Summary
Vi beskriver en teknik til analyse af den globale RNA-syntese i hypoxi hjælp billeddannelse. Click-kemi mærkning af RNA har ikke tidligere været udført under hypoxi og tillader visualisering af den globale RNA-ændringer på enkelt celle niveau. Denne tilgang supplerer den eksisterende gennemsnit RNA-teknikker, der muliggør direkte visualisering af celle-til-celle ændringer i den globale RNA-syntese.
Abstract
Hypoxi eller sænkning af ilt tilgængelighed er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. På molekylært niveau celler indlede en bestemt transkriptionel program for at montere en passende og koordineret cellulært respons. Cellen har flere oxygen sensor enzymer, der kræver molekylært oxygen som cofaktor for deres aktivitet. Disse spænder fra prolyl-hydroxylaser til histon demethylases. De fleste undersøgelser, der analyserer cellulære reaktioner på hypoksi er baseret på cellepopulationer og gennemsnitlig undersøgelser og som sådan enkelt celle analyse af hypoxiske celler sjældent udført. Her beskriver vi en metode til analyse af den globale RNA-syntese på enkelt celle niveau i hypoxi ved hjælp af Click-iT RNA imaging kits i et ilt styret arbejdsstation, efterfulgt af mikroskopi analyse og kvantificering. Brug af cancerceller udsat for hypoxi for forskellige længder af tid, RNA mærket og måles i hver celle. Denne analyse giver mulighedvisualisering af tidsmæssige og celle-til-celle ændringer i den globale RNA-syntese efter hypoxisk stress.
Introduction
Hypoxia (lav ilt spændinger) opstår, når den normale iltforsyning til et væv er forstyrret. Environmental ilt er både et næringsstof og en signalering molekyle, der giver vigtige signaler for mange celletyper. Ændringer i miljømæssig ilt sanses af en gruppe dioxygenases der styrer aktiviteten af en væsentlig transskription faktor familie kendt som Hypoxia Inducerbare Factors (HIFs). De HIFs er sammensat af to underenheder, α og β. Der er tre kendte isoformer af HIF-α (1, 2, og 3) og multiple splejsningsvarianter af HIF-1β. HIF-1β udtrykkes konstitutivt og ikke reguleret af miljømæssige ilt niveau 1. HIF-α familiemedlemmer er dynamisk reguleret af en klasse af prolyl-hydroxylaser (ph.d.) og hindrende HIF (FIH); begge kræver oxygen som en co-faktor til at katalysere hydroxyleringen af HIF-α 2,3. I normoxi HIF-α familiemedlemmer hydroxyleres og mærket til proteosomal nedbrydning af E3-ligase, von Hippel Lindau (VHL). I hypoxi de ph.d.er og FIH er inaktive eller har en reduceret aktivitet. HIF-α isoformer bliver stabiliseret, danner en heterodimer med HIF-1β og påvirke transkription af gener, der giver den cellulære reaktion på den hypoxisk miljø (figur 1A) 4..
Aktuelle teknikker til RNA-analyse fokus på kvantificering af midlede værdier på tværs af en given celle population. Celler reagerer på en hypoxisk stimulus ved at indlede transskription af et utal af gener, som tillader dem at tilpasse sig fjendtligt miljø 5.. Men hypoxi ofte eksisterer som en gradient, og celler i et hypoxisk miljø er ikke omfattet af en ensartet hypoxisk stimulus. Vi beskriver en gennemførelse af Click-iT RNA imaging kits i en ilt styret arbejdsstation til at undersøge den globale RNA-syntese på enkelt celle niveau i hypoxi.
RNA fotokonduktorsætet anvender en enlkyne-modificerede nucleosid, 5-ethynyl uridin (EU) og kemoselektiv ligering til at muliggøre påvisning af den globale RNA-syntese tidsmæssigt og rumligt i celler og væv 6. Kort fortalt behandles celler med hypoxi og dyrket i nærværelse af EU. De bliver så fast og permeabiliseres og EU-inkorporering i spirende RNA påvises ved kemoselektiv ligatur af EU med en azid indeholdende farvestof. En typisk arbejdsgang for denne reaktion er vist i figur 1B. Vi brugte RNA imaging kit til at undersøge RNA-syntese på enkelt celle niveau, der førte fra behandling med hypoxi.
