Summary
हम इमेजिंग का उपयोग हाइपोक्सिया में वैश्विक शाही सेना संश्लेषण के विश्लेषण के लिए एक तकनीक का वर्णन. शाही सेना के क्लिक रसायन लेबलिंग पहले हाइपोक्सिया के तहत प्रदर्शन किया और एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक शाही सेना परिवर्तन के दृश्य की अनुमति देता नहीं किया गया है. यह दृष्टिकोण वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में सेल करने वाली सेल परिवर्तन के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति, मौजूदा औसतन आरएनए तकनीक पूरक.
Abstract
ऑक्सीजन की उपलब्धता की hypoxia या कम करने के कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में शामिल किया जाता है. आणविक स्तर पर, कोशिकाओं एक उपयुक्त और समन्वित सेलुलर प्रतिक्रिया माउंट करने के क्रम में एक विशेष transcriptional कार्यक्रम आरंभ. सेल उनकी गतिविधियों के लिए cofactor के रूप में आणविक ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है कि कई ऑक्सीजन सेंसर एंजाइमों के पास. ये prolyl-hydroxylases से histone demethylases को लेकर. हाइपोक्सिया के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण अध्ययन के बहुमत सेलुलर आबादी और औसत अध्ययन पर आधारित हैं, और hypoxic कोशिकाओं की एकल कोशिका विश्लेषण के रूप में शायद ही कभी किया जाता है. यहाँ हम माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और मात्रा का ठहराव जिसके बाद ऑक्सीजन नियंत्रित कार्य केंद्र में क्लिक करें, यह आरएनए इमेजिंग किट का उपयोग करके हाइपोक्सिया में एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक शाही सेना संश्लेषण के विश्लेषण की विधि का वर्णन है. समय के विभिन्न लंबाई के लिए हाइपोक्सिया के संपर्क में कैंसर कोशिकाओं का प्रयोग, आरएनए प्रत्येक कक्ष में लेबल और मापा जाता है. इस विश्लेषण की अनुमति देता हैhypoxic तनाव निम्न वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में लौकिक और सेल करने वाली सेल परिवर्तन के दृश्य.
Introduction
हाइपोक्सिया (कम ऑक्सीजन तनाव) एक ऊतक को सामान्य ऑक्सीजन की आपूर्ति से परेशान है जब होती है. पर्यावरण ऑक्सीजन कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण cues उपलब्ध कराने, एक पोषक तत्व और एक संकेत अणु दोनों है. पर्यावरण ऑक्सीजन में बदलाव Hypoxia inducible कारक (HIFs) के रूप में जाना एक आवश्यक प्रतिलेखन कारक परिवार की गतिविधि को नियंत्रित कि dioxygenases के एक समूह द्वारा महसूस कर रहे हैं. HIFs दो यूनिटों, α और β से बना रहे हैं. तीन ज्ञात HIF-α के isoforms (1, 2, और 3) और HIF-1β के कई ब्याह वेरिएंट हैं. HIF-1β रचनात्मक रूप में व्यक्त करने और पर्यावरण ऑक्सीजन का स्तर 1 द्वारा विनियमित नहीं है. HIF-α परिवार के सदस्यों को गतिशील prolyl-hydroxylases (छात्र पीएचडी) के एक वर्ग द्वारा विनियमित और फैक्टर HIF (एफआईएच) बाधा कर रहे हैं; HIF-α 2,3 के hydroxylation उत्प्रेरित करने के लिए एक सह कारक के रूप में ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है, जो दोनों के. Normoxia में HIF-α परिवार के सदस्यों hydroxylated रहे हैं और proteosom के लिए टैगE3-ligase, वॉन Hippel Lindau (VHL) द्वारा अल गिरावट. हाइपोक्सिया में छात्र पीएचडी करते हैं और एफआईएच निष्क्रिय हैं या एक कम गतिविधि है. HIF-α isoforms, स्थिर हो जाते हैं HIF-1β साथ एक heterodimer फार्म, और hypoxic पर्यावरण (चित्रा 1 ए) के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया प्रदान जीन है कि प्रतिलेखन प्रभाव 4.
शाही सेना के विश्लेषण के लिए वर्तमान तकनीकों एक दिया सेल आबादी में औसतन मूल्यों की मात्रा का ठहराव पर ध्यान केंद्रित. कोशिकाओं उन्हें उनके शत्रुतापूर्ण वातावरण 5 के लिए अनुकूल करने की अनुमति है कि जीन की एक बहुत बड़ी संख्या के प्रतिलेखन शुरू करके एक hypoxic उत्तेजना का जवाब. हालांकि, हाइपोक्सिया अक्सर एक ढाल के रूप में मौजूद है, और एक hypoxic वातावरण में कोशिकाओं को एक समान hypoxic प्रोत्साहन के अधीन नहीं हैं. हम हाइपोक्सिया में एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक शाही सेना संश्लेषण की जांच के लिए एक ऑक्सीजन नियंत्रित कार्य केंद्र में क्लिक करें, यह आरएनए इमेजिंग किट के एक कार्यान्वयन का वर्णन है.
