Summary
אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא אל תא שינויים בסינתזת RNA הגלובלי.
Abstract
היפוקסיה או הפחתה של זמינות החמצן מעורבת בתהליכים פיסיולוגיים רבים ופתולוגיים. ברמה המולקולרית, תאים ליזום תכנית תעתיק מסוימת על מנת לעלות תגובה תאית מתאימה ומתואמת. התא בעל כמה אנזימי חיישן חמצן שדורשים חמצן מולקולרי כcofactor לפעילות שלהם. אלה נעים בין prolyl-hydroxylases לdemethylases היסטון. רוב מחקרי ניתוח תגובות תאיות להיפוקסיה מבוססים על אוכלוסיות סלולריות ומחקרי ממוצע, וכניתוח תא בודד כזה של חוסר חמצן בתאים מבוצעים רק לעתים רחוקות. כאן אנו מתארים שיטת ניתוח של סינתזת RNA הגלובלית ברמת התא והתא בהיפוקסיה באמצעות ערכות ההדמיה RNA לחץ עליו בתחנת עבודה של חמצן מבוקר, ואחריו ניתוח מיקרוסקופית וכימות. שימוש בתאי סרטן שנחשפו לחוסר חמצן לאורכים שונים של זמן, RNA מסומן ונמדד בכל תא. ניתוח זה מאפשרההדמיה של ושינויי תא אל התא זמניים בסינתזת RNA הגלובלית בעקבות לחץ חוסר חמצן.
Introduction
היפוקסיה (מתחים נמוכים של חמצן) מתרחשת כאשר אספקת החמצן הרגילה לרקמה היא מופרעת. חמצן סביבתי הוא גם מזין ומולקולת איתות, מתן רמזים חשובים עבור סוגים רבים של תאים. שינויים בחמצן סביבתי הם חשו על ידי קבוצה של dioxygenases ששולטים על פעילותם של בני משפחה גורם שעתוק חיוני המכונים גורמי היפוקסיה העין מתנהלת (HIFs). HIFs מורכב משתי תת יחידות, α וβ. ישנם שלושה isoforms הידוע של HIF-α (1, 2, ו -3) וגרסאות אחוי מרובות של HIF-1β. HIF-1β מתבטאים constitutively ולא מוסדרים על ידי רמות חמצן סביבתיות 1. בני משפחת HIF-α מוסדרים באופן דינמי על ידי כיתה של prolyl-hydroxylases (תואר דוקטור) והגורם המעכב HIF (FIH); שניהם דורשים חמצן כשיתוף גורם לזרז הידרוקסילציה של HIF-α 2,3. בnormoxia בני משפחת HIF-α הם hydroxylated ומתויגים לproteosomאל השפלה ידי E3-האנזים, פון היפל לינדאו (VHL). בהיפוקסיה הדוקטורים וFIH אינם פעילים או שיש פעילות מופחתת. Isoforms HIF-α הפך התייצב, יוצר heterodimer עם HIF-1β, ולהשפיע על השעתוק של גנים המספקים את התגובה התאית לסביבת חוסר חמצן (איור 1 א) 4.
טכניקות הנוכחיות לניתוח RNA להתמקד בכימות של ערכים בממוצע על פני אוכלוסיית תא נתון. תאים מגיבים לגירוי חוסר חמצן על ידי ייזום השעתוק של מספר עצום של גנים המאפשרים להם להסתגל לסביבה העוינת שלהם 5. עם זאת, לעתים קרובות קיימת היפוקסיה כשיפוע, ותאים בסביבת חוסר חמצן אינם כפופים לגירוי חוסר חמצן אחיד. אנו מתארים יישום של ערכות ההדמיה RNA לחץ עליו בתחנת עבודה של חמצן מבוקר כדי לבחון סינתזת RNA הגלובלית ברמת התא הבודד בהיפוקסיה.