Den lille størrelse af alkynen tag muliggør effektiv inkorporering af det modificerede nukleosid i RNA specifikt. Den kemoselektiv ligatur eller 'klik' reaktion er yderst effektiv, hurtig og specifik 7-10. Alle reaktionskomponenterne er bioinert og reaktionen kræver ingen ekstreme temperaturer eller opløsningsmidler. Klikket reaktion negererkravet om konventionelle radiomærkning og giver mulighed for direkte visualisering af resultaterne, da produktionen er lys. Desuden kan detektionsmolekyle let trænge komplekse prøver giver mulighed for multiplex analyse, herunder antistoffer til påvisning af RNA-interaktiv proteiner. Denne RNA imaging assay er kompatibel med organiske farvestoffer, herunder Alexa Fluor og fluorescein (FITC).
Vi målte ændringen i RNA-syntese efter behandling af vores celler ved hjælp af en implementering af den åbne mikroskopi miljø for fjerne objekter (Omero). Omero er open source-software, som findes på http://openmicroscopy.org/ . Dette mikroskop billede visualisering og analyse software giver adgang til og brug af en bred vifte af biologiske data, herunder styring af flerdimensionale, heterogene datasæt. Klienten program giver remote visualisering og analyse af komplekse biologiske billeddata 11;vi brugte det til at kvantificere de visuelle ændringer i den globale og enkelt celle RNA-syntese. Disse data og de skridt, der er nødvendige for at analysere vores RNA imaging eksperiment ved hjælp af denne mikroskop billede visualisering og analyse software er vist nedenfor.
Vi kiggede på ændringer i den globale RNA-syntese efter behandling af human osteosarcoma (U2OS) celler med hypoxi i op til 24 timer. I alle forhold, påviste vi celle-til-celle variation i niveauet af RNA-produktion. Korte tider af hypoxi eksponering ikke medfører væsentlige ændringer af niveauet for spirende RNA i cellerne. Men eksponering til 24 timer hypoxi resulterede i en betydelig stigning i mængden af RNA produceret i cellerne. De fleste af de cellulære reaktioner på hypoksi måles efter lange perioder med eksponering, såsom 4 til 24 timer. Der er dog nogle mekanismer på plads langt tidligere, for eksempel; NF-KB-aktivering forekommer inden for 5-15 min hypoxi eksponering 12. Undersøgelse kortere hypoXia eksponeringstider er derfor berettiget og kunne aflede opmærksomheden fra mere komplicerede reaktioner såsom cellecyklus og apoptose.
Protocol
1. Celledyrkning og behandling
- Saml de reagenser og udstyr, der er anført i tabel 1 til kultur menneskelig osteosarcoma (U2OS) celler. Forbered alle reagenser og udføre alle vævsdyrkningsteknikker i laminar air flow hætte for at sikre sterilitet
- Forbered dyrkningsmediet som følger: Tilsæt 50 ml FCS, 5 ml L-glutamin og 5 ml penicillin / streptomycin i DMEM for at opnå slutkoncentrationer på 10% (FCS), 2 mM (L-glutamin), 50 U / ml ( penicillin) og 50 U / ml (streptomycin). Opvarm dyrkningsmedium ved 37 ° C i et vandbad.
- Forbered celler til behandling:
- Sterilisere flere dækglas i 70% ethanol, lad lufttørre og placere en på bunden af seks 3,5 cm plader.
- Fordyb dækglassene i 2 ml opvarmet fuldstændig DMEM (37 ° C), og tryk ned med dækglasset pincet til at sikre, at de forbliver klæbet til bunden af brøndene.
- Afmonter U2OS celler fra deres væv kulture plade ved vask en gang med 3 ml PBS, anvender 4 ml opvarmet 0,05% trypsin-EDTA (1%) og inkubering ved 37 ° C i 7 min.
- Resuspender cellerne i 6 ml opvarmet komplet DMEM til at inaktivere trypsin-EDTA og tælles ved hjælp af et hæmocytometer.