शाही सेना इमेजिंग किट एक एक का उपयोग करता हैlkyne संशोधित न्यूक्लीओसाइड, 5 ethynyl uridine (ईयू) और कोशिकाओं और ऊतकों 6 में अस्थायी और स्थानिक वैश्विक शाही सेना संश्लेषण का पता लगाने के लिए सक्षम करने के chemoselective बंधाव. संक्षेप में, कोशिकाओं हाइपोक्सिया और यूरोपीय संघ की उपस्थिति में सुसंस्कृत के साथ व्यवहार कर रहे हैं. वे तो तय है और permeabilized और नवजात शाही सेना में यूरोपीय संघ के निगमन एक azide युक्त डाई के साथ यूरोपीय संघ के chemoselective बंधाव से पता चला है रहे हैं. इस प्रतिक्रिया के लिए एक विशिष्ट कार्यप्रवाह चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. हम हाइपोक्सिया के साथ इलाज से हुई कि एकल कोशिका के स्तर पर शाही सेना संश्लेषण की जांच करने के लिए शाही सेना इमेजिंग किट का इस्तेमाल किया.
alkyne टैग के छोटे आकार के लिए विशेष रूप से शाही सेना में संशोधित न्यूक्लीओसाइड के कुशल समावेश सक्षम बनाता है. chemoselective बंधाव या 'क्लिक' प्रतिक्रिया अत्यधिक कुशल, तेज और 7-10 विशिष्ट है. प्रतिक्रिया घटकों के सभी bioinert हैं और प्रतिक्रिया नहीं अत्यधिक तापमान या विलायकों की आवश्यकता है. क्लिक करें प्रतिक्रिया नकारतीपारंपरिक radiolabelling के लिए आवश्यकता और उत्पादन के बाद से परिणाम के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है प्रकाश है. इसके अलावा, पता लगाने के अणु आसानी आरएनए इंटरैक्टिव प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी सहित मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए अनुमति जटिल नमूने घुसना कर सकते हैं. इस शाही सेना इमेजिंग परख एलेक्सा Fluor और fluorescein (FITC) सहित कार्बनिक रंगों के साथ संगत है.
हम दूरस्थ वस्तुओं के लिए खुला माइक्रोस्कोपी पर्यावरण (OMERO) के एक कार्यान्वयन का उपयोग हमारी कोशिकाओं के इलाज के बाद शाही सेना संश्लेषण में परिवर्तन मापा. OMERO पर उपलब्ध खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, है http://openmicroscopy.org/ . इस माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, और बहुआयामी, विषम डेटासेट के प्रबंधन सहित जैविक डेटा की एक विस्तृत श्रृंखला, के उपयोग में सक्षम बनाता है. ग्राहक आवेदन दूरदराज के दृश्य और जटिल जैविक छवि डेटा 11 के विश्लेषण की अनुमति देता है;हम वैश्विक और एकल कक्ष शाही सेना संश्लेषण में दृश्य परिवर्तन यों तो इसका इस्तेमाल किया. इस माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इन आंकड़ों और हमारे शाही सेना इमेजिंग प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कदम नीचे दिखाई जाती हैं.
हम 24 घंटे के लिए हाइपोक्सिया के साथ मानव osteosarcoma का उपचार (U2OS) कोशिकाओं का एक वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में परिवर्तन देखा. सभी परिस्थितियों में, हम आरएनए उत्पादन के स्तर में सेल करने वाली सेल भिन्नता का पता चला. हाइपोक्सिया जोखिम के कम समय कोशिकाओं में नवजात शाही सेना के स्तर में महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम नहीं था. हालांकि, हाइपोक्सिया के 24 घंटे के लिए जोखिम कोशिकाओं में उत्पादित शाही सेना की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि हुई. हाइपोक्सिया के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अधिकांश 4-24 घंटे के रूप में जोखिम की लंबी अवधि, निम्न मापा जाता है. हालांकि, कुछ तंत्र उदाहरण के लिए, बहुत पहले जगह में डाल रहे हैं; NF-κB सक्रियण हाइपोक्सिया जोखिम 12 से 5-15 मिनट के भीतर होता है. कम हाइपो जांच करज़िया जोखिम बार इसलिए न्यायसंगत और इस तरह के सेल चक्र और apoptosis के रूप में और अधिक जटिल प्रतिक्रियाओं से इनकार भी कर सकता है.