ערכת ההדמיה RNA משתמשתנוקלאוזידים הותאם-lkyne, uridine 5-ethynyl (EU) וקשירת chemoselective כדי לאפשר זיהוי של סינתזת RNA הגלובלית temporally ומרחבית בתאים וברקמות 6. בקצרה, טיפול בתאים עם חוסר חמצן ותרבית בנוכחות של איחוד אירופי. לאחר מכן הם קבועים וpermeabilized וההתאגדות של האיחוד האירופי לרנ"א המתהווה הוא זוהה על ידי קשירת chemoselective של איחוד אירופי עם צבע המכיל אזיד. עבודה אופיינית לתגובה זו מוצגת באיור 1. אנחנו השתמשנו בערכת ההדמיה RNA לבחון סינתזת RNA ברמת התא הבודד שנבעה מטיפול בחוסר חמצן.
גדליו הקטנים של תג alkyne מאפשרים שילוב יעיל של נוקלאוזידים שונה לתוך RNA באופן ספציפי. קשירת chemoselective או התגובה 'קליק' היא יעילה ביותר, מהירה וספציפית 7-10. כל מרכיבי התגובה הם bioinert והתגובה לא דורשת טמפרטורות או ממסים קיצוניים. תגובת הלחיצה שוללתהדרישה לradiolabelling קונבנציונלי ומאפשר הדמיה ישירה של התוצאות שכן התפוקה היא אור. בנוסף לכך, מולקולת זיהוי יכולה לחדור בקלות דגימות מורכבות המאפשרות ניתוח זמנית כוללים נוגדנים לזיהוי של חלבוני RNA-אינטראקטיבי. assay ההדמיה RNA זה תואם עם צבעים אורגניים, כולל Alexa פלואוריד והעמסה (FITC).
מדדנו את השינוי בסינתזת RNA לאחר טיפול של התאים שלנו באמצעות יישום של הסביבה הפתוחה מיקרוסקופיה לעצמים מרוחקים (OMERO). OMERO הוא תוכנת קוד פתוח, זמינה בhttp://openmicroscopy.org/. תוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה מאפשרת גישה ולשימוש במגוון רחב של נתונים ביולוגיים, כולל הניהול של מערכי נתונים רב ממדיים, הטרוגנית. יישום לקוח מאפשר הדמיה וניתוח של נתוני תמונה ביולוגית מורכבים 11 מרחוק;אנחנו השתמשנו בו כדי לכמת את השינויים החזותיים בסינתזת RNA התא הגלובלית ורווקה. נתונים אלה ואת הצעדים הנדרשים כדי לנתח את ניסוי ההדמיה RNA שלנו באמצעות הדמיה זו מיקרוסקופ תמונה ותוכנת ניתוח מוצגים להלן.
הסתכלנו על שינויים בסינתזת RNA הגלובלית בעקבות הטיפול באוסטאוסרקומה אדם תאים (U2OS) עם היפוקסיה עד 24 שעה. בכל התנאים, זיהינו וריאציה תא אל התא ברמת ייצור RNA. זמנים קצרים של חשיפת היפוקסיה לא הביאו לשינויים משמעותיים ברמה של RNA המתהווה בתאים. עם זאת, חשיפה ל24 שעות של היפוקסיה הביאה לעלייה משמעותית בכמות של RNA המיוצרת בתאים. רוב התגובות תאיות להיפוקסיה נמדדים הבא תקופות ממושכות של חשיפה, כגון 4-24 שעה. עם זאת, הם הכניסו כמה מנגנונים במקום הרבה יותר מוקדם, למשל; הפעלת NF-κB מתרחשת בתוך 5-15 דקות של חשיפת היפוקסיה 12. חוקר היפו קצר יותרזמני חשיפת שיה הוא מוצדקים ולכן ויכולים לגרוע מתגובות מורכבות יותר כגון מחזור התא ואפופטוזיס.