- Plade 2 x 10 5 celler til hver af de 3,5 cm plader udarbejdet i punkt 1.3.1. Vip forsigtigt pladen for at sikre en jævn celle distribution. Lade cellerne klæbe natten over før behandling.
- Behandl celler ved at placere fire 3,5 cm plader i hypoxi arbejdsstation og efterlade de to andre 3,5 cm plader i inkubatoren ved 37 ° C under normale oxygenbetingelser. Vær klar til at påbegynde RNA mærkning assay under behandlede forhold (i hypoxi kammer til hypoxi behandlede celler) 1 time før hypoxi behandlingen slutter.
- Udsætte celler for hypoxi i 1 time 15 minutter, 1 time 30 minutter, 2 timer og 24 timer. Disse tidspunkter er fleksibel og brugervenlig bestemt.
- Brug en normoxic 3,5 cm plade som den positive kontrol og et normoxisk 3,5 cm plade behandlet med actinomycin D (10 ug / ml slutkoncentration) i 4 timer, som den negative kontrol. Actinomycin D er en hæmmer af den globale RNA-syntese.
Forsigtig:
Hoechst 33342 er et kendt mutagen.
DMSO er kendt for at gøre det lettere for organiske molekyler i vævene.
NaOH er ætsende.
HCI er ætsende.
Paraformaldehyd er meget giftigt for alle dyr og kan medføre døden hos mennesker.
Triton X-100 kan forårsage hudirritation efter direkte kontakt.
Actinomycin D er giftigt ved kontakt med huden eller indtagelse.
Tage passende forholdsregler ved håndtering af alle farlige kemikalier.
Click-iT Assay 2.
- Saml følgende reagenser, der er nødvendige udover Click-iT assaykit: phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,2 til 7,6, 3,7% paraformaldehyd (PFA) i PBS, 1% Triton X-100 I PBS, deioniseret vand (dH2O), dimethylsulfoxid (DMSO), 10 M natriumhydroxid (NaOH) og 37% saltsyre (HCI); Valgfrit - pH-indikator strips.
- Forbered en frisk PFA stamopløsning før udførelse af Click-iT reaktion således:
- Sæt 1,85 g PFA, 3,5 ml dH2O og 10 pi of10 M NaOH i et 50 ml Falcon-rør. Kog 300-400 ml H2O i et stort bægerglas i mikrobølgeovnen for at gøre et vandbad og står dette i et stinkskab.
- Anbring 50 ml Falcon i vandbadet og ryst forsigtigt i 10 min, med jævne mellemrum frigiver låget, indtil PFA er opløst.
- Syringe PFA opløsningen gennem et 0,2 um filter til en anden 50 ml Falcon-rør, hvilket resulterer i en 37% opløsning.
- Fortynd denne 10x ved at tilføje PBS og bringe pH til 6,8 ved tilsætning af ca 12 pi koncentreret HCI. Option: Bekræft korrekte pH med indikatoren strips i stinkskab.
- Anvendes straks eller o gemmevernight ved 4 ° C.
- Forbered stamopløsninger af RNA imaging kit som følger:
- Tilføj 373 pi dH2O til komponent A resulterer i en stamopløsning på 100mM EU. Opbevar ved -20 ° C i op til en måned.
- Tilføj 85 pi DMSO til komponent B (Alexa Fluor 594) og blandes ved pipettering eller vortex. Opbevare såvel ved -20 ° C i op til et år.
- Tilsæt 2 ml dH2O til komponent E til at skabe en 10X opløsning af RNA imaging kit reaktion buffer additiv. Opbevares ved -20 ° C i op til et år, kasseres når løsningen udvikler en brun farve.
- Mærkning af celler med EU: Forbered en 2X brugsopløsning af EU fra 100 mM lager forberedt i trin 2.3 i forvarmet komplet medium (37 ° C) Udfør resten af dette trin og trin 2.5 i hypoxi kammer for celler behandlet med hypoxi. . fortyndes 1X ved tilsætning af et lige volumen af denne 2X brugsopløsning til medierne containing celler. Der inkuberes i 1 time under behandling celledyrkningsbetingelser.