Protocol
1. सेल संस्कृति और उपचार
- संस्कृति मानव osteosarcoma (U2OS) कोशिकाओं के लिए 1 टेबल में सूचीबद्ध अभिकर्मकों और उपकरणों को इकट्ठा करो. सभी अभिकर्मकों तैयार है और बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए लामिना हवा का प्रवाह हुड में सभी टिशू कल्चर तकनीक का संचालन
- के रूप में निम्नानुसार संस्कृति के माध्यम तैयार: 10% (एफसीएस) के अंतिम सांद्रता को प्राप्त करने के लिए DMEM 50 मिलीलीटर FCS, 5 एमएल एल glutamine और 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें, 2 मिमी (एल glutamine), 50 यू / एमएल ( पेनिसिलिन) और 50 यू / एमएल (स्ट्रेप्टोमाइसिन). एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम गर्म.
- इलाज के लिए कोशिकाओं को तैयार:
- 70% इथेनॉल में कई coverslips जीवाणुरहित, छह 3.5 सेमी प्लेटों के तल पर एक शुष्क हवा और जगह करने की अनुमति.
- 2 मिलीलीटर में coverslips वे कुओं के नीचे का पालन रहने को सुनिश्चित करने के लिए coverslip संदंश के साथ नीचे दबाने पूरा DMEM (37 डिग्री सेल्सियस) गरम विसर्जित कर दिया.
- उनके ऊतक पंथ से U2OS कोशिकाओं को अलग करें4 मिलीलीटर लागू करने, 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार धोने से ure थाली 0.05% trypsin EDTA (1%) गरम और 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating.
- 6ml में Resuspend कोशिकाओं trypsin-EDTA निष्क्रिय और एक hemocytometer का उपयोग गिनती करने के लिए पूरा DMEM गरम.
- बिंदु 1.3.1 में तैयार 3.5 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक के लिए थाली 2 x 10 5 कोशिकाओं. धीरे एक भी कोशिका वितरण सुनिश्चित करने के लिए थाली रॉक. कोशिकाओं उपचार करने से पहले रात भर पालन करने की अनुमति.
- हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में चार 3.5 सेमी प्लेटें रखकर कोशिकाओं का इलाज और सामान्य ऑक्सीजन की स्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अन्य दो 3.5 सेमी प्लेटें छोड़ दें. हाइपोक्सिया इलाज समाप्त होता है से पहले (हाइपोक्सिया इलाज कोशिकाओं के लिए हाइपोक्सिया कक्ष में) इलाज परिस्थितियों में शाही सेना लेबलिंग परख 1 घंटा शुरू करने के लिए तैयार रहो.
- 1 घंटा 15 मिनट, 1 घंटा 30 मिनट, 2 घंटा, और 24 घंटे के लिए hypoxia के लिए कोशिकाओं को बेनकाब. ये समय अंक लचीला और उपयोगकर्ता के निर्धारित होते हैं.
- एक normo का प्रयोग करेंसकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 4 घंटे के लिए Actinomycin डी (10 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) के साथ इलाज एक normoxic 3.5 सेमी थाली के रूप में xic 3.5 सेमी थाली. Actinomycin डी वैश्विक शाही सेना संश्लेषण के एक अवरोध है.
चेताते:
Hoechst 33342 एक ज्ञात उत्परिवर्तजन है.
DMSO के ऊतकों में जैविक अणुओं के प्रवेश की सुविधा के लिए जाना जाता है.
NaOH संक्षारक है.
एचसीएल संक्षारक है.
Paraformaldehyde सभी जानवरों को बेहद जहरीला है और मानव में मौत का कारण बन सकता है.
ट्राइटन X-100 सीधा संपर्क निम्न त्वचा में जलन पैदा कर सकता है.
Actinomycin डी जब त्वचा या निगल साथ संपर्क में विषैला होता है.
सभी खतरनाक रसायनों से निपटने जब उचित सावधानियों ले लो.
2. क्लिक करें, यह परख
- - 7.6, पीबीएस में 3.7% paraformaldehyde (पीएफए), 1% ट्राइटन X फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) 7.2 पीएच: क्लिक करें, यह परख किट के अलावा आवश्यक हैं जो निम्न अभिकर्मकों इकट्ठापीबीएस में -100, विआयनीकृत पानी (DH 2 हे), डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO), 10 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH), और 37% हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल); वैकल्पिक - पीएच सूचक स्ट्रिप्स.
