Summary
Nous décrivons une méthode pour l'analyse de la synthèse d'ARN à une hypoxie globale en utilisant l'imagerie. Cliquez-chimie étiquetage de l'ARN n'a pas déjà été effectuée en vertu de l'hypoxie et permet la visualisation des changements globaux de l'ARN au niveau d'une seule cellule. Cette approche vient compléter les techniques d'ARN moyennes existantes, permettant la visualisation directe des changements de cellule à cellule dans la synthèse globale de l'ARN.
Abstract
Hypoxie ou l'abaissement de la disponibilité de l'oxygène est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Au niveau moléculaire, les cellules lancer un programme de transcription particulier en vue de préparer une réponse cellulaire appropriée et coordonnée. La cellule possède plusieurs enzymes de capteur d'oxygène qui nécessitent de l'oxygène moléculaire en tant que cofacteur pour leur activité. Ces vont de prolyl-hydroxylase à déméthylases des histones. La majorité des études sur l'analyse de la réponse cellulaire à l'hypoxie sont basées sur des populations cellulaires et des études moyennes, et en tant que telle analyse cellulaire unique de cellules hypoxiques sont rarement effectué. Ici, nous décrivons une méthode d'analyse de la synthèse globale de l'ARN au niveau de la cellule unique en hypoxie en utilisant Click-iT kits de visualisation de l'ARN dans un poste de travail à oxygène contrôlé, suivie d'une analyse par microscopie et la quantification. Utilisation de cellules cancéreuses exposées à une hypoxie pendant des durées différentes, l'ARN est marqué et mesuré dans chaque cellule. Cette analyse permetla visualisation de et de cellule à cellule changements temporels dans la synthèse globale de l'ARN suivantes stress hypoxique.
Introduction
L'hypoxie (les tensions faibles en oxygène) se produit lorsque l'apport d'oxygène normale à un tissu est perturbé. L'oxygène est à la fois un environnement nutritif et une molécule de signalisation, en fournissant des signaux importants pour de nombreux types cellulaires. Les variations de l'oxygène de l'environnement sont détectées par un groupe de dioxygénases qui contrôlent l'activité d'une famille de facteurs de transcription essentiels connus comme les facteurs inductibles hypoxie (HIF). Les HIF sont composés de deux sous-unités α, et β. Il existe trois isoformes connues de HIF-α (1, 2, et 3) et de multiples variants d'épissage de HIF-1β. HIF-1β est exprimé de façon constitutive et non régulée par les niveaux d'oxygène de l'environnement 1. Les membres de la famille HIF-α sont dynamiquement régies par une classe de prolyl-hydroxylase (doctorat) et le facteur d'inhibition de HIF (FIH); qui exigent tous deux de l'oxygène en tant que co-facteur de catalyser l'hydroxylation de HIF-α 2,3. En normoxie les membres de la famille HIF-α sont hydroxylés et étiquetés pour proteosomal dégradation par le E3-ligase, von Hippel Lindau (VHL). Dans l'hypoxie et les doctorats FIH sont inactifs ou ont une activité réduite. Les isoformes de HIF-α deviennent stabilisé, forment un hétérodimère avec HIF-1β, et effectuer la transcription de gènes qui fournissent la réponse cellulaire à l'environnement hypoxique (Figure 1A) 4.
Les techniques actuelles pour l'analyse de l'ARN sont axés sur la quantification des valeurs moyennées dans une population cellulaire donnée. Les cellules répondent à un stimulus hypoxique en initiant la transcription d'une myriade de gènes qui leur permettent de s'adapter à son environnement hostile 5. Cependant, l'hypoxie existe souvent un gradient, et les cellules dans un environnement hypoxique ne sont pas soumis à un stimulus hypoxique uniforme. Nous décrivons une mise en œuvre des kits d'imagerie de l'ARN Cliquez-iT à un poste de travail de l'oxygène contrôlée à examiner synthèse globale de l'ARN au niveau de la cellule unique en hypoxie.