- Cellefiksering: Vask hver brønd en gang med PBS, og der tilsættes 1 ml 3,7% PFA bestanden forberedt i trin 2.2 ovenfor under behandling forhold. Inkuber i 15 minutter under behandlingsbetingelser. Behandlet med hypoxi prøver kan fjernes fra hypoxi kammeret ved dette punkt. Fjern fiksativ og vask hver brønd en gang med PBS (Vær omhyggelig med at afhænde PFA spilde ansvarligt). Udfør de næste skridt ved stuetemperatur.
- Permeabilisering: Fjern vaskeopløsningen og tilsættes 1 ml 1% Triton X-100 i PBS til hver brønd. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern permeabilisering buffer og vask hver brønd en gang med PBS.
- Mærket RNA Detection:
- Forbered en frisk 1X brugsopløsning af RNA fotokonduktorsætet reaktion buffer additiv ved at fortynde 10X opløsning (tilberedt i trin 2.3) 1:10 i dH 2 O.
- Forbered RNA imaging kitreaktion cocktail i henhold til tabel 2 til brug straks efter tilberedning.
- Fjern vaskeopløsningen og tilsæt 500 ul RNA imaging kit reaktion cocktail til hver prøve. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Fjern RNA imaging kit reaktion cocktail og vask en gang med 1 ml RNA fotokonduktorsætet reaktion skyllepuffer (komponent F), og fjern derefter RNA imaging kit reaktion skyllepuffer.
- Valgfri multiplex reaktion: Udfør yderligere antistof mærkning af prøver på dette tidspunkt i henhold til producentens anbefalinger.
- DNA Farvning: Vask prøver med PBS derefter fjerne vaskeopløsningen. Fortynd Hoechst 33342 (Component G) 1:1000 i PBS. Tilsæt 1 ml fortyndet Hoechst 33342 til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Fjern Hoechst 33342-opløsning og vaske cellerne to gange med PBS. Fjern vask solution og gå videre til lysmikroskopi.
3.. Lysmikroskopi
- Mount Dækglas:
- Til 10 pi monteringsmedium på midten af en standard objektglas.
- Placer dækglasset celle nedad på midten af objektglasset til at dække alikvot af monterings medium. Sørg for at undgå dannelse af bobler i montage medie, da dette vil tilsløre efterfølgende billede erhvervelse.
- Stick dækglasset til objektglasset ved at anvende klare neglelak til sin omkreds. Lad tørre i 5 minutter ved stuetemperatur. Beskyttet mod lys. Prøver kan opbevares ved -20 ° C efter montering.
- Billede erhvervelse: Anskaf billeder ved hjælp af et bredt felt mikroskop stand fluorescensdetektion. Anslået fluorescens / excitation emission maxima for Alexa Fluor farvestof og Hoechst 33342 er bundet til DNA, er vist i tabel 3..
- Perform Imaging ved hjælp af en 40X/1.30 NA olieimmersion linse og tage billeder med en afkølet CCD-kamera.
4.. Dataanalyse
- Deconvolve billeder ved hjælp af billedbehandling software (se Materialer tabel) forud for import til Omero klienten. Normalisere rendering indstillinger for alle billeder i det samme eksperiment i mikroskop billede visualisering og analyse software ved at anvende rendering indstillinger fra kontrol normoxiske celler til alle andre forhold.
- Brug regionen af interesse (ROI) værktøj i mikroskop billede visualisering og analyse software (se Materialer tabel) for at vælge kerner fra hvert billede. Anskaf gennemsnitlige intensiteter for hver ROI og beregne gennemsnit og standardafvigelse for hver tilstand ved at vælge intensitet analyse option, herunder en række mellem 30-50 celler.
- Construct scatter plots hjælp af en data graftegning software (se Materialer tabel) ved at plotte alle individuelle middelværdier intensitet værdierne i trin 4.2 to afspejle variation mellem celler under hver betingelse. Alternativt konstruere søjlediagrammer til at repræsentere gennemsnitlig middelværdi intensitet plus standardafvigelsen for spirende RNA.