- के रूप में निम्नानुसार क्लिक करें, यह प्रतिक्रिया करने से पहले एक ताजा पीएफए शेयर समाधान तैयार:
- 1.85 जी पीएफए, एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 3.5 मिलीलीटर DH 2 हे और एम NaOH of10 10 μl रखो. एक पानी स्नान करना और एक धूआं हुड में यह खड़ा करने के लिए माइक्रोवेव में एक बड़े बीकर में एच 2 ओ की 400 मिलीलीटर - 300 उबाल लें.
- नहाने के पानी में 50 मिलीलीटर फाल्कन प्लेस और धीरे पीएफए भंग कर दिया है जब तक समय समय पर ढक्कन रिहा, 10 मिनट के लिए आंदोलन.
- एक 37% समाधान में जिसके परिणामस्वरूप, एक और 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पीएफए समाधान सिरिंज.
- पीबीएस जोड़कर इस 10x पतला और केंद्रित एचसीएल की 12 μl के बारे में जोड़कर 6.8 पीएच को ले आओ. विकल्प: धूआं हुड में सूचक स्ट्रिप्स के साथ सही पीएच की पुष्टि करें.
- तुरंत प्रयोग करें या ओ की दुकानvernight में 4 डिग्री सेल्सियस
- इस प्रकार के रूप में शाही सेना इमेजिंग किट के शेयर समाधान तैयार:
- यूरोपीय संघ के 100 मिमी की एक शेयर समाधान में जिसके परिणामस्वरूप घटक एक के लिए 373 μl DH 2 हे जोड़ें. अप करने के लिए एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
- घटक बी (एलेक्सा Fluor 594) को DMSO के 85 μl जोड़ें और pipetting या vortexing द्वारा मिश्रण. अप करने के लिए एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर दोनों की दुकान.
- शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया बफर additive की एक 10X समाधान बनाने के लिए घटक ई 2 मिलीलीटर DH 2 हे जोड़ें. समाधान एक भूरे रंग विकसित जब अप करने के लिए एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, त्यागें.
- यूरोपीय संघ के साथ कोशिकाओं के लेबल: prewarmed पूरा मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) में 2.3 कदम में तैयार 100 मिमी शेयर से यूरोपीय संघ के एक 2X काम कर समाधान तैयार इस चरण के शेष प्रदर्शन और हाइपोक्सिया के साथ इलाज किया कोशिकाओं के लिए हाइपोक्सिया चैम्बर में 2.5 कदम. . मीडिया ऑन करने के लिए इस 2X काम कर समाधान के एक बराबर मात्रा जोड़कर 1X को पतलाकोशिकाओं aining. उपचार सेल संस्कृति परिस्थितियों में 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- सेल निर्धारण: अच्छी तरह से पीबीएस के साथ एक बार प्रत्येक धोने और उपचार परिस्थितियों में ऊपर 2.2 कदम से तैयार 3.7% पीएफए स्टॉक के 1 मिलीलीटर जोड़ें. उपचार परिस्थितियों में 15 मिनट के लिए सेते हैं. हाइपोक्सिया के साथ इलाज के नमूने इस बिंदु पर हाइपोक्सिया कक्ष से हटाया जा सकता है. लगानेवाला निकालें और पीबीएस के साथ अच्छी तरह से एक बार प्रत्येक धोने (जिम्मेदारी से बर्बाद पीएफए के निपटान के लिए ध्यान रखना). कमरे के तापमान पर अगले चरणों को पूरा करें.
- Permeabilization: धो समाधान निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पीबीएस में 1% ट्राइटन X-100 के 1 मिलीलीटर जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. Permeabilization बफर निकालें और पीबीएस के साथ अच्छी तरह से एक बार प्रत्येक धोने.
- लेबल शाही सेना जांच:
- DH 2 ओ में 10X समाधान (2.3 कदम में तैयार) 1:10 गिराए द्वारा शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया बफर additive की एक ताजा 1X काम कर समाधान तैयार
- शाही सेना इमेजिंग किट तैयार करेंतुरंत तैयार करने के बाद उपयोग के लिए 2 टेबल के अनुसार प्रतिक्रिया कॉकटेल.
- धोने के समाधान निकालें और प्रत्येक नमूने के लिए शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कॉकटेल के 500 μl जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते प्रकाश से रक्षा करते हैं.
- शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कॉकटेल निकालें और शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कुल्ला बफर (घटक एफ) के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धोने, तो शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कुल्ला बफर हटा दें.
- वैकल्पिक मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया: निर्माता की सिफारिशों के अनुसार इस बिंदु पर नमूनों की अतिरिक्त एंटीबॉडी लेबलिंग प्रदर्शन करना.
- डीएनए धुंधला: पीबीएस के साथ धो नमूने तो धोने समाधान निकालने के लिए. पीबीएस में Hoechst 33342 (घटक जी) 1:1,000 पतला. प्रत्येक अच्छी तरह से पतला Hoechst 33342 के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, प्रकाश से रक्षा करते हैं. Hoechst 33342 समाधान निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. धोने solutio निकालेंn और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए आगे बढ़ें.
