Summary
Descriviamo una tecnica per l'analisi della sintesi dell'RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell'RNA globale.
Abstract
Ipossia o abbassamento della disponibilità di ossigeno è coinvolto in molti processi fisiologici e patologici. A livello molecolare, le cellule iniziano un particolare programma trascrizionale per montare una risposta cellulare appropriato e coordinato. La cella possiede parecchi enzimi sensore di ossigeno che richiedono ossigeno molecolare come cofattore per la loro attività. Queste vanno da prolina-idrossilasi a demethylases istoni. La maggior parte degli studi che analizzano risposte cellulari all'ipossia sono basati su popolazioni cellulari e studi medi, e come tale analisi singola cella di cellule ipossiche sono raramente eseguita. Qui si descrive un metodo di analisi della sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia utilizzando i kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllata, seguita da analisi al microscopio e quantificazione. Utilizzando cellule tumorali esposte all'ipossia per periodi di tempo diversi, RNA è etichettato e misurato in ogni cella. Questa analisi consentela visualizzazione e cellula-cellula cambiamenti temporali sintesi dell'RNA globale seguenti stress ipossico.
Introduction
Ipossia (tensioni basse ossigeno) si verifica quando il normale di ossigeno ad un tessuto è disturbato. Ossigeno ambientale è sia una sostanza nutritiva e una molecola di segnalazione, fornendo spunti importanti per vari tipi di cellule. Le variazioni di ossigeno ambientale vengono rilevati da un gruppo di diossigenasi che controllano l'attività di un fattore di trascrizione essenziale famiglia conosciuta come i fattori inducibili ipossia (HIF). Le HIF sono composte da due subunità, α e β. Ci sono tre isoforme conosciute di HIF-α (1, 2, e 3) e molteplici varianti di splicing di HIF-1β. HIF-1β è costitutivamente espresso e non regolato da livelli di ossigeno ambientali 1. I membri della famiglia HIF-α sono regolate in modo dinamico da una classe di prolina-idrossilasi (dottorati di ricerca) e il fattore di inibizione HIF (FIH); che richiedono entrambi ossigeno come co-fattore per catalizzare l'idrossilazione di HIF-α 2,3. In normoxia i familiari HIF-α sono idrossilati e contrassegnati per proteosomal degrado della E3-ligasi, von Hippel Lindau (VHL). In ipossia i dottorati e FIH sono inattivi o hanno una ridotta attività. Le isoforme HIF-α stabilizzarsi, formano un eterodimero con HIF-1β, e per effetto di trascrizione di geni che forniscono la risposta cellulare all'ambiente ipossico (Figura 1A) 4.
Attuali tecniche di analisi dell'RNA concentrano sulla quantificazione dei valori medi di tutti una data popolazione cellulare. Le cellule rispondono a uno stimolo ipossico avviando la trascrizione di una miriade di geni che permettono loro di adattarsi al loro ambiente ostile 5. Tuttavia, ipossia esiste spesso una sfumatura e cellule in un ambiente ipossico non sono soggetti ad uno stimolo ipossico uniforme. Descriviamo una implementazione dei kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllato per esaminare la sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia.
Il kit imaging RNA utilizza un anucleoside lkyne modificati, 5-etinile uridina (UE) e legatura chemoselective abilitare il rilevamento di sintesi di RNA globale temporalmente e spazialmente in cellule e tessuti 6. Brevemente, le cellule vengono trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Vengono poi fissate e permeabilizzate e l'incorporazione UE in RNA nascente viene rilevato mediante legatura chemoselective dell'UE con azide contenente colorante. Un flusso di lavoro tipico per questa reazione è mostrato in Figura 1B. Abbiamo utilizzato il kit imaging RNA esaminare sintesi di RNA a livello di singola cellula che ha portato dal trattamento con ipossia.