Protocol
1. תא תרבות וטיפול
- אסוף את חומרים כימיים וציוד מפורט בטבלה 1 לאוסטאוסרקומה האנושית תרבות תאים (U2OS). הכן את כל חומרים כימיים ולנהל את כל הטכניקות בתרבית הרקמה בזרימת אוויר למינרית מכסה המנוע כדי להבטיח סטריליות
- הכן את מדיום התרבות כדלקמן: הוסף FCS 50 מיליליטר, 5 L-גלוטמין מיליליטר ו 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין לDMEM כדי להשיג ריכוזים סופיים של 10% (FCS), 2 מ"מ (L-גלוטמין), 50 U / ml ( פניצילין) ו50 U / ml (סטרפטומיצין). לחמם את מדיום התרבות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הכן את התאים לטיפול:
- לעקר כמה coverslips ב70% אתנול, לאפשר לאוויר יבש ומקום אחד בחלק התחתון של שש צלחות 3.5 סנטימטר.
- לטבול את coverslips ב2 מיליליטר חימם DMEM המלא (37 מעלות צלזיוס), לחיצה עם המלקחיים coverslip כדי להבטיח שהם יישארו דבקים בחלק התחתון של הבארות.
- לנתק את תאי U2OS מפולחן רקמתםצלחת יור על ידי שטיפת פעם אחת עם 3 מיליליטר PBS, החלת 4 מיליליטר חיממה 0.05% טריפסין-EDTA (1%) ודוגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
- תאי resuspend ב 6ml חיממו DMEM להשלים כדי להשבית טריפסין-EDTA ולספור באמצעות hemocytometer.
- צלחת 2 x 10 5 תאים לכל אחד מ3.5 צלחות סנטימטר שהוכנו בשלב 1.3.1. נער בעדינות את הצלחת כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים. אפשר התאים לדבוק לילה לפני הטיפול.
- פנק את התאים על ידי הצבת ארבע 3.5 צלחות סנטימטר לתוך תחנת העבודה היפוקסיה ולהשאיר את שתי צלחות 3.5 סנטימטר האחרים בחממה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חמצן רגילים. להיות מוכן להתחיל את assay RNA התיוג בתנאים שטופלו (בתא היפוקסיה לתאים שטופל היפוקסיה) 1 שעות לפני טיפול היפוקסיה מסתיים.
- לחשוף תאים להיפוקסיה עבור שעה 1 15 דקות, 1 שעות 30 דקות, 2 שעות, ו24 שעות. נקודות זמן אלה הן גמישות ונקבע משתמש.
- השתמש normoxic 3.5 צלחת סנטימטר כביקורת החיובית וצלחת 3.5 סנטימטר normoxic טופלה אקטינומיצין D (10 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי) עבור 4 שעות כביקורת השלילית. אקטינומיצין D היא מעכב של סינתזת RNA הגלובלית.
אזהרות:
Hoechst 33,342 הוא mutagen ידוע.
DMSO ידוע כדי להקל על הכניסה של מולקולות אורגניות לרקמות.
NaOH הוא מאכל.
HCl הוא מאכל.
Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד לכל בעלי החיים, ויכול לגרום למוות בבני אדם.
טריטון X-100 יכולים לגרום לגירוי בעור הבא במגע ישיר.
אקטינומיצין D היא רעילה כאשר במגע עם עור או בליעה.
לנקוט באמצעי זהירות מתאימה בעת טיפול בכל החומרים הכימיים המסוכנים.
2. לחץ עליו Assay
- אסוף את ריאגנטים הבאים הנדרשים בנוסף לערכת assay לחץ עליו: בופר פוספט pH (PBS) 7.2-7.6, paraformaldehyde .3.7% (PFA) ב-PBS, 1% X טריטון-100 ב-PBS, מים deionized (DH 2 O), sulfoxide דימתיל (DMSO), הידרוקסיד 10 M נתרן (NaOH), ו37% חומצה הידרוכלורית (HCl); רצועות אינדיקטור pH - אופציונאלי.
- הכן פתרון מניות PFA טרי לפני ביצוע התגובה לחץ עליו באופן הבא:
- שים 1.85 גרם PFA, 3.5 מיליליטר DH 2 O ו10 μl of10 M NaOH לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר. מרתיחים 300-400 מיליליטר של H 2 O בכוס גדולה במיקרוגל כדי להפוך את אמבט מים ולסבול את זה במנדף.