3. प्रकाश माइक्रोस्कोपी
- माउंट Coverslips:
- एक मानक खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र पर बढ़ते मध्यम के 10 μl रखें.
- बढ़ते मध्यम से विभाज्य कवर करने के लिए नीचे खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र पर सेल की ओर से coverslip जगह. इस बाद में छवि अधिग्रहण अस्पष्ट होगा के रूप में बढ़ते मध्यम में बुलबुले की पीढ़ी से बचने के लिए ध्यान रखना.
- इसकी परिधि को स्पष्ट नेल वार्निश लगाने से खुर्दबीन स्लाइड पर coverslip रहो. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. प्रकाश से सुरक्षित रखें. नमूने बढ़ते निम्नलिखित -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- छवि अधिग्रहण: प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों मोल. डीएनए के लिए बाध्य एलेक्सा Fluor डाई और Hoechst 33342 के लिए लगभग प्रतिदीप्ति / उत्तेजना उत्सर्जन Maxima 3 तालिका में दिखाया गया.
- प्रदर्शनएक ठंडा सीसीडी कैमरे के साथ एक 40X/1.30 एनए तेल विसर्जन लेंस और छवियों पर कब्जा का उपयोग कर रहा इमेजिंग.
4. डेटा विश्लेषण
- इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका देखें) पूर्व OMERO ग्राहक को आयात करने के लिए उपयोग कर Deconvolve छवियों. अन्य सभी शर्तों को नियंत्रण normoxic कोशिकाओं से प्रतिपादन सेटिंग्स लगाने से माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में ही प्रयोग में सभी छवियों के लिए सेटिंग्स प्रतिपादन मानक के अनुसार.
- प्रत्येक छवि से नाभिक का चयन करने के लिए माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) उपकरण (सामग्री तालिका देखें) का प्रयोग करें. प्रत्येक रॉय के लिए मतलब तीव्रता प्राप्त करें और 30-50 की कोशिकाओं के बीच एक नंबर सहित, तीव्रता विश्लेषण विकल्प का चयन करके प्रत्येक शर्त के लिए औसत और मानक विचलन की गणना.
- 4.2 कदम टी में प्राप्त सभी व्यक्तिगत मतलब तीव्रता मूल्यों की साजिश रचने के एक डेटा रेखांकन सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग स्कैटर भूखंडों का निर्माणओ प्रत्येक शर्त के तहत कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता को दर्शाते हैं. वैकल्पिक रूप से औसत मतलब तीव्रता से अधिक नवजात शाही सेना के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने के लिए बार रेखांकन का निर्माण.
Representative Results
शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. हम मात्रात्मक एक व्यक्ति (एकल कक्ष) और वैश्विक स्तर (कोशिकाओं की आबादी) दोनों पर हाइपोक्सिया के साथ इलाज के बाद U2OS कोशिकाओं में कुल शाही सेना संश्लेषण निर्धारित करने के लिए इस प्रतिक्रिया का उपयोग किया. कोशिकाओं हाइपोक्सिया और यूरोपीय संघ की उपस्थिति में सुसंस्कृत साथ इलाज किया गया. वे तो तय है और permeabilized और यूरोपीय संघ के निगमन एक azide युक्त डाई के साथ यूरोपीय संघ के chemoselective बंधाव से पता लगाया था. यह पता लगाया है और प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में प्रतिक्रिया के परिणाम 'क्लिक'. चित्रा 2A इस प्रयोग से एक विशिष्ट परिणाम से पता चलता है. Fluorescently लेबल कोशिकाओं लाल pseudocolored रहे हैं और छवि दूरस्थ वस्तुओं के लिए खुला माइक्रोस्कोपी पर्यावरण (OMERO) में खोला गया है. इस माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर है एक निर्मित में व्यक्तिगत उप सेलुलर संरचनाओं का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आरओआई उपकरणमात्रात्मक tures और चुने हुए क्षेत्र के भीतर छवि तीव्रता का विश्लेषण. क्लाइंट प्रोग्राम में इस उपकरण का उपयोग निम्न डेटा उत्पादन का एक विशिष्ट उदाहरण चित्रा 2B में देखा जा सकता है; व्यक्तिगत सेल तीव्रता डेटा वैधता सुनिश्चित करने के लिए एक दृश्य की जांच के रूप में कार्य करता है कि प्रयोग से एक प्रतिनिधि छवि के साथ दिखाया गया है.
