Summary
نحن تصف تقنية لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية في نقص الأكسجة باستخدام التصوير. لم يسبق إجراء انقر الكيمياء وضع العلامات من الحمض النووي الريبي في ظل نقص الأكسجين ويسمح التصور من التغييرات RNA العالمية على مستوى خلية واحدة. هذا النهج يكمل تقنيات الحمض النووي الريبي متوسط الموجودة، مما يتيح رؤية مباشرة من خلية الى خلية تغييرات في تركيب الحمض النووي الريبي العالمية.
Abstract
وتشارك نقص الأكسجة أو خفض توافر الأكسجين في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. على المستوى الجزيئي، خلايا بدء برنامج النسخي خاصة من أجل جبل استجابة الخلوية مناسبة ومنسقة. الخلية تمتلك العديد من الانزيمات مستشعر الاوكسجين التي تتطلب الأكسجين الجزيئي كما العامل المساعد لنشاطها. هذه مجموعة من prolyl-hydroxylases لdemethylases هيستون. وتستند غالبية الدراسات تحليل الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجة الخلوية على السكان ومتوسط الدراسات، وعلى هذا النحو تحليل خلية واحدة من خلايا ميتة ونادرا ما يؤديها. نحن هنا تصف طريقة لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية على مستوى خلية واحدة في نقص الأكسجة باستخدام نقرة-IT مجموعات التصوير الحمض النووي الريبي في محطة الأكسجين للرقابة، يليه التحليل المجهري والكمي. باستخدام الخلايا السرطانية تتعرض لنقص الأكسجين لفترات مختلفة من الزمن، هو المسمى الحمض النووي الريبي ويقاس في كل خلية. يسمح هذا التحليلتصور والخلية الى خلية التغيرات الزمنية في توليف الحمض النووي الريبي العالمية عقب التوتر ميتة.
Introduction
نقص الأكسجة (الأكسجين المنخفضة التوتر) ويحدث عندما يضطرب تزويد الأكسجين العادي إلى الأنسجة. الأكسجين البيئية على حد سواء والمغذيات وجزيء إشارة، وتوفير الاشارات الهامة لكثير من أنواع الخلايا. ومست التغييرات في الأكسجين البيئية من قبل مجموعة من dioxygenases التي تتحكم في نشاط عائلة عامل النسخ الأساسية المعروفة باسم عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs). وتتألف من اثنين من مفارز HIFs، α β و. هناك ثلاثة الإسوية معروفة من مؤسسة الحرمين، α (1، 2، و 3) والمتغيرات لصق متعددة من مؤسسة الحرمين، 1β. يتم التعبير عن مؤسسة الحرمين، 1β جوهري والتي لا تنظمها مستويات الاوكسجين البيئية 1. ويتم تنظيم أفراد الأسرة مؤسسة الحرمين، α بشكل حيوي بواسطة فئة من prolyl-hydroxylases (الدكتوراه) وعامل تثبيط مؤسسة الحرمين (FIH)؛ وكلاهما يتطلب الأكسجين باعتبارها عامل مساعد لتحفيز الهيدروكسيل من مؤسسة الحرمين، α 2،3. في normoxia والهيدروكسيلية أعضاء الأسرة مؤسسة الحرمين α والمعلمة لproteosomتدهور آل من E3-يغاز، فون هيبل لينداو (VHL). في نقص الأكسجة والدكتوراه وFIH غير نشطة أو لديهم انخفاض النشاط. تصبح الأشكال الإسوية-α استقرت مؤسسة الحرمين، تشكيل مغاير مع مؤسسة الحرمين، 1β، وتؤثر على نسخ من الجينات التي توفر استجابة الخلايا للبيئة ميتة (الشكل 1A) 4.
التقنيات الحالية لتحليل الحمض النووي الريبي التركيز على القياس الكمي للقيم المتوسط عبر السكان خلية معينة. خلايا الاستجابة لحافز نقص الأوكسجين قبل بدء النسخ من عدد لا يحصى من الجينات التي تسمح لهم للتكيف مع بيئة معادية لهم 5. ومع ذلك، في كثير من الأحيان نقص الأكسجين كما هو معمول به التدرج، وخلايا في بيئة ميتة لا تخضع لحافز نقص الأوكسجين موحدة. نحن تصف تنفيذ مجموعات التصوير RNA نقرة-IT في محطة الأكسجين للرقابة لفحص الحمض النووي الريبي التوليف العالمية على مستوى خلية واحدة في نقص الأكسجة.