Le ridotte dimensioni del tag alchino consente incorporazione efficiente del nucleoside modificato in RNA specifico. La legatura chemoselective o 'click' di reazione è altamente efficiente, veloce e specifico 7-10. Tutti i componenti di reazione sono bioinerte e la reazione non richiede temperature estreme o solventi. La reazione click negail requisito per la radiomarcatura convenzionale e permette la visualizzazione diretta dei risultati poiché l'uscita è leggero. Inoltre, la molecola di rilevamento può facilmente penetrare campioni complessi per consentire analisi multiplex compresi gli anticorpi per la rilevazione di proteine RNA-interattiva. Questo test di imaging RNA è compatibile con coloranti organici, tra cui Alexa Fluor e fluoresceina (FITC).
Abbiamo misurato il cambiamento di sintesi di RNA dopo il trattamento delle nostre cellule utilizzando un'implementazione dell'ambiente microscopia porta oggetti remoti (OMERO). OMERO è un software open-source, disponibile all'indirizzo http://openmicroscopy.org/ . Questo software microscopio di visualizzazione e analisi delle immagini consente l'accesso a, e l'utilizzo di una vasta gamma di dati biologici, compresa la gestione di set di dati multidimensionali, eterogenei. L'applicazione client consente la visualizzazione e l'analisi di complessi dati immagine biologica 11 remoto;abbiamo usato per quantificare i cambiamenti visivi a livello mondiale e un'unica sintesi di RNA cellulare. Questi dati e le operazioni necessarie per analizzare il nostro esperimento di imaging RNA utilizzando questo microscopio visualizzazione di immagini e software di analisi sono riportati di seguito.
Abbiamo esaminato i cambiamenti nella sintesi di RNA globale a seguito del trattamento di osteosarcoma umano (U2OS), le cellule con ipossia fino a 24 ore. In tutte le condizioni, abbiamo rilevato cellula-cellula variazione del livello di produzione di RNA. Tempi brevi di esposizione all'ipossia non hanno comportato cambiamenti significativi al livello di RNA nascente nelle cellule. Tuttavia, l'esposizione di 24 ore di ipossia determinato un aumento significativo della quantità di RNA prodotta in cellule. La maggior parte delle risposte cellulari all'ipossia sono misurate seguenti periodi prolungati di esposizione, come quelli 4 a 24 ore. Tuttavia, alcuni meccanismi vengono messi in atto molto prima, per esempio; Attivazione di NF-kB si verifica entro 5-15 min dell'ipossia esposizione 12. Indagare ipo brevetempi di esposizione Xia è quindi giustificato e potrebbe sminuire le risposte più complesse, come il ciclo cellulare e l'apoptosi.
Protocol
1. Cella Cultura e trattamento
- Raccogliere i reagenti e attrezzature elencati nella tabella 1 alla cultura osteosarcoma umano (U2OS) cellule. Preparare tutti i reagenti e condurre tutte le tecniche di coltura tissutale nella cappa a flusso laminare per garantire la sterilità
- Preparare il terreno di coltura come segue: aggiungere 50 ml di FCS, 5 ml di L-glutammina e 5 ml di penicillina / streptomicina alla DMEM per ottenere concentrazioni finali di 10% (FCS), 2 mM (L-glutammina), 50 U / ml ( penicillina) e 50 U / ml (streptomicina). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Preparare le cellule per il trattamento:
- Sterilizzare diversi coprioggetto in etanolo al 70%, lasciare asciugare e posizionare uno sul fondo di sei piastre 3,5 cm.
- Immergere i coprioggetti in 2 ml riscaldati DMEM completa (37 ° C), premendo con le pinze coprioggetto per garantire che essi rimangano aderito al fondo dei pozzetti.
- Staccare le cellule U2OS dal loro culto tessutopiastra ure lavando una volta con 3 ml di PBS, applicando 4 ml riscaldato 0,05% tripsina-EDTA (1%) e incubando a 37 ° C per 7 minuti.
- Risospendere le cellule in 6ml riscaldato completo DMEM per inattivare la tripsina-EDTA e contare con un emocitometro.