- הנח את פלקון 50 מיליליטר לתוך אמבט מים ובעדינות להתסיס עבור 10 דקות, מעת לעת לשחרר את המכסה עד PFA נמס.
- מזרק פתרון PFA דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לעוד צינור פלקון 50 מיליליטר, וכתוצאה מכך פתרון 37%.
- לדלל זה 10x על ידי הוספת PBS ולהביא את ה-pH 6.8 על ידי הוספה על 12 μl של HCl המרוכז. אפשרות: אישור ה-pH הנכון עם רצועות המחוון במנדף.
- להשתמש מייד או לאחסן overnight ב 4 ° C.
- הכן את מניית הפתרונות של ערכת ההדמיה RNA באופן הבא:
- הוספת 373 μl DH 2 O לרכיב וכתוצאה מכך פתרון מניות של של איחוד אירופי 100 מ"מ. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לחודש אחד.
- הוספת 85 μl של DMSO למרכיב B (אלקסה פלואוריד 594) ומערבבים על ידי pipetting או vortexing. אחסן את שניהם ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.
- הוסף 2 מיליליטר DH 2 O ל-E מרכיב כדי ליצור פתרון 10X של תוסף חיץ תגובת ערכת ההדמיה-RNA. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה, להשליך כאשר פתרון מפתחת צבע חום.
- תיוג של תאים עם איחוד אירופי: הכן פתרון עובד 2X של איחוד אירופי ממניות מ"מ 100 מוכנות בשלב 2.3 במדיום prewarmed מלא (37 ° C) לבצע את יתרת על שלב זה ושלב 2.5 בתא היפוקסיה לתאים שטופלו היפוקסיה. . לדלל ל1X על ידי הוספת נפח שווה של פתרון זה 2X פועל להמשך התקשורתaining תאים. דגירה עבור שעה 1 בתנאי תרבית תאי טיפול.
- קיבוע תא: לשטוף היטב כל פעם עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של .3.7% מניית PFA מוכנים בשלב 2.2 לעיל בתנאי טיפול. דגירה במשך 15 דקות בתנאי טיפול. הדגימות שטופלו בהיפוקסיה ניתן להסיר תא היפוקסיה בשלב זה. הסר את מקבע ולשטוף היטב כל פעם עם PBS (תשמור על עצמך להיפטר מPFA לבזבז באחריות). בצע את השלבים הבאים בטמפרטורת חדר.
- Permeabilization: הסר את הפתרון לשטוף ולהוסיף 1 מיליליטר של 1% טריטון X-100 ב PBS היטב כל אחד. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את חיץ permeabilization ולשטוף היטב כל פעם עם PBS.
- איתור RNA שכותרתו:
- הכן פתרון עובד טרי 1X של תוסף חיץ תגובת ערכת הדמיה-RNA על ידי דילול פתרון 10X (מוכן בשלב 2.3) 1:10 ב DH 2 O.
- הכן ערכת ההדמיה-RNAקוקטייל תגובה בהתאם לטבלת 2 לשימוש מייד לאחר הכנה.
- הסר את הפתרון לשטוף ולהוסיף 500 μl של קוקטייל תגובת ערכת ההדמיה RNA מדגם זה. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, להגן מפני אור.
- הסר את קוקטייל תגובת ערכת ההדמיה-RNA ולשטוף פעם עם 1 מיליליטר של חיץ ההדמיה RNA תגובת ערכת שטיפה (F רכיב), ולאחר מכן להסיר את חיץ שטיפת תגובת ערכת ההדמיה-RNA.
- תגובה זמנית אופציונלית: בצע תיוג נוגדן נוסף של דגימות בשלב זה על פי המלצות יצרן.
- ה-DNA מכתים: לשטוף דגימות עם PBS ולאחר מכן להסיר את הפתרון לשטוף. לדלל את Hoechst 33,342 (רכיב G) 1:1,000 ב-PBS. הוסף 1 מיליליטר של Hoechst המדולל 33,342 לכל היטב דגירה ל15 דקות בטמפרטורת חדר, להגן מפני אור. הסר את פתרון Hoechst 33342 ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הסר את solutio לשטוףn ולהמשיך במיקרוסקופ אור.