يستخدم عدة التصوير الحمض النووي الريبي للنوكليوزيد lkyne تعديل، 5-إيثينيل يوريدين (الاتحاد الأوروبي) وربط chemoselective لتمكين الكشف عن الحمض النووي الريبي التوليف العالمي زمنيا ومكانيا في الخلايا والأنسجة 6. لفترة وجيزة، ويتم التعامل مع الخلايا نقص الأكسجة والمثقف في وجود الاتحاد الأوروبي. ثم تم إصلاحها وأنها permeabilized ويتم الكشف عن إدماج الاتحاد الأوروبي في الحمض النووي الريبي الوليدة عن طريق ربط chemoselective من الاتحاد الأوروبي مع أزيد التي تحتوي على الصبغة. ويرد سير العمل النموذجية لهذا التفاعل في الشكل 1B. استخدمنا عدة التصوير الحمض النووي الريبي لفحص الحمض النووي الريبي التوليف على مستوى خلية واحدة التي نتجت عن المعاملة مع نقص الأكسجة.
صغر حجم العلامة آلكاين يتيح إدماج الفعال للنوكليوزيد تعديل في الحمض النووي الريبي على وجه التحديد. وربط chemoselective أو رد فعل 'فوق' هو ذات كفاءة عالية وسريعة ومحددة 7-10. كافة المكونات هي رد فعل bioinert ويتطلب رد فعل لا درجات الحرارة القصوى أو المذيبات. ينفي رد فعل نقرةشرط radiolabelling التقليدية ويسمح التصور المباشر للنتائج منذ الإخراج هو الضوء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للجزيء كشف اختراق بسهولة عينات معقدة مما يسمح للتحليل المتعدد بما في ذلك الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات الحمض النووي الريبي التفاعلية. هذا الاختبار الحمض النووي الريبي التصوير متوافق مع الأصباغ العضوية بما في ذلك اليكسا فلور وفلوريسئين (FITC).
قمنا بقياس التغير في تخليق الحمض النووي الريبي بعد العلاج من خلايانا باستخدام تنفيذ بيئة مفتوحة المجهري للكائنات عن بعد (أوميرو). أوميرو هو برنامج مفتوح المصدر، متاح على http://openmicroscopy.org/ . هذا المجهر التصور الصورة وتحليل البرمجيات تمكن من الوصول إلى واستخدام مجموعة واسعة من البيانات البيولوجية، بما في ذلك إدارة متعددة الأبعاد، قواعد البيانات غير المتجانسة. تطبيق العميل يسمح التصور عن بعد وتحليل البيانات البيولوجية المعقدة الصورة 11؛نحن استخدامه لقياس التغيرات البصرية في توليف الحمض النووي الريبي الخلية العالمية واحدة. وتظهر هذه البيانات والخطوات المطلوبة لتحليل الحمض النووي الريبي لدينا تجربة التصوير باستخدام هذا المجهر التصور الصورة وبرامج التحليل أدناه.
ونحن ننظر في تغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي العالمية التالية علاج عظمية الإنسان (U2OS) الخلايا مع نقص الأكسجين لمدة تصل إلى 24 ساعة. في جميع الظروف، ونحن الكشف عن الاختلاف الخلية الى خلية في مستوى إنتاج الحمض النووي الريبي. لم أوقات قصيرة من التعرض نقص الأكسجة لا تؤدي إلى تغييرات كبيرة على مستوى الحمض النووي الريبي في الخلايا الوليدة. ومع ذلك، أدى التعرض إلى 24 ساعة من نقص الأكسجة إلى زيادة كبيرة في كمية من الحمض النووي الريبي التي تنتج في الخلايا. يتم قياس معظم الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجة التالي فترات طويلة من التعرض، مثل 4-24 ساعة. ومع ذلك، يتم وضع بعض الآليات في مكانها في وقت سابق من ذلك بكثير، على سبيل المثال؛ يحدث تفعيل NF كيلوبايت في غضون 5-15 دقيقة من التعرض نقص الأكسجة 12. التحقيق أقصر فراش لا تسببوبالتالي هناك ما يبرر مرات التعرض شيا ويمكن أن ينتقص من استجابات أكثر تعقيدا مثل دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج.