व्यक्तिगत सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता इलाज सेल आबादी के भीतर व्यक्तिगत सेलुलर तीव्रता का वितरण दिखाने के लिए एक स्कैटर चार्ट प्लॉट के रूप में किया जा सकता है. ग्राफ के इस प्रकार का एक उदाहरण चित्रा -2 में देखा जाता है. यह उपचार के परिणाम की एक तेजी से तुलना की अनुमति देता है और स्पष्ट रूप से अन्यथा मानक डेटा प्रतिनिधित्व का उपयोग कर छिप जाता है कि एक उपचार सेल आबादी के भीतर महत्वपूर्ण विविधता को दर्शाता है क्योंकि इस रास्ते में तीव्रता डेटा की साजिश रचने उपयोगी है. प्रतिक्रिया विविधता इस प्रयोग में दिलचस्प है एक समान hypoxic प्रोत्साहन एक था हालांकि क्योंकिकोशिकाओं को pplied, यह एक ही monolayer आबादी से हर कोशिका को अलग ढंग से इस उत्तेजना को प्रतिक्रिया है कि स्पष्ट है.
चित्रा 2 डी हमारे प्रयोग से समग्र परिणाम को दर्शाया गया है. एक उपचार आबादी के भीतर सभी कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति तीव्रता औसत और फिर इस बार चार्ट में प्लॉट किए जाते थे. एक छात्र के टी परीक्षण नियंत्रण से काफी भिन्न प्रत्येक उपचार समूह की सांख्यिकीय संभावना की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. दिलचस्प है, इन आंकड़ों समय पर एक से अधिक 1 घंटा 30 मिनट (U2OS कोशिकाओं हाइपोक्सिया के साथ व्यवहार कर रहे हैं जब समय के साथ वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि चलता है कि वहाँ * पी <0.01;. ** पी <0.05 और *** P <0.001 और एन> 30). इन आंकड़ों हाइपोक्सिया उपचार की लंबी अवधि के बाद, सेल भी इस शत्रुतापूर्ण hypoxic वातावरण में शाही सेना के उत्पादन पर अपने प्रयासों को ध्यान दिया है दिखाते हैं. Actinomycin डी इलाज पूरी तरह से उम्मीद के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता ablates.
चित्रा 1. ए HIF प्रणाली सेलुलर ऑक्सीजन में परिवर्तन का जवाब. इस सरलीकृत योजनाबद्ध हाइपोक्सिया में prolyl hydroxylase एंजाइमों (छात्र पीएचडी करते हैं) और वॉन-Hippel Lindau प्रोटीन (VHL) द्वारा इसके बाद polyubquitination द्वारा HIF-α hydroxylation (OH) को रोकने के द्वारा HIF heterodimer स्थिर. . बी शाही सेना संश्लेषण क्लिक आईटी परख का उपयोग कर पाया जा सकता है सेलुलर hypoxia के लिए सेल का जवाब है कि मदद असंख्य जीन की सक्रियता में HIF स्थिरीकरण परिणाम; कक्ष क्लिक करें प्रतिक्रिया प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो शाही सेना संश्लेषण का पता लगाता उपचार के बाद यूरोपीय संघ के साथ लेबल रहे हैं. एक बड़ा vers देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के आयन.
चित्रा 2. OMERO से ए स्क्रीनशॉट शाही सेना लेबलिंग निम्नलिखित ठेठ सूक्ष्म उत्पादन दिखाने के लिए. इस माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर जल्दी से अपनी इनबिल्ट आरओआई मैक्रो का उपयोग कर एक व्यक्ति सेल स्तर पर तीव्रता डेटा निकाल सकते हैं. इस आदेश से आउटपुट का एक स्क्रीनशॉट बी ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण में दिखाया गया है व्यक्तिगत सेल तीव्रता से अनुमान लगाया जा सकता है, जो की रेंज * पी सी. इन कुल डेटा का औपचारिक प्रतिनिधित्व डी. देखा जा सकता तितर बितर साजिश में देखा जा सकता है 0.01 <; ** पी <0.05 और *** 0.001 <पी और एन> 30. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
तालिका 1. U2OS कोशिकाओं के संवर्धन के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और उपकरण.
| रिएक्शन अवयव | Coverslips की संख्या | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| क्लिक करें, यह आरएनए प्रतिक्रिया बफर (घटक सी) | 428 μl | 856 μl | 1.7 मिलीलीटर | 2.1 मिलीलीटर | 2.58 मिलीलीटर | 4.3 मिलीलीटर |
| CuSO 4 (घटक डी) | 20 μl | 40 μl | 80 μl | 100 μl | 120 μl | 200 μl |
| एलेक्सा Fluor azide (2.3 कदम में तैयार) | 1.8 μl | 3.7 μl | 7.4 μl | 9.3 μl | 11.28 μl | 18.8 μl |
| क्लिक करें, यह प्रतिक्रिया बफर additive (2.3 कदम में तैयार) | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 250 μl | 300 μl | 500 μl |
| लगभग कुल मात्रा | 500 μl | 1 मिलीलीटर | 2 मिलीलीटर | 2.5 मिलीलीटर | 1.5 मिलीलीटर | 5 मिलीलीटर |
. तालिका 2 शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कॉकटेल: दाग coverslips की संख्या के अनुसार शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण घटकों के अनुपात का ब्यौरा संदर्भ तालिका.
