーンは、バンドの初期を超えて広がる可能性があります境界は、従って、おそらく、隣接化合物14で作成された阻害ゾーンをマスクする。しかし、コンタクトバイオオートグラフィーを使用するのは簡単な方法であり、ペトリプレートを積層する能力が必要とされるスペースの量を最小限に抑えることができます。また、寒天にTLC帯を敷設することは、バンド解散およびTLCプレートを接種した寒天を重層または試験微生物を噴霧したときに発生することができる拡散の危険性を排除します。
バイオオートグラフィー上記のタイプのいずれかから情報を取得することはクロマトグラフィー条件、試験微生物濃度、および文化/インキュベーション条件に依存します。抗菌バンドのクロマトグラフィー分割は必須ではないが、感度が十分に分解バンド6のために大きくてもよい。バンドは一次元（ 図2B）で、又は二次元で90度現像前にTLCプレートを回転させることにより、より長いプレート上で、または複数の溶媒系中で現像することによって分離することができる第二の溶媒16,19中。極性化合物は、酸又は塩基を含有する溶媒混合物を使用することなく、シリカ上で分離することが困難であり得る。酸の少量の使用は、14,15報告されているが、これらは、試験微生物12に致死的であり得る。代替的な溶媒系は 、成分20,21として水またはメタノールを含んでいてもよい。極性化合物はまた、C 18吸着剤又は微結晶セルロースでコーティングされたプレートなどのTLCプレートの異なるタイプに分割することができる。しかし、可視化剤12〜14の成長又は感度が負にこれらの吸着剤のいくつかに影響することができる。
試験微生物とメディアの多くの異なる組み合わせがバイオオートグラフィーのために使用することができる。微生物やメディアを選択する際にしかし、いくつかの要因が考慮されなければならない。メディアは、TETを減らすない部品が存在しないことを決定するためにテストする必要があります塩をrazoliumと非生物学的な色の変化を引き起こす。寒天はまた、阻害の染色された細胞と非染色ゾーン間のコントラストを提供するために、色が十分な光にする必要があります。唯一の寒天の表面上に成長することができる微生物は、TLCバンドと一緒に除去又は染色中に洗い落とすことができる。さらに、ガスの生産を最小限に抑える微生物/媒体の組合せの選択は、寒天中の気泡を減少させる。ルーメンHABは、成長基板などのアミノ酸またはペプチドの混合物と炭酸塩緩衝、炭水化物を含まない培地中で成長する。寒天プレートは、ライトゴールドで透明である。ときはC. sticklandiiが培地中で増殖され、製品のほとんどは、可溶性（揮発性脂肪酸、アンモニア）である。非常に少ないガスが無い気泡とのスムーズな寒天平板、その結果、生産されている。
このバイオアッセイは、潜在的なアプリケーションがいくつかあります。阻止帯の大きさは、概算として使用することができる阻害性化合物の量は、阻害ゾーンの半径が阻害17,22を引き起こす化合物の量の対数に比例する。おそらく、TLCプレートバイオアッセイの最も一般的な用途は、植物抽出物中の可能な抗菌性化合物の範囲を狭くすることである。阻害ゾーンは、バイオアッセイによって同定された後、重複TLCプレート上の対応する領域は、メタノールまたは酢酸エチルなどの溶媒で溶出し、生物活性化合物を10,14を特徴付ける開始する紫外分光法検出を用いたHPLCにより分析することができる。
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Disclosures
記事の商号または商用製品に関する記述は、特定の情報を提供する目的のためだけで、米国農務省による推奨や保証を意味するものではありません。著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。
Acknowledgments
私たちは、私たちは、この研究のために彼の赤いクローバーのプロットからサンプルを使用できるようにするための、ケンタッキー大学遅く博士ノーム·テイラー、専攻植物や土壌学に感謝。このプロジェクトは、米国農務省によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