Protocol
1. خلية ثقافة والعلاج
- جمع الكواشف والمعدات المدرجة في الجدول 1 إلى ثقافة عظمية الإنسان (U2OS) الخلايا. إعداد جميع الكواشف وإجراء جميع تقنيات زراعة الأنسجة في الصفحي هود تدفق الهواء لضمان العقم
- تحضير مستنبت على النحو التالي: إضافة 50 مل FCS، 5 مل L-الجلوتامين و 5 مل البنسلين / الستربتوميسين إلى DMEM لتحقيق تركيزات النهائي من 10٪ (FCS)، 2 مم (L-الجلوتامين)، 50 U / مل ( البنسلين) و 50 U / مل (الستربتوميسين). تدفئة مستنبت عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إعداد الخلايا للعلاج:
- تعقيم عدة coverslips في الايثانول 70٪، والسماح للهواء الجاف ومكان واحد على الجزء السفلي من ست 3.5 سم لوحات.
- تزج لل coverslips في 2 مل تحسنت DMEM كاملة (37 درجة مئوية)، والضغط إلى أسفل مع ملقط ساترة للتأكد من أنها لا تزال تلتزم الجزء السفلي من الآبار.
- فصل الخلايا U2OS من عبادة أنسجتهملوحة لدى عودتهم عن طريق الغسيل مرة واحدة مع 3 مل PBS، تطبيق 4 مل تحسنت 0.05٪ التربسين EDTA-(1٪) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- خلايا resuspend في 6ML تحسنت DMEM كاملة لإبطال نشاط التربسين EDTA-والعد باستخدام عدادة الكريات.
- لوحة 2 × 10 5 خلايا لكل من الطول 3.5 وحات أعدت في النقطة 1.3.1. صخرة بلطف لوحة لضمان التوزيع الخلية حتى. تسمح للخلايا على الانضمام بين عشية وضحاها قبل العلاج.
- علاج الخلايا عن طريق وضع أربع لوحات 3.5 سم في محطة نقص الأكسجة وترك الأخريين 3.5 سم لوحات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في ظروف الأكسجين العادي. تكون على استعداد لبدء وضع العلامات فحص الحمض النووي الريبي في ظل ظروف المعالجة (في غرفة نقص الأكسجة نقص الأكسجين للخلايا المعالجة) 1 ساعة قبل انتهاء العلاج نقص الأكسجة.
- تعرض الخلايا لنقص الأكسجين لمدة 1 ساعة 15 دقيقة، 1 ساعة و 30 دقيقة، 2 ساعة، و 24 ساعة. هذه النقاط الوقت تتسم بالمرونة ويحدد المستخدم.
- استخدام normoXIC 3.5 سم لوحة باسم مراقبة إيجابية وnormoxic 3.5 سم لوحة تعامل مع أكتينوميسين D (10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) لمدة 4 ساعة كما سيطرة سلبية. أكتينوميسين D هو المانع من توليف الحمض النووي الريبي العالمية.
يحذر:
هويشت 33342 هو المغير معروفة.
ومن المعروف DMSO لتسهيل دخول الجزيئات العضوية إلى الأنسجة.
هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل.
حمض الهيدروكلوريك هو تآكل.
بارافورمالدهيد هي سامة للغاية لجميع الحيوانات ويمكن أن يسبب الموت في البشر.
تريتون X-100 يمكن أن يسبب تهيج الجلد بعد الاتصال المباشر.
أكتينوميسين D هي سامة عند ملامسة الجلد أو ابتلاعها.
اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل مع جميع المواد الكيميائية الخطرة.
2 انقر فوق-IT الفحص
- جمع الكواشف التالية المطلوبة بالإضافة إلى فحص عدة نقرة-IT: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) درجة الحموضة 7،2-7،6، 3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني، 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، والماء منزوع الأيونات (DH 2 O)، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 10 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)، وحمض الهيدروكلوريك 37٪ (حمض الهيدروكلوريك)؛ شرائط مؤشر الرقم الهيدروجيني - اختياري.
- يعد حل الطازجة PFA الأسهم قبل تنفيذ رد فعل نقرة-على النحو التالي:
- وضع 1.85 ز PFA، 3.5 مل O 2 درهم و 10 ميكرولتر of10 M هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب فالكون 50 مل. يغلي 300 - 400 مل من H 2 O في كوب كبير في الميكروويف لجعل حمام مائي ويقف هذا في غطاء الدخان.