Le kit d'imagerie utilise un ARN unenucléoside lkyne modifié, 5-éthynyl uridine (UE) et la ligature chimiosélective pour permettre la détection de la synthèse globale de l'ARN temporellement et spatialement dans les cellules et les tissus 6. Brièvement, les cellules sont traitées avec une hypoxie et cultivées en présence de l'UE. Ils sont ensuite fixées et perméabilisées et l'incorporation de l'UE en ARN naissant est détecté par ligature chimiosélective de l'UE avec un colorant contenant azoture. Une procédure typique pour cette réaction est représenté sur la figure 1B. Nous avons utilisé le kit de visualisation de l'ARN pour examiner la synthèse d'ARN au niveau de la cellule unique qui a résulté d'un traitement par l'hypoxie.
La petite taille de l'étiquette alcyne permet une incorporation efficace de la nucléoside modifié en ARN spécifique. La ligature chimiosélective ou clic réaction est très efficace, rapide et spécifique 7-10. Tous les composants de la réaction sont des bio-inerte et la réaction ne nécessite aucun des températures extrêmes ou des solvants. La réaction de clic niel'obligation pour le radiomarquage classique et permet la visualisation directe des résultats puisque la sortie est lumière. En outre, la molécule de détection peut facilement pénétrer dans les échantillons complexes permettant une analyse multiplex comprenant des anticorps pour la détection de protéines d'ARN-interactif. Ce dosage de formation d'image de l'ARN est compatible avec des colorants organiques, y compris Alexa Fluor et de fluorescéine (FITC).
Nous avons mesuré la variation de la synthèse de l'ARN après un traitement de nos cellules en utilisant une implémentation de l'environnement de la microscopie ouvert pour les objets distants (OMERO). OMERO est un logiciel open-source, disponible à http://openmicroscopy.org/ . Ce logiciel microscope de visualisation d'image et d'analyse permet d'accéder à, et l'utilisation d'un large éventail de données biologiques, y compris la gestion de bases de données multidimensionnelles, hétérogènes. L'application client permet la visualisation et l'analyse de données complexes d'image biologique 11 à distance;nous l'avons utilisé pour quantifier les changements visuels dans la synthèse globale et unique de l'ARN cellulaire. Ces données et les étapes nécessaires pour analyser notre expérience d'imagerie de l'ARN à l'aide de ce microscope la visualisation des images et des logiciels d'analyse sont présentés ci-dessous.
Nous avons examiné les changements dans la synthèse globale de l'ARN après le traitement de l'ostéosarcome humain (U2OS) des cellules à l'hypoxie jusqu'à 24 h. Dans toutes les conditions, nous avons détecté une variation de cellule à cellule dans le niveau de production de l'ARN. Courts temps d'exposition à l'hypoxie n'ont pas abouti à des changements importants au niveau de l'ARN naissant dans les cellules. Toutefois, l'exposition à 24 h d'hypoxie a entraîné une augmentation significative de la quantité d'ARN produite dans les cellules. La plupart des réponses cellulaires à l'hypoxie sont mesurées suivant des périodes prolongées d'exposition, tels que les 4 à 24 heures. Cependant, certains mécanismes sont mis en place beaucoup plus tôt, par exemple; L'activation de NF-kB survient dans 5-15 min d'exposition à l'hypoxie 12. Enquête hypo courtexia temps d'exposition est donc justifiée et pourrait porter atteinte à des réponses plus complexes tels que le cycle cellulaire et l'apoptose.