- Piastra 2 x 10 5 cellule a ciascuna delle piastre cm 3,5 preparate al punto 1.3.1. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione delle cellule ancora. Permettono alle cellule di aderire notte prima del trattamento.
- Trattare le cellule ponendo quattro piastre 3,5 cm nella workstation ipossia e lasciare gli altri due piastre 3,5 cm di incubatrice a 37 ° C in condizioni normali dell'ossigeno. Essere pronta ad avviare l'RNA etichettatura saggio in condizioni trattati (nella camera di ipossia per le cellule trattate ipossia) 1 ora prima del trattamento ipossia termina.
- Esporre cellule all'ipossia per 1 h 15 min, 1 ora e 30 min, 2 ore e 24 ore. Questi punti temporali sono flessibili e determinato dall'utente.
- Utilizzare un normoxic piastra da 3.5 cm come controllo positivo e un normossia piastra 3,5 centimetri trattata con actinomicina D (10 mcg / ml concentrazione finale) per 4 ore come controllo negativo. Actinomicina D è un inibitore della sintesi dell'RNA globale.
Avvertenze:
Hoechst 33342 è un agente mutageno conosciuto.
DMSO è noto per facilitare l'ingresso di molecole organiche nei tessuti.
NaOH è corrosiva.
HCl è corrosivo.
Paraformaldeide è altamente tossico per tutti gli animali e può causare la morte negli esseri umani.
Triton X-100 può causare irritazione della pelle a seguito di contatto diretto.
Actinomicina D è tossico a contatto con la pelle e per ingestione.
Prendere le opportune precauzioni quando si maneggia tutte le sostanze chimiche pericolose.
2. Click-iT Assay
- Raccogliere i seguenti reagenti necessari oltre al kit di analisi Istruzioni-iT: tampone fosfato salino (PBS) pH 7.2 - 7.6, 3.7% paraformaldeide (PFA) in PBS, 1% Triton X-100 In PBS, acqua deionizzata (dH 2 O), dimetilsolfossido (DMSO), 10 M di idrossido di sodio (NaOH) e acido cloridrico 37% (HCl); Strisce indicatrici di pH - opzionale.
- Preparare una soluzione stock PFA fresco prima di eseguire la reazione di Click-iT come segue:
- Mettere 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O e 10 microlitri di10 M NaOH in un tubo Falcon da 50 ml. Bollire 300-400 ml di H 2 O in un grande bicchiere nel microonde per fare un bagno di acqua e sopportare questo in una cappa aspirante.
- Posizionare il 50 ml Falcon in bagno di acqua e agitare delicatamente per 10 min, rilasciando periodicamente il coperchio finché il PFA è sciolta.
- Siringa la soluzione PFA attraverso un filtro da 0,2 micron in un'altra provetta Falcon da 50 ml, ottenendo così una soluzione 37%.
- Diluire la 10x aggiungendo PBS e portare il pH a 6,8 con l'aggiunta di circa 12 ml di HCl concentrato. Opzione: Confermare il corretto pH con le strisce indicatore della cappa.
- Utilizzare immediatamente o conservare overnight a 4 ° C.
- Preparare le soluzioni madre del kit imaging RNA come segue:
- Aggiungere 373 microlitri dH 2 O al componente A con conseguente in una soluzione stock di 100 mm di UE. Conservare a -20 ° C per un massimo di un mese.
- Aggiungere 85 ml di DMSO al componente B (Alexa Fluor 594) e mescolare pipettando o vortex. Conservare sia a -20 ° C per un massimo di un anno.
- Aggiungere 2 ml dH 2 O per il componente e per creare una soluzione 10X dell'additivo tampone di reazione kit imaging RNA. Conservare a -20 ° C per un massimo di un anno, scartare quando la soluzione si sviluppa un colore marrone.
- Etichettatura delle cellule con l'UE: Preparare una soluzione di lavoro 2X dell'UE dal magazzino 100 mM preparata nella fase 2.3 nel mezzo completo preriscaldata (37 ° C) Eseguire il resto di questo passo e passo 2,5 nella camera di ipossia delle cellule trattate con ipossia. . Diluire a 1X aggiungendo un volume uguale di questa soluzione di lavoro 2X per il cont mezziaining cellule. Incubare per 1 ora in trattamento condizioni di coltura delle cellule.