3. אור מיקרוסקופית
- ההר Coverslips:
- הנח 10 μl של הרכבה בינונית במרכז שקופית מיקרוסקופ רגילה.
- מקום coverslip עם תא בצד למטה במרכז שקופית מיקרוסקופ כדי לכסות את aliquot של הרכבה בינונית. תשמור על עצמך, כדי למנוע את הדור של בועות בהרכבה בינונית כמו זה יהיה לטשטש רכישת תמונה שלאחר מכן.
- היצמד coverslip לשקופית מיקרוסקופ על ידי יישום לכה מסמר ברור להיקפה. לאפשר לו להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. להגן מפני אור. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C הבאים הרכבה.
- רכישת תמונה: לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב מסוגל גילוי הקרינה. מקסימום פליטת הקרינה / עירור משוער לצבע אלקסה פלואוריד וHoechst 33342 חייב DNA מוצג בלוח 3.
- Perforהדמיה מ 'באמצעות עדשת טבילת שמן 40X/1.30 NA וללכוד תמונות עם מצלמת CCD מקוררת.
4. ניתוח נתונים
- תמונות Deconvolve באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים) לפני היבוא ללקוח OMERO. לנרמל עיבוד הגדרות עבור כל התמונות באותו הניסוי בתוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח על ידי יישום הגדרות טיוח מתאי normoxic שליטה לכל תנאים אחרים.
- השתמש באזור של עניין (ROI) בכלי התוכנה להדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח (ראה טבלת חומרים) כדי לבחור גרעינים מכל תמונה. השג עוצמות ממוצעים עבור כל החזר על השקעה ולחשב את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית עבור כל תנאי על ידי בחירה באפשרות ניתוח עוצמה, כולל מספר בין 30-50 תאים.
- לבנות מגרשי פיזור באמצעות תוכנת גרפים הנתונים (ראה טבלת חומרים) על ידי התוויית כל ערכי העצמה הממוצעים הבודדים שהושגו בt 4.2 הצעדo משקף השתנות בין תאים מתחת לכל מצב. לחלופין לבנות גרפים בר לייצג את העצמה ממוצעת ממוצעת בתוספת סטיית התקן של RNA המתהווה.
Representative Results
סכמטי של תגובת ערכת ההדמיה RNA הוא מוצג באיור 1. אנחנו השתמשנו תגובה זו כדי לקבוע כמותית סינתזת RNA הכוללת בתאים U2OS לאחר טיפול עם היפוקסיה בשני בודד (תא בודד) ורמה הגלובלית (אוכלוסייה של תאים). טופלו התאים עם היפוקסיה ותרבית בנוכחות של איחוד אירופי. לאחר מכן הם היו קבועים וpermeabilized וההתאגדות של האיחוד האירופי התגלתה על ידי קשירת chemoselective של איחוד אירופי עם צבע המכיל אזיד. זה 'לחץ על' תוצאות תגובה בפליטת הקרינה שניתן לאתרם ולכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור. איור 2A מראה תוצאה אופיינית מניסוי זה. תאי שכותרתו fluorescently הם pseudocolored אדומים והתמונה כבר נפתחו בסביבה הפתוחה במיקרוסקופ לעצמים מרוחקים (OMERO). יש תוכנה להדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה מובנה בכלי החזר על השקעה שניתן להשתמש בם כדי לבחור struc משנה הסלולר הבודדטורס וכמותית לנתח עוצמת תמונה בתוך האזור שנבחר. דוגמא אופיינית לפלט הנתונים הבאים את השימוש בכלי זה בתכנית הלקוח שניתן לראות באיור 2; עוצמות תא בודדות מוצגות לצד תמונה מייצגת מהניסוי המשמש כבדיקה חזותית כדי להבטיח תקפות נתונים.