Protocol
1. Culture cellulaire et le traitement
- Rassembler les réactifs et le matériel énumérés dans le tableau 1 à la culture ostéosarcome humain (U2OS) des cellules. Préparer tous les réactifs et procéder à toutes les techniques de culture de tissu dans la hotte à flux laminaire pour assurer une stérilité
- Préparer le milieu de culture comme suit: Ajouter 50 ml de FCS, 5 ml de L-glutamine et 5 ml de pénicilline / streptomycine à la DMEM pour obtenir des concentrations finales de 10% (FCS), 2 mM (L-glutamine), 50 U / ml ( pénicilline) et 50 U / ml (streptomycine). Chauffer le milieu de culture à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Préparer les cellules pour le traitement:
- Stériliser plusieurs lamelles dans 70% d'éthanol, laisser sécher à l'air et placer un sur le bas de six plaques 3.5 cm.
- Plongez les lamelles dans 2 ml réchauffés DMEM complet (37 ° C), en appuyant sur les pinces de lamelle de veiller à ce qu'elles restent collées au fond des puits.
- Détacher les cellules U2OS de leur culte des tissusure plaque par lavage une fois avec 3 ml de PBS, en appliquant 4 ml réchauffé 0,05% de trypsine-EDTA (1%) et incubation à 37 ° C pendant 7 min.
- Resuspendre les cellules dans du DMEM complet 6ml chauffé pour inactiver la trypsine-EDTA et de compter en utilisant un hémocytomètre.
- Plate 2 x 10 5 cellules à chacune des plaques 3,5 cm préparés au point 1.3.1. Secouez doucement la plaque pour assurer une distribution cellulaire même. Laisser les cellules adhérer pendant une nuit avant le traitement.
- Traiter les cellules en plaçant quatre plaques de 3,5 cm dans le poste de travail de l'hypoxie et de laisser les deux autres plaques de 3,5 cm dans un incubateur à 37 ° C dans des conditions normales d'oxygène. Être prêts à commencer l'étiquetage dosage de l'ARN dans des conditions traitées (dans la chambre de l'hypoxie pour les cellules traitées par l'hypoxie) 1 heure avant la fin du traitement de l'hypoxie.
- Exposer les cellules à l'hypoxie pendant 1 h 15 min, 1 h 30 min, 2 h, et 24 h. Ces moments sont flexibles et déterminés par l'utilisateur.
- Utilisez un normoxic 3,5 cm plaque comme contrôle positif et un normoxique 3,5 cm plaque traitée avec actinomycine D (10 ng / ml de concentration finale) pendant 4 heures comme contrôle négatif. L'actinomycine D est un inhibiteur de la synthèse globale de l'ARN.
Précautions:
Hoechst 33342 est un agent mutagène connu.
DMSO est connu pour faciliter l'entrée des molécules organiques dans les tissus.
NaOH est corrosif.
HCl est corrosif.
Paraformaldéhyde est très toxique pour tous les animaux et peut causer la mort chez l'homme.
Triton X-100 peut causer une irritation de la peau après un contact direct.
Actinomycine D est toxique lorsqu'il est en contact avec la peau ou ingestion.
Prendre les précautions nécessaires lors de la manipulation de produits chimiques dangereux.
2. Cliquez-iT Assay
- Rassembler les réactifs suivants qui sont nécessaires en plus du kit de dosage Cliquez-iT: tampon phosphate salin (PBS) pH 7.2 au 7.6, 3.7% paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS, 1% de Triton X-100 Dans de la PBS, de l'eau déionisée (dH 2 O), le diméthylsulfoxyde (DMSO), 10 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) et de l'acide chlorhydrique à 37% (HCl); Facultatif - pH bandes indicatrices.
- Préparer une solution stock de frais PFA avant d'effectuer la réaction Cliquez-iT comme suit:
- Mettre 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O et 10 pi de10 M de NaOH dans un tube Falcon de 50 ml. Faire bouillir 300-400 ml de H 2 O dans un grand bêcher dans le micro-ondes pour faire un bain d'eau et de supporter ce dans une hotte de laboratoire.
- Placez le Falcon 50 ml dans le bain d'eau et agiter doucement pendant 10 min, en libérant périodiquement le couvercle jusqu'à ce que le PFA a été dissoute.