- Fissazione delle cellule: Lavare ogni bene una volta con PBS e aggiungere 1 ml di 3,7% PFA magazzino preparate al passo 2.2 in condizioni di trattamento. Incubare per 15 min in condizioni di trattamento. I campioni trattati con ipossia possono essere rimossi dalla camera di ipossia a questo punto. Togliere il fissativo e lavare ogni pozzetto una volta con PBS (Prenditi cura di disporre di PFA sprecare responsabilmente). Eseguire le prossime tappe a temperatura ambiente.
- Permeabilizzazione: Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml di 1% Triton X-100 in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer permeabilizzazione e lavare ogni pozzetto una volta con PBS.
- Etichettato RNA Detection:
- Preparare una soluzione fresca 1X lavoro di additivo immagini RNA tampone di reazione kit diluendo la soluzione 10X (preparata nella fase 2.3) 1:10 con dH 2 O.
- Preparare il kit imaging RNACocktail di reazione secondo la Tabella 2 per l'uso subito dopo la preparazione.
- Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 500 ml di RNA di imaging cocktail reazione kit per ogni campione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Rimuovere la rappresentazione RNA cocktail reazione kit e lavare una volta con 1 ml di RNA di imaging reazione kit tampone di lavaggio (componente F), quindi rimuovere la reazione kit buffer di risciacquo di imaging RNA.
- Reazione multiplex Optional: Eseguire etichettatura anticorpi supplementare di campioni, a questo punto secondo le raccomandazioni del fabbricante.
- Colorazione DNA: Lavare i campioni con PBS quindi rimuovere la soluzione di lavaggio. Diluire la Hoechst 33342 (Component G) 1:1000 in PBS. Aggiungere 1 ml di diluito Hoechst 33342 in ciascun pozzetto ed incubare per 15 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione Hoechst 33342 e lavare le cellule due volte con PBS. Rimuovere la solutio lavaggion e procedere al microscopio ottico.
3. Microscopia ottica
- Mount Coprivetrini:
- Trasferire 10 ml di mezzo di fissaggio sul centro di un vetrino da microscopio standard.
- Posizionare il coprioggetto con cella lato sul centro del vetrino da microscopio a coprire l'aliquota di mezzo di montaggio. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle nel mezzo di montaggio come questo oscurare la successiva acquisizione delle immagini.
- Attaccare il vetrino al vetrino da microscopio applicando smalto chiaro al suo perimetro. Lasciare asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce. I campioni possono essere conservati a -20 ° C in seguito montaggio.
- Acquisizione Image: Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a grande campo in grado di rilevare la fluorescenza. Approssimativamente maxima emissione di fluorescenza / eccitazione per il colorante Alexa Fluor e Hoechst 33342 legato al DNA sono mostrati in Tabella 3.
- Perform Imaging utilizza una lente immersione in olio 40X/1.30 NA e catturare immagini con una telecamera CCD raffreddata.
4. Analisi dei dati
- Deconvolve immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini (vedi tabella Materials) prima di importare al cliente OMERO. Normalizzare il rendering impostazioni per tutte le immagini nello stesso esperimento nel software microscopio visualizzazione e analisi d'immagine applicando le impostazioni di rendering da cellule normossiche controllo di tutte le altre condizioni.
- Utilizzare la regione di interesse (ROI) strumento nel software microscopio visualizzazione di immagini e analisi (vedi tabella materiali) per selezionare nuclei da ogni immagine. Avere intensità media per ogni ROI e calcolare la deviazione media e standard per ciascuna condizione scegliendo l'opzione analisi intensità, compreso un numero compreso tra 30-50 cellule.