Representative Results
En skematisk af RNA fotokonduktorsætet Reaktionen er vist i figur 1B. Vi brugte denne reaktion for kvantitativt at bestemme total RNA-syntese i U2OS celler efter behandling med hypoxi på både en individuel (enkelt celle) og globalt niveau (population af celler). Cellerne blev behandlet med hypoxi og dyrket i nærværelse af EU. De blev derefter fikseret og permeabiliseres og EU-inkorporering blev opdaget af kemoselektiv ligatur af EU med en azid indeholdende farvestof. Dette "klik" reaktion resulterer i en fluorescensemission, der kan detekteres og kvantificeres ved hjælp af fluorescens lysmikroskopi. Figur 2A viser et typisk resultat af dette forsøg. Fluorescens-mærkede celler pseudocolored rød og billedet er åbnet i det åbne mikroskopi miljø for fjerne objekter (Omero). Dette mikroskop billede visualisering og analyse software har en indbygget ROI værktøj, der kan bruges til at vælge individuelle sub-cellulær strukturturer og kvantitativt analysere billedet intensitet inden for det valgte område. Et typisk eksempel på de data output, efter brug af dette værktøj i klient program kan ses i figur 2B; enkelte celle intensiteter vist ved siden af et repræsentativt billede fra forsøget, der fungerer som en visuel kontrol for at sikre data gyldighed.
De enkelte celle fluorescensintensiteter kan afbildes som et punktdiagram for at vise fordelingen af de enkelte cellulære intensitet i den behandlede cellepopulation. Et eksempel på denne type graf ses i figur 2C. Plotte intensitet data på denne måde er nyttigt, fordi det giver mulighed for en hurtig sammenligning af behandlingsresultater og viser klart den betydelige forskelle i behandling cellepopulation, der ellers er tildækket ved hjælp af standard data repræsentation. Svaret heterogenitet er interessant i dette eksperiment, fordi selv om en ensartet hypoxisk stimulus var enpplied til cellerne, er det klart, at hver celle fra samme monolag population reagerer forskelligt på denne stimulus.
Figur 2D viser den samlede resultat fra vores eksperiment. Fluorescensintensiteterne fra alle celler i en behandling befolkning blev i gennemsnit og derefter plottet i denne søjlediagram. En studerende t-test er blevet brugt til at beregne den statistiske sandsynlighed for hver behandlingsgruppe afviger væsentligt fra kontrollen. Interessant nok viser disse data, at der er en statistisk signifikant stigning i den globale RNA-syntese over tid, når U2OS celler behandles med hypoxi (ved gange større end 1 time 30 min * p <0,01. ** P <0,05 og *** p <0,001 og n> 30). Disse data viser, at der efter længere perioder med hypoxi behandling, cellen fokuserer sin indsats på produktionen af RNA selv i denne fjendtlige hypoxisk miljø. Actinomycin D behandling helt ablates fluorescens intensitet som forventet.
Figur 1.. A. HIF-systemet reagerer på ændringer i cellulære ilt. I denne forenklede skematiske hypoxi stabiliserer HIF heterodimeren ved at forhindre HIF-α hydroxylering (-OH) med prolyl hydroxylase enzymer (ph.d.) og dets efterfølgende polyubquitination af von-Hippel Lindau protein (VHL). HIF stabilisering resulterer i aktivering af talrige gener, der hjælper celle reagerer på cellulær hypoksi B. RNA-syntese kan påvises ved hjælp af klik-IT assay.; celler er mærket med EU efter behandling Click reaktion registrerer RNA-syntese, der kan kvantificeres ved fluorescens intensitet og lysmikroskopi. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 2.. A. Screenshot fra Omero at vise typiske mikroskopiske output efter RNA mærkning. Dette mikroskop billede visualisering og analyse software kan hurtigt udtrække intensitet data på en enkelt celle niveau ved hjælp af dens indbyggede ROI makro. Et skærmbillede af output fra denne kommando vises i B. Global RNA-syntese kan udledes enkelte celle intensitet, kan rækken af som ses i punktdiagram C. En formel repræsentation af disse aggregerede data kan ses D. * p <0,01; ** P <0,05 og *** p <0,001 og n> 30.. Klik her for at se større billede.