- وضع فالكون 50 مل في حمام ماء وتستنهض الهمم برفق لمدة 10 دقيقة، والإفراج عن دوري الغطاء حتى يذوب PFA.
- محقنة الحل PFA من خلال مرشح 0.2 ميكرون إلى 50 مل أنبوب فالكون أخرى، مما أدى إلى حل 37٪.
- تمييع هذه 10X بإضافة برنامج تلفزيوني وجلب الرقم الهيدروجيني إلى 6.8 بإضافة حوالي 12 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز. الخيار: تأكيد الرقم الهيدروجيني الصحيح مع شرائط مؤشر في غطاء الدخان.
- استخدامها على الفور أو تخزين سvernight في 4 درجات مئوية.
- إعداد الحلول الأسهم من عدة التصوير الحمض النووي الريبي على النحو التالي:
- إضافة 373 ميكرولتر DH 2 O إلى مكون A مما أدى إلى محلول المخزون من 100 ملم من الاتحاد الأوروبي. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إضافة 85 ميكرولتر من DMSO إلى مكون B (فلور اليكسا 594) ومزيج من قبل pipetting أو vortexing ل. تخزين سواء في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
- إضافة 2 مل درهم 2 O لعنصر E لإيجاد حل 10X من التصوير RNA رد فعل عدة عازلة المضافة. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة سنة واحدة، ونبذ الحل عندما يطور اللون البني.
- توسيم الخلايا مع الاتحاد الأوروبي: يعد حل العاملة 2X من الاتحاد الأوروبي من 100 ملي الأسهم أعدت في الخطوة 2.3 في prewarmed المتوسطة كاملة (37 ° C) تنفيذ ما تبقى من هذه الخطوة والخطوة 2.5 في غرفة نقص الأكسجين للخلايا تعامل مع نقص الأكسجة. . تمييع ل1X بإضافة حجم مساو من هذا الحل يعمل 2X إلى تابع وسائل الإعلامaining الخلايا. احتضان لمدة 1 ساعة تحت العلاج الظروف ثقافة الخلية.
- تثبيت الخلية: يغسل كل مرة بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 3.7٪ الأسهم PFA أعدت في الخطوة 2.2 أعلاه في ظل ظروف العلاج. احتضان لمدة 15 دقيقة في ظل ظروف العلاج. العينات تعامل مع نقص الأكسجة يمكن إزالتها من غرفة نقص الأكسجين عند هذه النقطة. إزالة تثبيتي، ويغسل مرة واحدة مع كل بئر PBS (الحرص على التخلص من النفايات بطريقة مسؤولة PFA). نفذ الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.
- Permeabilization: إزالة الحل يغسل وإضافة 1 مل من 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت permeabilization ويغسل مرة واحدة كل بئر مع برنامج تلفزيوني.
- وصفت الكشف عن الحمض النووي الريبي:
- إعداد 1X حل العاملة جديدة من التصوير RNA العازلة رد فعل عدة المضافة عن طريق تمييع الحل 10X (المعد في الخطوة 2.3) 1:10 في DH 2 O.
- إعداد عدة التصوير RNAكوكتيل رد فعل وفقا لجدول 2 للاستخدام مباشرة بعد التحضير.
- إزالة الحل يغسل وإضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي التصوير تفاعل عدة كوكتيل لكل عينة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الضوء.
- إزالة التصوير RNA رد فعل عدة الكوكتيل ويغسل مرة واحدة مع 1 مل من الحمض النووي الريبي التصوير تفاعل عدة العازلة شطف (المكون F)، ثم إزالة التصوير RNA رد فعل عدة العازلة الشطف.
- رد فعل متعددة اختيارية: تنفيذ وضع العلامات الضد إضافية من العينات في هذه المرحلة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
- الحمض النووي تلطيخ: غسل العينات مع برنامج تلفزيوني ثم إزالة الحل يغسل. تمييع هويشت 33342 (مكون G) 1:1،000 في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من المخفف هويشت 33342 إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الضوء. إزالة هويشت 33342 حل وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة محلول غسلن، والشروع في المجهر الضوئي.
3. ضوء المجهر
- جبل Coverslips:
- وضع 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على وسط شريحة المجهر القياسية.