- Seringue la solution de PFA à travers un filtre de 0,2 um dans un autre tube Falcon de 50 ml, a donné une solution à 37%.
- Diluer cette 10x en ajoutant du PBS et amener le pH à 6,8 par addition d'environ 12 pi de HCl concentré. Option: Confirmer le bon pH avec les bandes indicatrices dans la hotte.
- Utiliser immédiatement ou stocker overnight à 4 ° C.
- Préparer les solutions mères de la trousse d'imagerie de l'ARN comme suit:
- Ajouter 373 ul dH 2 O au composant A pour obtenir une solution mère de 100 mM de l'UE. Conserver à -20 ° C pendant un mois.
- Ajouter 85 ul de DMSO à la composante B (Alexa Fluor 594) et mélanger par pipetage ou vortex. Stocker à la fois à -20 ° C pendant jusqu'à un an.
- Ajouter 2 ml dH 2 O à E composant pour créer une solution de l'additif 10X de tampon de réaction de kit de visualisation de l'ARN. Conserver à -20 ° C pendant jusqu'à un an, jeter lorsque la solution se développe une couleur brune.
- Marquage des cellules avec l'UE: Préparer une solution de travail 2X de l'UE de l'mM 100 préparé à l'étape 2.3 dans un milieu complet préchauffé (37 ° C) Effectuer le reste de cette étape et l'étape 2.5 dans la chambre de l'hypoxie pour les cellules traitées avec l'hypoxie. . Diluer jusqu'à 1X par addition d'un volume égal de cette solution de travail 2X à la suite de médiasaining cellules. Incuber pendant 1 heure sous des conditions de traitement de culture cellulaire.
- Cellule Fixation: Laver chaque puits une fois avec du PBS et ajouter 1 ml de 3,7% PFA actions préparées à l'étape 2.2 ci-dessus dans des conditions de traitement. Incuber pendant 15 min dans des conditions de traitement. Les échantillons traités par l'hypoxie peuvent être retirés de la chambre de l'hypoxie en ce point. Retirez le fixateur et laver chaque puits une fois avec PBS (Prenez soin de disposer de PFA perdre responsable). Effectuer les étapes suivantes à la température ambiante.
- Perméabilisation: Retirer la solution de lavage et ajouter 1 ml de 1% de Triton X-100 dans du PBS dans chaque puits. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Retirez le tampon de perméabilisation et laver chaque puits une fois avec PBS.
- Détection ARN marqué:
- Préparer une solution fraîche 1X de travail de l'additif tampon de réaction de kit de visualisation de l'ARN par dilution de la solution 10X (préparé à l'étape 2.3) en 1h10 dH 2 O.
- Préparer le kit de visualisation de l'ARNcocktail de réaction selon le Tableau 2 pour une utilisation immédiatement après sa préparation.
- Retirer la solution de lavage et ajouter 500 ul d'imagerie par réaction de l'ARN kit cocktail à chaque échantillon. Incuber pendant 30 min à température ambiante, l'abri de la lumière.
- Retirer de l'imagerie de l'ARN réaction de kit cocktail et laver une fois avec 1 ml de l'imagerie de l'ARN tampon de rinçage de la réaction de kit (composant F), puis retirez le tampon de rinçage de la réaction de kit de visualisation de l'ARN.
- Réaction multiplex Facultatif: Procédez marquage de l'anticorps d'échantillons supplémentaires à ce point selon les recommandations du fabricant.
- Coloration de l'ADN: les échantillons de lavage avec du PBS, puis retirer la solution de lavage. Diluer le Hoechst 33342 (composants G) 1:1000 dans du PBS. Ajouter 1 ml de dilution Hoechst 33342 à chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante, protégé de la lumière. Retirez le 33342 solution Hoechst et laver les cellules deux fois avec du PBS. Retirez le solutio de lavagen et procéder à la microscopie optique.