| Fluorophore | उत्तेजना (एनएम) | उत्सर्जन (एनएम) |
| एलेक्सा Fluor 488 | 495 | 519 |
| डीएनए के लिए बाध्य Hoechst 33342, | 350 | 461 |
. 3 तालिका प्रतिदीप्ति / उत्तेजना उत्सर्जन Maxima: डीएनए के लिए बाध्य एलेक्सा Fluor डाई और Hoechst 33342 के लिए लगभग प्रतिदीप्ति / उत्तेजना उत्सर्जन अधिक से अधिक.
Discussion
हम osteosarcoma (U2OS) कोशिकाओं में शाही सेना संश्लेषण पर हाइपोक्सिया के प्रभाव की जांच करने के लिए एक शाही सेना इमेजिंग किट के हमारे उपयोग का वर्णन किया है. इस तकनीक अपेक्षाकृत सरल है और एक एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक प्रतिलेखन के बारे में डेटा प्रदान करता है. हम एक हाइपोक्सिया कक्ष में लेबलिंग को शामिल करने के लिए इस किट के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल संशोधित. हमारे ज्ञान करने के लिए इस हाइपोक्सिया में शाही सेना संश्लेषण में परिवर्तन को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग की पहली रिपोर्ट है. यह कोई रेडियोधर्मी आइसोटोप की आवश्यकता है और एक नियंत्रित वातावरण कार्य केंद्र में काम करने की सीमाओं के साथ तकनीकी रूप से संगत है के बाद से हम इस्तेमाल शाही सेना इमेजिंग किट हाइपोक्सिया में प्रयोग के लिए उपयुक्त है. इस तकनीक चिंता कुशल निर्धारण और नमूना की लेबलिंग के साथ आम समस्याओं. यह पीएफए नमूना ताजा है और नमूना की कम पृष्ठभूमि धुंधला सुनिश्चित करने के रूप में वर्णित 'क्लिक' प्रतिक्रिया का पालन करें कि धोने कदम प्रदर्शन कर रहे हैं ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि अत्यंत महत्वपूर्ण है. बी हैंackground प्रतिदीप्ति यह कदम 2.7.4 के बाद 1 मिलीलीटर शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कुल्ला बफर के साथ एक बार फिर से धोने के लिए सिफारिश की है एक समस्या बन जाता है.
यहां उल्लेख शाही सेना इमेजिंग किट का उपयोग करें और प्रतिक्रिया की विशिष्टता और गति में आसानी के मामले में शाही सेना इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है. यह तकनीक मुख्य रूप से यह नमूना लेबल करने के लिए लगने वाले समय के द्वारा सीमित है. शाही सेना इमेजिंग किट आमतौर पर इस समय सीमा के भीतर घटित होता है कि वैश्विक शाही सेना में तेजी से बदलाव की परीक्षा रोकता है एक 1 घंटा लेबलिंग अवधि की आवश्यकता है. इस कारण हमारी पहली बार बिंदु 1 घंटा और 15 मिनट तक ही सीमित है यह है. तकनीक काफी हद तक उदाहरण के लिए, इस शाही सेना इमेजिंग किट Phalloidin धुंधला के साथ संगत नहीं है, अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ अनुकूलता अभिकर्मक से संबंधित कुछ अन्य सीमाओं के साथ जुड़ा हुआ है.