ניתן להתוות עוצמות הקרינה סלולרי בודדות כמו תרשים פיזור כדי להראות את חלוקת העוצמות הסלולריות הבודדים בתוך אוכלוסיית התאים שטופלה. דוגמא לסוג זה של גרף ניתן לראות באיור 2 ג. זוממים נתוני עוצמת בדרך זו היא שימושי משום שהוא מאפשר השוואה מהירה של תוצאות טיפול ומדגים בבירור את ההטרוגניות המשמעותית בתוך אוכלוסיית תאי טיפול שהוא מוסתר כל שימוש אחר בייצוג נתונים סטנדרטי. ההטרוגניות התגובה מעניינת בניסוי זה, כי למרות שגירוי חוסר חמצן אחיד היהpplied לתאים, ברור שכל תא מאותה האוכלוסייה monolayer מגיב באופן שונה לגירוי זה.
איור 2 ד מתאר את התוצאה הכוללת מהניסוי שלנו. עוצמות הקרינה מכל התאים בתוך אוכלוסיית טיפול היו בממוצע ולאחר מכן להתוות בתרשים עמודות זה. מבחן t של סטודנט נעשה שימוש כדי לחשב את ההסתברות הסטטיסטית של כל קבוצת טיפול השונה באופן משמעותי מכלל השליטה. מעניין לציין, כי נתונים אלה מראים כי יש עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בסינתזת RNA הגלובלית לאורך זמן כאשר הם מטופלים תאי U2OS עם היפוקסיה (HR בפעמים יותר מאשר 1 30 דקות * p <0.01;. ** P <0.05 ו*** p <0.001 וn> 30). נתונים אלו מראים כי בעקבות תקופות ארוכות יותר של טיפול בחמצן, התא מתמקד מאמציה בייצור של RNA אפילו בסביבה של חוסר חמצן עוינת זו. טיפול D אקטינומיצין ablates לחלוטין את עוצמת הקרינה כצפוי.
איור 1. מערכת א HIF מגיבה לשינויים בחמצן הסלולר. בהיפוקסיה סכמטית הפשוטה הזה מייצב את heterodimer HIF ידי מניעת הידרוקסילציה HIF-α (-OH) על ידי אנזימי hydroxylase prolyl (תואר דוקטור) וpolyubquitination הבא שלה על ידי חלבון פון היפל-Lindau (VHL). תוצאות ייצוב HIF בהפעלה של גנים רבים המסייעים להגיב תא היפוקסיה סלולרית סינתזת RNA ב 'ניתן לאתר באמצעות assay Click-IT.; תאים מסומנים עם האיחוד האירופי לאחר טיפול התגובה לחץ מזהה סינתזת RNA אשר ניתן לכמת על ידי עוצמת הקרינה ומיקרוסקופ אור. אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול יותריון של נתון זה.
איור 2. א מסך מOMERO להראות תפוקה מיקרוסקופית אופיינית הבא תיוג רנ"א. תוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה יכול לחלץ את הנתונים במהירות בעוצמה ברמת תא בודד באמצעות מאקרו ההחזר על ההשקעה המובנה שלה. צילום מסך של הפלט מפקודה זו מוצג בסינתזה ב גלובל RNA ניתן להסיק מעוצמת תא בודדת, בטווח של אשר ניתן לראות בעלילת פיזור ג ייצוג פורמלי של נתונים מצרפיים אלה ניתן לראות ד * p <0.01; ** P <0.05 ו*** p <0.001 וn> 30. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
טבלה 1. חומרים כימיים וציוד הנדרשים לculturing של תאי U2OS.
| רכיבי תגובה | מספר Coverslips | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| תגובת חיץ RNA לחץ עליו (רכיב C) | 428 μl | 856 μl | 1.7 מיליליטר | 2.1 מיליליטר | 2.58 מיליליטר | 4.3 מיליליטר |
| CuSO 4 (רכיב D) | 20 μl | 40 μl | 80 μl | 100 μl | 120 μl | 200 μl |
| אלקסה פלואוריד יזיד (מוכן בשלב 2.3) | 1.8 μl | 3.7 μl | 7.4 μl | 9.3 μl | 11.28 μl | 18.8 μl |
| תוסף חיץ תגובה לחץ עליו (מוכן בשלב 2.3) | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 250 μl | 300 μl | 500 μl |
| סך היקף משוער | 500 μl | 1 מיליליטר | 2 מיליליטר | 2.5 מיליליטר | 1.5 מיליליטר | 5 מיליליטר |
. טבלה 2 קוקטיילים תגובת ערכת הדמיה-RNA: טבלת עזר המפרטת את היחס בין מרכיבי תערובת אב תגובת ערכת ההדמיה RNA לפי מספר coverslips להיות מוכתמים.