3. Microscopie optique
- Lamelles de montage:
- Introduire 10 pl de milieu de montage sur le centre d'une lame de microscope standard.
- Placer la lamelle couvre-objet avec la cellule du côté vers le bas sur l'axe de la lame de microscope à couvrir la partie aliquote du milieu de montage. Prenez soin d'éviter la formation de bulles dans le milieu de montage car cela occulter acquisition de l'image suivante.
- Collez la lamelle à la lame de microscope en appliquant du vernis transparent à son périmètre. Laisser sécher pendant 5 min à température ambiante. Protéger de la lumière. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C après montage.
- acquisition de l'image: Acquérir les images en utilisant un microscope à champ large capable de détecter la fluorescence. Approximative maxima d'émission de fluorescence / d'excitation pour le colorant Alexa Fluor et Hoechst 33342 lié à l'ADN sont présentés dans le tableau 3.
- Performancem imagerie utilisant un 40X/1.30 NA lentille à immersion d'huile et de capture d'images avec une caméra CCD refroidie.
4. Analyse des données
- Images Deconvolve en utilisant un logiciel de traitement d'image (voir le tableau des matériaux) avant d'importer le client OMERO. Normaliser paramètres de rendu pour toutes les images dans la même expérience dans le logiciel microscope de visualisation d'image et l'analyse en appliquant les paramètres de rendu à partir de cellules normoxiques de contrôle à toutes les autres conditions.
- Utilisez la région d'intérêt (ROI) outil dans le logiciel microscope de visualisation d'image et d'analyse (voir le tableau des matériaux) pour sélectionner noyaux de chaque image. Obtenir des intensités moyennes pour chaque ROI et de calculer la moyenne et l'écart-type pour chaque condition en choisissant l'option de l'analyse de l'intensité, y compris un nombre compris entre 30-50 cellules.
- Construire diagrammes de dispersion à l'aide d'un logiciel graphique de données (voir le tableau des matériaux) en traçant les valeurs d'intensité moyennes individuelles obtenues dans l'étape 4.2 to tenir compte de la variabilité entre les cellules dans chaque condition. Vous pouvez également construire des diagrammes à barres pour représenter l'intensité moyenne moyenne, plus l'écart type de l'ARN naissant.
Representative Results
Un schéma de la réaction kit d'imagerie de l'ARN est indiquée sur la figure 1B. Nous avons utilisé cette réaction pour déterminer quantitativement la synthèse totale de l'ARN dans les cellules après traitement avec U2OS hypoxie à la fois sur un individu (cellule unique) et du niveau global (population de cellules). Les cellules ont été traitées avec une hypoxie et mises en culture en présence de l'UE. Ils ont ensuite été fixées et perméabilisées et l'intégration de l'UE a été détectée par ligature chimiosélective de l'UE avec un colorant contenant azoture. Ce "clic" réaction conduit à une émission de fluorescence qui peut être détectée et quantifiée en utilisant la microscopie optique à fluorescence. Figure 2A montre un résultat typique de cette expérience. Cellules marquées par fluorescence sont pseudocolored rouge et l'image a été ouvert dans l'environnement de la microscopie ouvert pour les objets distants (OMERO). Ce logiciel microscope de visualisation d'image et d'analyse a un outil intégré de ROI qui peut être utilisé pour sélectionner structure sous-cellulaire individuelletures et quantitativement analyser l'intensité de l'image dans la région choisie. Un exemple typique de la sortie de données suite à l'utilisation de cet outil dans le programme client peut être vu sur la figure 2B; les intensités de cellules individuelles sont indiqués à côté d'une image représentative de l'expérience, qui sert de contrôle visuel pour s'assurer de la validité des données.