- وضع ساترة مع الجانب الخلية أسفل على وسط شريحة المجهر لتغطية قسامة من تصاعد المتوسطة. الحرص على تجنب توليد فقاعات في المتوسطة المتزايدة لأن هذا سوف تحجب الحصول على الصور اللاحقة.
- عصا ساترة إلى الشريحة المجهر من خلال تطبيق طلاء الأظافر واضحة لمحيطه. السماح ليجف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يحفظ بعيدا عن الضوء. قد يتم تخزين العينات في -20 ° C التالية في تصاعد مستمر.
- الحصول على الصور: الحصول على الصور باستخدام المجهر واسعة المجال قادرة على الكشف عن مضان. يتم عرض تقريبي مضان / الإثارة القصوى لانبعاث الصبغة اليكسا فلور وهويشت 33342 منضمة إلى الحمض النووي في الجدول 3.
- ادائهام التصوير باستخدام عدسة 40X/1.30 NA الغمر النفط والتقاط الصور مع كاميرا CCD تبريده.
4. تحليل البيانات
- الصور Deconvolve باستخدام برامج معالجة الصور (انظر الجدول مواد) قبل المستوردة إلى العميل أوميرو. تطبيع جعل الإعدادات لكافة الصور في نفس التجربة في المجهر التصور الصورة وتحليل البرامج من خلال تطبيق الإعدادات جعل من خلايا normoxic السيطرة على جميع الشروط الأخرى.
- استخدام المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في أداة المجهر التصور الصورة وتحليل البرامج (انظر الجدول مواد) لتحديد نوى من كل صورة. الحصول على شدة متوسط العائد على الاستثمار لكل وحساب الانحراف المتوسط وموحدة لكل حالة عن طريق اختيار الخيار تحليل كثافة، بما في ذلك عدد بين 30-50 الخلايا.
- بناء المؤامرات مبعثر باستخدام البرمجيات والبيانات برسوم بيانية (انظر الجدول مواد) من خلال التآمر على كل القيم كثافة متوسط الفرد الحصول عليها في الخطوة 4.2 طنس تعكس التباين بين الخلايا تحت كل شرط. بدلا من بناء الرسوم البيانية لتمثيل متوسط كثافة الوسط بالإضافة إلى الانحراف المعياري من الحمض النووي الريبي الوليدة.
Representative Results
ويرد التخطيطي للتفاعل عدة التصوير الحمض النووي الريبي في الشكل 1B. استخدمنا هذا التفاعل لتحديد كميا توليف الحمض النووي الريبي مجموع في الخلايا U2OS بعد العلاج مع نقص الأكسجين على كل فرد (وحيد الخلية) والمستوى العالمي (السكان من الخلايا). تم علاج الخلايا مع نقص الأكسجة والمثقف في وجود الاتحاد الأوروبي. كانوا ثم الثابتة وpermeabilized وتم الكشف من قبل الاتحاد الأوروبي إدراج ربط chemoselective من الاتحاد الأوروبي مع أزيد التي تحتوي على الصبغة. هذا 'فوق' نتائج التفاعل في الانبعاثات مضان التي يمكن أن يتم الكشف عن وكميا باستخدام ضوء مضان المجهري. ويبين الشكل 2A نتيجة نموذجية من هذه التجربة. وpseudocolored خلايا fluorescently المسمى الأحمر وتم فتح الصورة في بيئة مفتوحة المجهري للكائنات عن بعد (أوميرو). هذا التصور صورة المجهر وتحليل البرمجيات لديها المدمج في أداة العائد على الاستثمار التي يمكن استخدامها لتحديد البنى الفردية شبه الخلويةتوريس وكميا تحليل كثافة الصورة داخل المنطقة المختارة. والمثال النموذجي لإخراج البيانات التالية استخدام هذه الأداة في البرنامج العميل يمكن أن ينظر إليه في الشكل 2B؛ وتظهر شدة الخلايا الفردية جنبا إلى جنب مع صورة ممثل من التجربة التي هي بمثابة الاختيار البصرية لضمان صحة البيانات.