| Cellekulturreagenser |
| Phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,2 til 7,6 |
| Dulbeccos Modificerede Eagles Medium (DMEM) |
| Føtalt kalveserum (FCS) filtersteriliseret |
| Penicillin / streptomycin |
| L-glutamin |
| 0,05% trypsin-EDTA (1%) |
| 70% ethanol |
| Actinomycin D (1 pg / pl lager) |
| Cellekultur Udstyr |
| Steril Pasteur pipetter |
| En række cellekultur-behandlede plast ware egnet til vedligeholdelse og behandling af celler i kultur |
| Vandbad indstillet på 37 ° C |
| Laminar air flow-hætte |
| Inkubator indstillet til 37 ° C, 5% CO 2 |
| Hypoxi Workstation ved 37 ° C, 5% CO 2, 1% O 2 |
| Dækglas |
| præcision pincet |
| Hemocytometer |
Tabel 1.. Reagenser og udstyr, der kræves til dyrkning af U2OS celler.
| Reaktionskomponenter | Antal Dækglas | |||||
| 1 | 2 | 4. | 5. | 6 | 10 | |
| Click-iT RNA reaktion buffer (komponent C) | 428 pi | 856 pi | 1,7 ml | 2,1 ml | 2,58 ml | 4,3 ml |
| CuSO4 (komponent D) | 20 pi | 40 ul | 80 pi | 100 pi | 120 pi | 200 pi |
| Alexa Fluor Azid (Udarbejdet i trin 2.3) | 1,8 pi | 3.7 pi | 7.4 pi | 9.3 pi | 11.28 pi | 18.8 pi |
| Click-iT reaktion buffer additiv (Udarbejdet i trin 2.3) | 50 pi | 100 pi | 200 pi | 250 pi | 300 pi | 500 pi |
| Omtrentlige samlede Volume | 500 pi | 1 ml | 2 ml | 2,5 ml | 1,5 ml | 5 ml |
. Tabel 2 RNA imaging kit reaktions cocktails: Vergleichstabellen beskriver forholdet mellem master-mix komponenter til RNA fotokonduktorsætet reaktion i forhold til antallet af dækglas skal farves.
| Fluorophor | Excitation (nm) | Emission (nm) |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 |
| Hoechst 33342, bundet til DNA | 350 | 461 |
. Tabel 3 Fluorescens / excitation emission maxima: Cirka fluorescens / excitation emission maksimal for Alexa Fluor farvestof og Hoechst 33342 bundet til DNA.
Discussion
Vi har beskrevet vores brug af en RNA imaging kit til at undersøge effekten af hypoxi på RNA-syntese i osteosarkom (U2OS) celler. Denne teknik er forholdsvis ligetil og giver oplysninger om den globale transskription på en enkelt celle niveau. Vi modificerede konventionelle protokol til dette kit til at inkorporere mærkning på en hypoxi kammer. Til vores kendskab er dette den første rapport om anvendelsen af denne teknik til at måle ændringer i RNA-syntese i hypoxi. RNA fotokonduktorsætet vi brugte er velegnet til eksperimenter i hypoxi, da det kræver ingen radioaktive isotoper og er teknisk kompatible med de begrænsninger af at arbejde i et kontrolleret atmosfære arbejdsstation. Almindelige problemer med denne teknik bekymring effektiv fiksering og mærkning af prøven. Det er yderst vigtigt, at PFA bruges til at fastsætte prøven er frisk og vasketrinene, der følger 'klik' reaktion udføres som beskrevet for at sikre lav baggrund farvning af prøven. Hvis bAGGRUND fluorescens bliver et problem, anbefales det at vaske en gang mere med 1 ml RNA fotokonduktorsætet reaktion skyllepuffer efter trin 2.7.4.
RNA fotokonduktorsætet nævnt her udgør et betydeligt fremskridt i RNA imaging-teknologi i form af brugervenlighed og specificitet og hastigheden af reaktionen. Denne teknik er primært begrænset af den tid det tager at mærke prøven. RNA fotokonduktorsætet kræver en 1 hr mærkning periode, der forhindrer behandlingen af hurtige ændringer i den globale RNA, der normalt ville opstå inden for denne tidsramme. Det er grunden til vores første tidspunkt er begrænset til 1 time og 15 min. Teknikken er forbundet med nogle andre begrænsninger, der stort set vedrører reagens kompatibilitet med andre fluorescerende markører, for eksempel RNA'et fotokonduktorsætet er ikke kompatibel med phalloidin-farvning.