Les différentes intensités de fluorescence des cellules peuvent être tracées comme un nuage de points pour montrer la distribution des intensités cellulaires individuels au sein de la population de cellules traitées. Un exemple de ce type de graphe est vu sur la figure 2C. Traçage des données d'intensité de cette manière est utile car elle permet une comparaison rapide des résultats de traitement et d'illustrer la grande hétérogénéité au sein d'une population de cellules de traitement qui est autrement cachée en utilisant la représentation de données standard clairement. L'hétérogénéité de réponse est intéressant dans cette expérience parce que même si un stimulus hypoxique uniforme était unpplied aux cellules, il est évident que toutes les cellules de la même population de la monocouche répond différemment à ce stimulus.
La figure 2D représente le résultat global de notre expérience. intensités de fluorescence de toutes les cellules dans une population de traitement ont été moyennées et représentées dans ce diagramme à barres. T-test de Student a été utilisé pour calculer la probabilité statistique de chaque groupe de traitement qui diffèrent considérablement de la commande. Fait intéressant, ces données montrent qu'il existe une augmentation statistiquement significative de la synthèse globale de l'ARN au cours du temps lorsque les cellules sont traitées avec U2OS hypoxie (parfois supérieur à 1 h 30 min * p <0,01;. ** P <0.05 et *** p <0,001 et n> 30). Ces données montrent que, suite à des périodes de traitement plus longues de l'hypoxie, la cellule concentre ses efforts sur la production d'ARN, même dans cet environnement hostile hypoxique. L'actinomycine D traitement ablation complètement l'intensité de fluorescence comme prévu.
Figure 1. A. Le système HIF répond aux changements de l'oxygène cellulaire. Dans ce schéma simplifié hypoxie stabilise l'hétérodimère de HIF en empêchant HIF-α hydroxylation (-OH) par les enzymes prolyl hydroxylase (de doctorat) et son polyubquitination ultérieure par la protéine de von Hippel-Lindau (VHL). les résultats de la stabilisation de HIF dans l'activation de gènes qui contribuent à la myriade de cellules répondent à l'hypoxie cellulaire B. synthèse d'ARN peut être détecté en utilisant l'essai Click-IT.; cellules sont marquées avec l'UE après le traitement de la réaction de Click détecte la synthèse d'ARN qui peut être quantifiée par l'intensité de la fluorescence et microscopie optique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand Version de ce chiffre.
Figure 2. A. Capture d'écran de OMERO pour montrer la sortie microscopique typique après marquage de l'ARN. Ce logiciel microscope de visualisation d'image et l'analyse peut rapidement extraire des données d'intensité sur un niveau de la cellule individuelle à l'aide de son ROI intégré macro. Est montré dans la synthèse B. mondial ARN Une capture d'écran de la sortie de cette commande peut être déduit de l'intensité de la cellule individuelle, dont la portée peut être vu dans un nuage de points C. Une représentation formelle de ces données agrégées peut être vu D. * p <0,01; ** P <0,05 et *** p <0,001 et n> 30. Cliquez ici pour agrandir l'image.
| Réactifs de culture cellulaire |
| Du tampon phosphate salin (PBS) pH 7.2 au 7.6 |
| Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) |
| De sérum de veau foetal (SVF) stérilisé par filtration |
| La pénicilline / streptomycine |
| L-glutamine |
| 0,05% de trypsine-EDTA (1%) |
| Éthanol à 70% |
| Actinomycine D (1 pg / pl Traduction) |
| Culture cellulaire Équipement |
| Stérile Pasteur Pipettes |
| Une gamme d'articles en matière plastique cellulaire de la culture traitée approprié pour le maintien et le traitement de cellules en culture |
| Bain-marie réglé à 37 ° C |
| Laminaire hotte à flux d'air |
| Incubateur réglé à 37 ° C, 5% CO 2 |
| L'hypoxie Workstation réglé à 37 ° C, 5% CO 2, O 2 1% |
| des lamelles de verre |
| Pince de précision |
| Hémocytomètre |
Tableau 1. Réactifs et équipements nécessaires pour la culture de cellules U2OS.