| Fluorophore | עירור (ננומטר) | פליטה (ננומטר) |
| אלקסה פלואוריד 488 | 495 | 519 |
| 33342 Hoechst, קשור לדנ"א | 350 | 461 |
. טבלה 3 מקסימום הקרינה / עירור פליטה: מקסימאלי פליטת הקרינה / עירור משוער לצבע אלקסה פלואוריד וHoechst 33342 קשור ל-DNA.
Discussion
שתארנו השימוש שלנו בערכת הדמיה RNA כדי לבחון את ההשפעות של חוסר חמצן בסינתזת RNA בתאי אוסטאוסרקומה (U2OS). טכניקה זו היא פשוטה יחסית, ומספקת נתונים על שעתוק הגלובלי ברמת תא בודדת. אנחנו שינינו את הפרוטוקול הקונבנציונלי עבור ערכה זו לשלב תיוג בתא היפוקסיה. למיטב ידיעתנו זה הדו"ח הראשון של השימוש בטכניקה זו כדי למדוד שינויים בסינתזת RNA בהיפוקסיה. ערכת ההדמיה RNA השתמשנו מתאימה לניסויים בהיפוקסיה שכן הוא לא דורש איזוטופים רדיואקטיביים והוא מבחינה טכנית בקנה אחד עם המגבלות של עבודה בתחנת עבודה באווירה מבוקרת. בעיות נפוצות בקיבעון הזה הדאגה טכניקה יעיל וסימון של המדגם. זה חשוב מאוד כי PFA משמש כדי לתקן את המדגם הוא טרי והצעדים לשטוף שבצעו את התגובה 'קליק' מבוצעים כפי שתוארו על מנת להבטיח מכתים רקע נמוך של המדגם. אם בackground הקרינה הופכת לבעיה מומלץ לשטוף שוב עם חיץ שטיפת תגובת ערכת ההדמיה RNA מיליליטר 1 לאחר שלב 2.7.4.
ערכת ההדמיה RNA שהוזכר כאן מייצגת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית ההדמיה RNA במונחים של קלות שימוש וספציפיות ומהירות התגובה. טכניקה זו היא מוגבלת בעיקר על ידי הזמן שנדרש כדי לתייג את המדגם. ערכת ההדמיה RNA דורשת תקופת תיוג 1 שעות שמונעת הבדיקה של שינויים מהירים בRNA הגלובלי, כי בדרך כלל היה להתרחש בפרק זמן זה. זה מסיבה זו נקודת הזמן הראשון שלנו מוגבלת לשעה 1 ו15 דקות. הטכניקה קשורה עם כמה מגבלות אחרות שמידה רבה מתייחסות למגיב תאימות עם סמני ניאון אחרים, למשל, ערכת ההדמיה RNA זה אינה תואמת עם מכתים phalloidin.