- Costruire diagrammi a dispersione utilizzare un software di grafica di dati (vedi tabella Materials), riportando tutti i singoli valori di intensità medi ottenuti nella fase 4.2 to riflettere la variabilità tra le cellule sotto ogni condizione. In alternativa, costruire grafici a barre per rappresentare l'intensità media media più la deviazione standard di RNA nascente.
Representative Results
Uno schema della reazione kit imaging RNA è mostrato nella Figura 1B. Abbiamo usato questa reazione per determinare quantitativamente la sintesi di RNA totale in cellule U2OS dopo il trattamento con ipossia a livello sia globale (popolazione di cellule) individuale (singola cella) e. Le cellule sono state trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Sono state poi fissate e permeabilizzate e da parte dell'UE è stato rilevato da legatura chemoselective dell'UE con azide contenente colorante. Questo 'click' i risultati di reazione in un emissione di fluorescenza che può essere rilevato e quantificato utilizzando la microscopia a fluorescenza. Figura 2A mostra un tipico risultato di questo esperimento. Cellule fluorescente sono pseudocolored rosso e l'immagine 'stato aperto in ambiente di microscopia aperto per gli oggetti remoti (OMERO). Questo software microscopio visualizzazione e analisi d'immagine ha un attrezzo incorporato ROI che può essere utilizzato per selezionare individuo struttura subcellulareScritture e quantitativamente analizzano l'intensità dell'immagine all'interno della regione prescelta. Un tipico esempio di output dati in seguito all'uso di questo strumento nel programma client può essere visto in Figura 2B; intensità delle singole celle sono riportati accanto un'immagine rappresentativa dall'esperimento che serve come un controllo visivo per accertare la validità dei dati.
Le singole intensità di fluorescenza delle cellule possono essere riportati in grafico a dispersione per mostrare la distribuzione delle singole intensità cellulari all'interno della popolazione di cellule trattate. Un esempio di questo tipo di grafico è visto in Figura 2C. Rappresentazione grafica dei dati di intensità in questo modo è utile perché permette un rapido confronto dei risultati di trattamento e dimostra chiaramente il notevole eterogeneità una popolazione cellulare trattamento che è altrimenti oscurata utilizzando rappresentazione dei dati standard. L'eterogeneità risposta è interessante in questo esperimento perché anche se uno stimolo ipossico uniforme era unpplied alle cellule, è evidente che ogni cellula dalla stessa popolazione monostrato risponde diversamente a questo stimolo.
Figura 2D raffigura il risultato complessivo del nostro esperimento. Intensità di fluorescenza di tutte le cellule all'interno di una popolazione di trattamento sono stati mediati e poi tracciate in questo grafico a barre. T-test di Student è stato utilizzato per calcolare la probabilità statistica di ciascun gruppo di trattamento significativamente diversa dal controllo. È interessante notare, questi dati mostrano che vi è un aumento statisticamente significativo sintesi di RNA globale nel tempo quando le cellule vengono trattate con U2OS ipossia (a volte maggiore di 1 ora e 30 min * p <0.01;. ** P <0,05 e p *** <0.001 e n> 30). Questi dati mostrano che dopo periodi di trattamento più lunghi ipossia, la cella concentra i suoi sforzi sulla produzione di RNA anche in questo ambiente ipossico ostile. Actinomicina D trattamento ablates completamente l'intensità di fluorescenza come previsto.
Figura 1. A. Il sistema HIF risponde ai cambiamenti di ossigeno cellulare. In questo ipossia schema semplificato stabilizza dell'eterodimero HIF impedendo HIF-α idrossilazione (-OH) dagli enzimi prolyl idrossilasi (dottorati di ricerca) e la sua successiva polyubquitination di von Hippel-Lindau proteine (VHL). Risultati stabilizzazione HIF l'attivazione di una miriade di geni che aiutano il rispondono cellulare all'ipossia cellulare B. sintesi di RNA può essere rilevato utilizzando il saggio Click-IT.; le cellule sono etichettati con l'UE dopo il trattamento la reazione Click rileva sintesi di RNA che può essere quantificata da intensità di fluorescenza e microscopia ottica. Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.