يمكن رسم الفرد كثافة مضان الخلية كما مخطط مبعثر لإظهار توزيع شدة الخلوية الفردية ضمن السكان خلية المعالجة. وينظر مثال على هذا النوع من الرسم البياني في الشكل 2C. التآمر البيانات كثافة بهذه الطريقة مفيد لأنه يسمح مقارنة نتائج العلاج السريع للويدل على عدم تجانس كبير بين السكان خلية العلاج الذي يتم حجب إلا باستخدام تمثيل البيانات القياسية بشكل واضح. عدم تجانس استجابة المثير للاهتمام في هذه التجربة أنه على الرغم من التحفيز ميتة موحدة كانpplied إلى الخلايا، فمن الواضح أن كل خلية من نفس السكان أحادي الطبقة يستجيب بشكل مختلف لهذه الحوافز.
الرقم 2D يصور النتيجة الاجمالية من تجربتنا. وبلغ متوسط كثافة مضان من جميع الخلايا داخل السكان العلاج ثم المرسومة في هذا الشريط المخطط. وقد استخدم اختبار t للطالب لحساب احتمال الإحصائية من كل مجموعة العلاج المختلفة كثيرا عن السيطرة. ومن المثير للاهتمام، وتظهر هذه البيانات أن هناك زيادة ذات دلالة إحصائية في تخليق الحمض النووي الريبي العالمية مع مرور الوقت عندما يتم التعامل مع الخلايا U2OS نقص الأكسجة (في بعض الأحيان أكبر من 1 ساعة 30 دقيقة * ع <0.01؛. ** ع <0.05 و*** ع <0.001 و n> 30). هذه البيانات تظهر أنه في أعقاب فترات أطول من العلاج نقص الأكسجة، الخلية يركز جهوده على إنتاج الحمض النووي الريبي حتى في هذه البيئة المعادية ميتة. أكتينوميسين D العلاج ablates تماما كثافة مضان كما هو متوقع.
الشكل 1. يستجيب النظام ألف مؤسسة الحرمين للتغيرات في الأكسجين الخلوية. في هذا نقص الأكسجة التخطيطي مبسطة تستقر مؤسسة الحرمين مغاير عن طريق منع-α مؤسسة الحرمين الهيدروكسيل (OH-) عن طريق الانزيمات prolyl هيدروكسيلاز (الدكتوراه) وpolyubquitination لاحقا من قبل فون هيبل لينداو، البروتين (VHL). النتائج استقرار مؤسسة الحرمين في تفعيل الجينات لا تعد ولا تحصى التي تساعد على الاستجابة لنقص الأكسجة الخلوية الخلية يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي B. التوليف باستخدام مقايسة نقرة-IT؛ وصفت الخلايا مع الاتحاد الأوروبي بعد العلاج رد الفعل اضغط بالكشف عن الحمض النووي الريبي التوليف التي يمكن قياسها كميا بواسطة كثافة مضان والمجهر الضوئي. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر قيود التصدير الطوعيةايون من هذا الرقم.
الشكل 2. A. قطة من أوميرو لاظهار الناتج المجهرية النموذجية التالية وضع العلامات الحمض النووي الريبي. هذا المجهر التصور الصورة وتحليل البرمجيات يمكن استخراج البيانات بسرعة وكثافة على مستوى الخلايا الفردية باستخدام ماكرو في ROI يحمل في ثناياه عوامل. وأظهرت لقطة من الإخراج من هذا الأمر في B. العالمية الحمض النووي الريبي التوليف يمكن الاستدلال على ذلك من كثافة الخلايا الفردية، ومجموعة من وهو ما يمكن ملاحظته في مؤامرة مبعثر C. A التمثيل الرسمي لهذه البيانات المجمعة يمكن أن ينظر D. * ع <0.01؛ ** ع <0.05 و*** ع <0.001 و n> 30. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الجدول 1. الكواشف والمعدات اللازمة لزراعة الخلايا U2OS.