כל הגישות הקיימות של לימוד סינתזת RNA בתאים מבוססות על שילוב של nucleosides שונה לתוךRNA המתהווה וזיהוי של תוויות משולבות על ידי אמצעים שונים. הגישה החלוצית הייתה מבוססת על שימוש בסימנים מקדימים RNA שכותרתו רדיואקטיבית ואחרי זיהוי עם autoradiography. שיטה זו הובילה לגילוי של שלבי מחזור התא וממצאים חשובים אחרים; עם זאת, יש לו הרבה חסרונות כגון האופי המסורבל של עבודת רדיואקטיביות, זמן חשיפה ארוך ותמונות ברזולוציה נמוכות של autoradiography 6. מראש הבאים בתחום ניצל אמצעי immunochemistry לחסל את הצורך של רדיואקטיביות. RNA היה מתויג על ידי שילוב של הבר ואחריו גילוי immunochemistry. עם זאת, המחויב נוגדן יעיל denaturation חומצות גרעין כדי לשפר את הגישה ל-DNA או RNA שגרם לאובדן של מורפולוגיה של תאים פגומים אפיטופים של חלבונים רבים, מניעת הגילוי נוסף שלהם עם נוגדנים שכותרתו fluorescently 13. כניסתה של טכנולוגיה של כימיה לחץ "פישטה את צעד זיהוי ולאהוא הליך בהשוואה לautoradiography וimmunochemistry. הטכנולוגיה מבוססת על אזיד-alkyne תגובת cycloaddition Huisgen בי alkyne מסוף של 5-ethyniluridine נקשר עם אזיד מצומד עם fluorophore בנוכחות של Cu (I). התגובה ספציפית, מהירה, אינו דורשת כל צעדים נוספים, והוא בקלות בקנה אחד עם גילוי immunochemical של מרכיבי תא אחרים.
שימוש בטכנולוגיית ההדמיה RNA זה הראו שתאים, באותה האוכלוסייה monolayer, יש רמות סינתזת RNA שונות בתגובה להיפוקסיה. אנחנו מוגבלים הניסוי שלנו כדי לבחון את ההשפעה של ייצור RNA בלבד; עם זאת, הוא מלא אפשרי עם ערכת ההדמיה RNA זה כדי לבצע הותאמו תגובות זמנית נוספות, המאפשרות ניתוח מורכב יותר של ייצור RNA. לדוגמא, מכתים המשני באמצעות נוגדן ספציפי לסמנים של שעתוק פעיל כגון רמות של פולימראז פוספורילציה RNA השני או אפילו רכיבים של התרגומיםמכונות tion לתת אינדיקציה לכמות של RNA הפיק החדש הזה שהופך לחלבון אפשריות. חלבונים נוספים, כגון אקטין, חלבון זה לא צריך לשנות באופן משמעותי עם היפוקסיה, יכולים להיבדק כבקרה נוספת. יתר על כן, סוגי תאים שונים יכולים להיבדק, כפי שהוא מאוד סביר להניח כי תאים שונים יהיו תעריפים שונים RNA סינתזה ואפילו תגובות שונות להיפוקסיה.
שימוש בערכת ההדמיה RNA זה הוא פשוט למדי סיפק את הצעדים מבוצעים כפי שתואר. שלבים קריטיים בפרוטוקול כרוך ציפוי תא, קיבוע תא מכתים ורכישת תמונה. חשוב צלחת התאים בצפיפות תיארה כדי למנוע מעל או מתחת לנקודת מפגש בניסויים אשר תשפיע על התוצאה באופן משמעותי. כמו כן, חשוב להשתמש במקבע טרי, כדי להבטיח את "תמונת המצב" הטובה ביותר של התא נלקח ולטפל בעת שטיפת התאים לאחר הצביעה כדי לצמצם את בחינות הבגרותkground לרמה שמקובלת לניתוח יעיל. לבסוף, שיטת רכישה של תמונה היא חשובה וחיוני על מנת להשיג תמונות כי הם באיכות מספיק טובה לניתוח שלאחר מכן. אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ האור הטוב ביותר העומד לרשות לבחון דגימות אופטית כגון מיקרוסקופ שימוש בפרוטוקול זה שהוא זמין ברוב מרכזי המחקר האינטנסיביים ברחבי העולם.
Disclosures
JRS הוא מייסד של Glencoe תוכנה, Inc, חברה מסחרית שבסיסן בקוד פתוח שתורמת לOMERO.
Acknowledgments
JB הוא עמית קליני CRUK, כתלמיד Wellcome Trust PhD, המעבדה SR ממומנת על ידי מלגת מחקר בכירה CRUK (C99667/A12918). עבודה זו נתמכה על ידי שני פרסים Wellcome Trust אסטרטגיים (097945/B/11/Z ו095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