| Composants de réaction | Nombre de lamelles couvre- | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| Tampon de réaction de l'ARN Cliquez-iT (composant C) | 428 pi | 856 pi | 1,7 ml | 2,1 ml | 2,58 ml | 4,3 ml |
| CuSO 4 (Composante D) | 20 pl | 40 pl | 80 pi | 100 pl | 120 pl | 200 pl |
| Alexa Fluor azoture (préparé à l'étape 2.3) | 1,8 pl | 3,7 pl | 7,4 pl | 9,3 pl | 11.28 pi | 18,8 pi |
| Cliquez-iT additif tampon de réaction (préparé à l'étape 2.3) | 50 pl | 100 pl | 200 pl | 250 pl | 300 pl | 500 pl |
| Volume total approximatif | 500 pl | 1 ml | 2 ml | 2,5 ml | 1,5 ml | 5 ml |
. Tableau 2 imagerie ARN cocktails de réaction du kit: table de référence rapport de maître composants de mélange pour kit imagerie ARN réaction détaillant en fonction du nombre de lamelles à être colorés.
| Fluorophore | Excitation (nm) | Émission (nm) |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 |
| Hoechst 33342, lié à l'ADN | 350 | 461 |
. Tableau 3 maxima d'émission de fluorescence / d'excitation: approximative maximale d'émission de fluorescence / d'excitation pour Alexa Fluor colorant Hoechst 33342 et lié à l'ADN.
Discussion
Nous avons décrit notre utilisation d'un kit de visualisation de l'ARN pour examiner les effets de l'hypoxie sur la synthèse d'ARN dans l'ostéosarcome (U2OS) cellules. Cette technique est relativement simple et fournit des données sur la transcription globale à l'échelle de la cellule unique. Nous avons modifié le protocole classique pour ce kit de marquage d'incorporer dans une chambre de l'hypoxie. A notre connaissance, il s'agit du premier rapport de l'utilisation de cette technique pour mesurer les changements dans la synthèse d'ARN dans l'hypoxie. Le kit de visualisation de l'ARN, nous avons utilisé est adapté à l'expérimentation en hypoxie, car il ne nécessite pas d'isotopes radioactifs et est techniquement compatible avec les limites de travail dans un poste de travail sous atmosphère contrôlée. Problèmes communs avec cette technique préoccupation fixation et l'étiquetage de l'échantillon efficace. Il est extrêmement important que le PFA utilisé pour fixer l'échantillon est frais et les étapes de lavage qui suivent la réaction «clic» sont effectuées comme décrit pour assurer une faible coloration de fond de l'échantillon. Si background fluorescence devient un problème, il est recommandé de laver une fois de plus avec un tampon réaction de kit de rinçage 1 ml d'ARN d'imagerie après l'étape 2.7.4.
Le kit de visualisation d'ARN mentionnée ici représente une avancée significative dans la technologie de l'imagerie de l'ARN en termes de facilité d'utilisation et la spécificité et la vitesse de réaction. Cette technique est principalement limitée par le temps qu'il faut pour marquer l'échantillon. Le kit de visualisation de l'ARN nécessite une période de marquage de 1 heure qui empêche l'examen de l'évolution rapide de l'ARN mondial qui généralement se produire dans ce délai. C'est pour cette raison que notre premier point de temps est limitée à 1 h et 15 min. La technique est associée à quelques autres limitations qui se rapportent en grande partie au réactif compatibilité avec d'autres marqueurs fluorescents, par exemple, le kit d'imagerie de l'ARN n'est pas compatible avec la phalloïdine coloration.