| مكونات التفاعل | عدد Coverslips | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| انقر-IT العازلة رد فعل الحمض النووي الريبي (المكون C) | 428 ميكرولتر | 856 ميكرولتر | 1.7 مل | 2.1 مل | 2.58 مل | 4.3 مل |
| كبريتات النحاس 4 (مكون D) | 20 ميكرولتر | 40 ميكرولتر | 80 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 120 ميكرولتر | 200 ميكرولتر |
| اليكسا فلور أزيد (المعد في الخطوة 2.3) | 1.8 ميكرولتر | 3.7 ميكرولتر | 7.4 ميكرولتر | 9.3 ميكرولتر | 11.28 ميكرولتر | 18.8 ميكرولتر |
| انقر-IT رد فعل العازلة المضافة (المعد في الخطوة 2.3) | 50 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر | 250 ميكرولتر | 300 ميكرولتر | 500 ميكرولتر |
| تقريبي إجمالي حجم التداول | 500 ميكرولتر | 1 مل | 2 مل | 2.5 مل | 1.5 مل | 5 مل |
. الجدول 2 التصوير RNA الكوكتيلات رد فعل عدة: مرجع الجدول بالتفصيل نسبة مكونات مزيج الرئيسي لتفاعل عدة التصوير الحمض النووي الريبي وفقا لعدد من coverslips لتكون ملطخة.
| Fluorophore | الإثارة (نانومتر) | الانبعاثات (نانومتر) |
| فلور اليكسا 488 | 495 | 519 |
| هويشت 33342، منضما إلى الحمض النووي | 350 | 461 |
. الجدول 3 الإسفار / الإثارة ماكسيما الانبعاثات: التقريبي مضان / الإثارة القصوى لانبعاث اليكسا فلور صبغة وهويشت 33342 منضمة إلى الحمض النووي.
Discussion
وصفناها استخدامنا لعدة التصوير الحمض النووي الريبي لدراسة آثار نقص الأكسجين على توليف الحمض النووي الريبي في عظمية (U2OS) الخلايا. هذا الأسلوب هو بسيط نسبيا ويوفر بيانات حول النسخ العالمية على مستوى خلية واحدة. نحن تعديل البروتوكول التقليدي لهذه المجموعة لدمج الوسم في غرفة نقص الأكسجة. على حد علمنا هذا هو أول تقرير عن استخدام هذه التقنية لقياس التغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي في نقص الأكسجة. عدة التصوير الحمض النووي الريبي التي استخدمناها هي مناسبة للتجريب في نقص الأكسجين لأنه لا يتطلب أي نظائر مشعة ومتوافق من الناحية الفنية مع القيود المفروضة على العمل في محطة عمل الغلاف الجوي للرقابة. المشاكل المشتركة مع هذا التثبيت كفاءة تقنية القلق ووضع العلامات من العينة. فمن المهم للغاية أن PFA تستخدم لإصلاح العينة هو جديد ويتم تنفيذ الخطوات غسل أن متابعة رد فعل 'فوق' كما هو موضح لضمان انخفاض تلوين الخلفية من العينة. إذا بackground يصبح مضان مشكلة فمن المستحسن أن يغسل مرة أخرى مع 1 مل التصوير RNA العازلة شطف رد فعل عدة بعد الخطوة 2.7.4.
عدة التصوير RNA المذكورة هنا يمثل تقدما كبيرا في تكنولوجيا التصوير RNA من حيث سهولة الاستخدام والخصوصية وسرعة رد الفعل. وهذه التقنية محدودة في المقام الأول من خلال الوقت الذي يستغرقه لتسمية العينة. يتطلب عدة التصوير RNA فترة الوسم 1 ساعة يمنع فحص التغيرات السريعة في الحمض النووي الريبي العالمية التي من شأنها أن تحدث عادة في غضون هذا الإطار الزمني. ولهذا السبب يقتصر لدينا نقطة لأول مرة إلى 1 ساعة و 15 دقيقة. ويرتبط تقنية مع قليل من القيود الأخرى التي تتعلق إلى حد كبير إلى كاشف التوافق مع علامات الفلورسنت الأخرى، على سبيل المثال، هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي غير متوافق مع تلطيخ phalloidin.