कोशिकाओं में शाही सेना संश्लेषण का अध्ययन के सभी मौजूदा दृष्टिकोण में संशोधित nucleosides के समावेश पर आधारित हैंनवजात शाही सेना और अलग अलग तरीकों से शामिल लेबल का पता लगाने. अग्रणी दृष्टिकोण autoradiography साथ पता लगाने के द्वारा पीछा radioactively लेबल शाही सेना व्यापारियों के प्रयोग पर आधारित था. इस विधि सेल चक्र चरणों और अन्य महत्वपूर्ण निष्कर्ष यह एक खोज हुई; हालांकि, यह इस तरह की रेडियोधर्मिता का काम है, लंबे समय जोखिम बार और autoradiography 6 के कम संकल्प छवियों के बोझिल प्रकृति के रूप में नुकसान का एक बहुत कुछ है. क्षेत्र में अगले अग्रिम रेडियोधर्मिता की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए immunochemistry का साधन शोषण किया. शाही सेना immunochemistry का पता लगाने के द्वारा पीछा ब्रू के निगमन द्वारा चिह्नित किया गया. हालांकि, कुशल एंटीबॉडी डीएनए या सेल आकारिकी की क्षति हुई और fluorescently लेबल एंटीबॉडी 13 के साथ उनके आगे का पता लगाने को रोकने, कई प्रोटीन की epitopes क्षतिग्रस्त है कि शाही सेना के लिए उपयोग में सुधार करने के लिए न्यूक्लिक एसिड विकृतीकरण आवश्यक बाइंडिंग. 'क्लिक रसायन शास्त्र' प्रौद्योगिकी की शुरूआत का पता लगाने के कदम और टी सरलीकृतवह प्रक्रिया autoradiography और immunochemistry की तुलना में. प्रौद्योगिकी 5 ethyniluridine के टर्मिनल alkyne घन (आई) की उपस्थिति में fluorophore साथ संयुग्मित azide के साथ बांध जहां azide-alkyne Huisgen cycloaddition प्रतिक्रिया पर आधारित है. प्रतिक्रिया, तेजी से, विशिष्ट है किसी भी अतिरिक्त कदम की आवश्यकता नहीं है, और अन्य सेल घटकों के immunochemical पता लगाने के साथ आसानी से संगत है.
इस शाही सेना इमेजिंग तकनीक का उपयोग हम कोशिकाओं, एक ही monolayer आबादी में, हाइपोक्सिया के जवाब में अलग शाही सेना संश्लेषण का स्तर है कि दिखाया. हम आरएनए उत्पादन केवल के प्रभाव की जांच करने के लिए हमारे प्रयोग प्रतिबंधित; हालांकि, यह आरएनए उत्पादन का एक और अधिक जटिल विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं कि संशोधित, अतिरिक्त मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए इस शाही सेना इमेजिंग किट के साथ पूरी तरह से संभव है. उदाहरण के लिए, ऐसे phosphorylated शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय या transla के भी घटक के स्तर के रूप में सक्रिय प्रतिलेखन के मार्कर के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी का उपयोग माध्यमिक धुंधलाप्रोटीन में बदल जाता है कि इस नव निर्मित शाही सेना की राशि का एक संकेत देने के लिए tion मशीनरी संभव हो रहे हैं. ऐसे actin, हाइपोक्सिया के साथ काफी परिवर्तन नहीं होना चाहिए कि एक प्रोटीन के रूप में अतिरिक्त प्रोटीन, एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में परीक्षण किया जा सकता है. यह विभिन्न कक्षों अलग शाही सेना संश्लेषण दरों और hypoxia के लिए भी अलग प्रतिक्रियाओं होगा बहुत संभावना है कि इसके अलावा, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का परीक्षण किया जा सकता है.
इस शाही सेना इमेजिंग किट के उपयोग के रूप में वर्णित चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं प्रदान की काफी सरल है. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम सेल चढ़ाना, सेल निर्धारण और धुंधला हो जाना और छवि अधिग्रहण शामिल है. यह काफी परिणाम को प्रभावित करेगा जो प्रयोग पर पर या संगम के तहत रोकने के लिए वर्णित घनत्व पर कोशिकाओं थाली करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसे ले लिया है सेल का सबसे अच्छा 'स्नैपशॉट' सुनिश्चित करने, ताजा लगानेवाला का उपयोग करने के लिए और बीएसी को कम करने के धुंधला के बाद कोशिकाओं को धोने जब देखभाल करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैकुशल विश्लेषण के लिए स्वीकार्य है कि एक स्तर तक kground. अंत में, छवि अधिग्रहण की विधि बाद के विश्लेषण के लिए एक अच्छा पर्याप्त गुणवत्ता के हैं कि छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम ऑप्टिकली ऐसे में विश्व स्तर पर सबसे अधिक अनुसंधान गहन केन्द्रों पर उपलब्ध है, जो इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता माइक्रोस्कोप के रूप में नमूनों की जांच करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना चाहिये.
Disclosures
JRS Glencoe सॉफ्टवेयर, Inc, OMERO लिए योगदान देता है कि एक खुला स्रोत अमेरिका स्थित वाणिज्यिक कंपनी का संस्थापक है.
Acknowledgments
जेबी एक वेलकम ट्रस्ट पीएचडी छात्र, एसआर प्रयोगशाला एक CRUK सीनियर रिसर्च फैलोशिप (C99667/A12918) द्वारा वित्त पोषित है, के रूप में एक CRUK नैदानिक साथी है. यह काम दो वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार (097945/B/11/Z और 095931/Z/11/Z) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
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