Alle eksisterende tilgange studere RNA-syntese i celler er baseret på inkorporering af modificerede nukleosider ispirende RNA og påvisning af inkorporerede etiketter ved forskellige midler. Den banebrydende metode var baseret på anvendelse af radioaktivt mærkede RNA forstadier efterfulgt af detektion med autoradiografi. Denne metode har ført til en opdagelse af cellecyklus faser og andre vigtige resultater; men det har en masse ulemper, såsom den omstændelige radioaktivitet arbejde, lange eksponeringstider og lave billeder af autoradiografi 6 opløsning. Den næste fremskridt på området udnyttes hjælp af immunkemi at eliminere nødvendigheden af radioaktivitet. RNA blev mærket ved inkorporering af Bru efterfulgt af immunokemi detektion. Men effektiv antistofbinding krævede nukleinsyre denaturering at forbedre adgangen til DNA eller RNA, der forårsagede tab af celle morfologi og skadet epitoper af mange proteiner, forhindrer deres videre detektion med fluorescens-mærkede antistoffer 13. Indførelsen af 'klik kemi "-teknologi forenklet skridt og t afsløringhan procedure i forhold til autoradiografi og immunkemi. Teknologien er baseret på azid-alkyn Huisgen cycloaddition reaktion, hvor terminal alkyn af 5-ethyniluridine binder med azid konjugeret med fluoroforen i nærvær af Cu (I). Reaktionen er specifik, hurtig, ikke kræver nogen yderligere skridt, og er let forenelig med immunkemisk påvisning af andre celle vælgere.
Ved hjælp af denne RNA-imaging-teknologi vi viste, at celler, i det samme monolag befolkning har forskellige RNA-syntese niveauer som respons på hypoxi. Vi begrænset vores eksperiment for at undersøge effekten af kun RNA produktion; det er imidlertid fuldt ud muligt med denne RNA fotokonduktorsætet at udføre modificerede, yderligere multipleksreaktioner der giver mulighed for en mere kompleks analyse af RNA-produktion. For eksempel sekundær farvning under anvendelse af et antistof specifikt for markører af aktiv transkription, såsom niveauer af phosphoryleret RNA-polymerase II eller endog dele af oversættelsetion maskiner at give en indikation af størrelsen af denne nyligt producerede RNA, som omdannes til protein er mulige. Yderligere proteiner, såsom actin, et protein, der ikke ændre sig væsentligt med hypoxi, kan afprøves som en yderligere kontrol. Endvidere kan forskellige celletyper skal testes, som det er meget sandsynligt, at forskellige celler vil have forskellige RNA syntesehastigheder og endda forskellige reaktioner på hypoxi.
Brug af dette RNA fotokonduktorsætet er ganske ligetil billede trinnene udføres som beskrevet. Kritiske trin i protokollen indebærer celleudpladning, celle fiksering og farvning og image erhvervelse. Det er vigtigt at pladen cellerne ved den beskrevne tæthed for at forhindre over eller under konfluens ved eksperimenter, som væsentligt vil påvirke resultatet. Det er også vigtigt at bruge frisk fiksativ, sikrer den bedste "øjebliksbillede" af cellen er taget, og at passe på, når du vasker cellerne efter farvning at reducere background til et niveau, der er acceptabelt for en effektiv analyse. Endelig har den metode til billedet købet er yderst vigtigt at opnå billeder, der er af en god nok kvalitet til efterfølgende analyse. Vi anbefaler at bruge det bedste lys mikroskop til rådighed til at undersøge prøver optisk såsom mikroskop anvendt i denne protokol, som er tilgængelige på de fleste forskningsintensive centre globalt.
Disclosures
JRS er grundlægger af Glencoe Software, Inc., et open source USA-baserede kommerciel virksomhed, der bidrager til Omero.
Acknowledgments
JB er en CRUK klinisk fyr, AS er et Wellcome Trust ph.d.-studerende, SR lab er finansieret af en CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Dette arbejde blev støttet af to Wellcome Trust Strategic Awards (097945/B/11/Z og 095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