وتستند جميع النهج الحالي لدراسة تخليق الحمض النووي الريبي في الخلايا على إدماج النيوكليوسيدات تعديل فيالحمض النووي الريبي الوليدة وكشف عن تسميات أدرجت بوسائل مختلفة. واستند النهج الرائد على استخدام السلائف الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع تليها الكشف مع تصوير الإشعاع الذاتي. أدت هذه الطريقة إلى اكتشاف مراحل دورة الخلية والنتائج الهامة الأخرى؛ ومع ذلك، فإنه لديه الكثير من العيوب مثل طبيعة مرهقة من العمل الإشعاعي، مرات التعرض الطويل والصور منخفضة الدقة من تصوير الإشعاع الذاتي 6. تقدم المقبلة في مجال استغلال وسائل كيمياء مناعية للقضاء على ضرورة النشاط الإشعاعي. وقد وصفت من قبل RNA إدماج برو تليها الكشف كيمياء مناعية. ومع ذلك، الأجسام المضادة كفاءة الربط المطلوبة تمسخ الحمض النووي لتحسين فرص الحصول على الحمض النووي الريبي أو التي تسببت في فقدان مورفولوجيا الخلايا وتلف الحواتم من العديد من البروتينات، ومنع مزيد من الكشف عنها مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى 13. إدخال التكنولوجيا 'نقرة الكيمياء "مبسطة الخطوة الكشف ورانه إجراء مقارنة لتصوير الإشعاع الذاتي وكيمياء مناعية. وتستند هذه التقنية على أزيد-آلكاين Huisgen إضافة حلقية رد فعل حيث آلكاين محطة من 5 ethyniluridine يتحد مع أزيد مترافق مع fluorophore في وجود النحاس (I). رد فعل غير محددة، السريع، لا يتطلب أي خطوات إضافية، ومتوافق بسهولة مع الكشف عن immunochemical من مكونات الخلية الأخرى.
باستخدام هذه التكنولوجيا التصوير RNA أظهرنا أن الخلايا، في نفس السكان أحادي الطبقة، لديهم مستويات مختلفة توليف الحمض النووي الريبي في استجابة لنقص الأكسجة. نحن تقييد تجربتنا لدراسة تأثير إنتاج الحمض النووي الريبي فقط؛ ومع ذلك، فمن الممكن تماما مع هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي لأداء المعدلة، ردود فعل متعددة إضافية تسمح لإجراء تحليل أكثر تعقيدا من إنتاج الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، وتلطيخ الثانوية باستخدام الأجسام المضادة المحددة للعلامات من النسخ النشطة مثل مستويات الحمض النووي الريبي بوليميراز فسفرته الثاني أو حتى مكونات translaآلات نشوئها لتعطي مؤشرا لمقدار هذا الحمض النووي الريبي المنتجة حديثا أن يتم تحويلها إلى بروتين ممكنة. يمكن اختبار البروتينات إضافية، مثل أكتين، وهو البروتين الذي لا ينبغي أن تتغير بشكل ملحوظ مع نقص الأكسجة، كعنصر تحكم إضافية. علاوة على ذلك، يمكن اختبار أنواع مختلفة من الخلايا، كما أنه من المرجح جدا أن الخلايا المختلفة سوف يكون مختلفا معدلات تخليق الحمض النووي الريبي وحتى استجابات مختلفة لنقص الأكسجة.
استخدام هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي واضحة تماما شريطة أن يتم تنفيذ الخطوات كما هو موضح. الخطوات الحاسمة في البروتوكول ينطوي الطلاء الخلية، تثبيت الخلية وتلطيخ والحصول على الصور. من المهم أن لوحة الخلايا في كثافة وصفها لمنع فوق أو تحت التقاء في التجريب والتي سوف تؤثر تأثيرا كبيرا على النتيجة. من المهم أيضا لاستخدام تثبيتي الطازجة، وضمان أفضل 'قطة' من الخلية يؤخذ واتخاذ الحيطة والحذر عند غسل الخلايا بعد تلطيخ للحد من البكالورياkground إلى مستوى مقبول لتحليل كفاءة. أخيرا، وطريقة الحصول على الصور أمر في غاية الاهمية لتحقيق الصور التي هي من نوعية جيدة بما فيه الكفاية لتحليلها لاحقا. نوصي باستخدام أفضل مجهر الضوء المتاح لفحص عينات مثل بصريا كما المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول والذي يتوفر في معظم مراكز الأبحاث المكثفة على الصعيد العالمي.
Disclosures
JRS هو مؤسس جلينكو البرمجيات، وشركة، وهي شركة تجارية مقرها الولايات المتحدة المفتوحة المصدر التي تساهم في أوميرو.
Acknowledgments
JB هو CRUK زميل السريرية، وكما هو الطالب ويلكوم ترست دكتوراه، ويتم تمويل المختبر ريال عن طريق زمالة أبحاث أول CRUK (C99667/A12918). وأيد هذا العمل من قبل اثنين من ويلكوم ترست جوائز الاستراتيجية (097945/B/11/Z و095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