Toutes les approches existantes de l'étude de la synthèse d'ARN dans les cellules sont basés sur l'incorporation de nucléosides modifiés dans l'ARN naissant et la détection de marqueurs sont intégrés par des moyens différents. L'approche novatrice a été basée sur l'utilisation de précurseurs d'ARN radiomarqués suivie par détection avec autoradiographie. Cette méthode conduit à une découverte de stades du cycle cellulaire et d'autres résultats importants; Cependant, il a beaucoup d'inconvénients tels que la lourdeur du travail de la radioactivité, longs temps d'exposition et des images de basse résolution de l'autoradiographie 6. La prochaine avance dans le champ exploitée au moyen d'immunochimie à éliminer la nécessité de la radioactivité. L'ARN a été marqué par incorporation d'BrU suivie d'une détection d'immunochimie. Cependant, la liaison de l'anticorps efficace nécessaire dénaturation d'acide nucléique pour améliorer l'accès à de l'ADN ou de l'ARN qui a provoqué la perte de la morphologie des cellules et endommagé les épitopes de nombreuses protéines, en empêchant la poursuite de leur détection par des anticorps marqués par fluorescence 13. L'introduction de la technologie "click chemistry" simplifié l'étape de détection et til procédure par rapport à une autoradiographie et de l'immunochimie. La technologie est basée sur l'azoture-alcyne Huisgen réaction de cycloaddition où alcyne terminal du 5-ethyniluridine se lie avec de l'azoture conjugué avec le fluorophore en présence de Cu (I). La réaction est spécifique, rapide, ne nécessite pas d'étapes supplémentaires, et est difficilement compatible avec la détection immunochimique d'autres constituants cellulaires.
L'utilisation de cette technologie de l'imagerie de l'ARN nous avons montré que les cellules, dans la même population de la monocouche, ont des niveaux différents de la synthèse de l'ARN en réponse à l'hypoxie. Nous avons limité notre expérience pour examiner l'effet de la production de l'ARN uniquement; cependant, il est tout à fait possible avec cette trousse d'imagerie pour effectuer l'ARN modifiés, des réactions multiplex supplémentaires qui permettent une analyse plus complexe de la production de l'ARN. Par exemple, la coloration en utilisant un anticorps secondaire spécifique pour des marqueurs de transcription actif, tels que les niveaux de phosphorylation de l'ARN polymerase II, ou même des composants de la traduction de machines à donner une indication de la quantité de cet ARN nouvellement produite qui est convertie en protéine sont possibles. Des protéines supplémentaires, telles que l'actine, une protéine qui ne devrait pas changer significativement avec l'hypoxie, peuvent être testés en tant que contrôle supplémentaire. En outre, différents types de cellules peuvent être testées, comme il est très probable que les différentes cellules auront différents taux de synthèse d'ARN et même des réponses différentes à l'hypoxie.
L'utilisation de ce kit de visualisation d'ARN est très simple à condition que les étapes sont effectuées de la manière décrite. Les étapes critiques du protocole impliquent le placage des cellules, fixation et coloration des cellules et l'acquisition d'image. Il est important de plaquer les cellules à la densité décrit pour éviter une sur ou sous confluence à l'expérimentation qui affectera de manière significative le résultat. Il est également important d'utiliser du fixateur frais, assurant le meilleur «instantané» de la cellule est pris et à prendre soin lors du lavage des cellules après coloration à réduire le background à un niveau qui est acceptable pour une analyse efficace. Enfin, la méthode de l'acquisition de l'image est d'une importance vitale pour obtenir des images qui sont d'une qualité suffisante pour une analyse ultérieure. Nous vous recommandons d'utiliser le meilleur microscope à lumière disponible pour examiner des échantillons optiquement tels que le microscope utilisé dans ce protocole qui est disponible dans la plupart des centres à forte intensité de recherche à l'échelle mondiale.
Disclosures
JRS est le fondateur de Glencoe Software, Inc., une société commerciale américaine ouverte source qui contribue à OMERO.
Acknowledgments
JB est un moniteur clinique CRUK, AS est un étudiant Wellcome Trust PhD, le laboratoire de SR est financé par une bourse de recherche principal CRUK (C99667/A12918). Ce travail a été soutenu par deux prix stratégiques Wellcome Trust (097945/B/11/Z et 095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
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