Figura 2. A. Screenshot da OMERO per mostrare output tipico microscopio a seguito di etichettatura RNA. Questo software microscopio visualizzazione di immagini e di analisi in grado di estrarre rapidamente i dati di intensità su un livello di singola cellula utilizzando il macro ROI integrato. Uno screenshot del output di questo comando è mostrato in sintesi B. globale RNA può essere dedotta dalla intensità singola cella, l'intervallo di cui può essere visto in un diagramma a dispersione C. Una rappresentazione formale di questi dati aggregati può essere visto D. * p <0.01; ** P <0.05 e *** p <0.001 e n> 30. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
| Reagenti coltura cellulare |
| Tampone fosfato (PBS) a pH 7,2-7,6 |
| Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) |
| Siero fetale di vitello (FCS) sterilizzato per filtrazione |
| Penicillina / streptomicina |
| L-glutammina |
| 0,05% tripsina-EDTA (1%) |
| 70% di etanolo |
| Actinomicina D (1 mg / mL magazzino) |
| Cella Cultura Attrezzature |
| Sterile Pasteur Pipettes |
| Una gamma di colture cellulari trattati plastico adatto per la manutenzione e il trattamento di cellule in coltura |
| Bagnomaria a 37 ° C |
| Cappa a flusso d'aria laminare |
| Incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 |
| Ipossia Workstation fissata a 37 ° C, 5% CO 2, 1% O 2 |
| Vetrini |
| pinze di precisione |
| Emocitometro |
Tabella 1. Reagenti e le attrezzature necessarie per la coltura delle cellule U2OS.
| Componenti di reazione | Numero di Coprivetrini | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| Click-iT tampone di reazione RNA (Component C) | 428 microlitri | 856 microlitri | 1,7 ml | 2.1 ml | 2.58 ml | 4.3 ml |
| CuSO 4 (Component D) | 20 microlitri | 40 microlitri | 80 microlitri | 100 microlitri | 120 microlitri | 200 ml |
| Alexa Fluor azide (preparato nella fase 2.3) | 1,8 microlitri | 3,7 microlitri | 7.4 microlitri | 9.3 microlitri | 11.28 microlitri | 18.8 ml |
| Click-iT Additivo tampone di reazione (Preparata nel passo 2.3) | 50 microlitri | 100 microlitri | 200 ml | 250 microlitri | 300 ml | 500 microlitri |
| Approssimativa volume totale | 500 microlitri | 1 ml | 2 ml | 2,5 ml | 1,5 ml | 5 ml |
. Tabella 2 di imaging RNA cocktail di reazione kit: Tabella di riferimento dettagliare rapporto dei componenti della miscela master per l'imaging RNA reazione kit in base al numero di vetrini da colorare.
| Fluoroforo | Eccitazione (nm) | Emission (nm) |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 |
| Hoechst 33342, legato al DNA | 350 | 461 |
. Tabella 3 massimi di emissione di fluorescenza / eccitazione: approssimativamente massima emissione di fluorescenza / eccitazione per Alexa Fluor colorante e Hoechst 33342 legato al DNA.
Discussion
Abbiamo descritto il nostro utilizzo di un kit imaging RNA per esaminare gli effetti dell'ipossia sulla sintesi di RNA in osteosarcoma (U2OS) cellule. Questa tecnica è relativamente semplice e fornisce dati relativi trascrizione globale a livello di singola cellula. Abbiamo modificato il protocollo convenzionale per questo kit per incorporare etichettatura in una camera di ipossia. A nostra conoscenza questo è il primo rapporto di utilizzo di questa tecnica per misurare le variazioni di sintesi dell'RNA in ipossia. Il kit imaging RNA abbiamo usato è adatto per la sperimentazione in ipossia poiché richiede isotopi radioattivi e tecnicamente compatibili con le limitazioni di lavorare in una workstation atmosfera controllata. I problemi più comuni con questo fissazione efficiente tecnica preoccupazione e l'etichettatura del campione. E 'estremamente importante che il PFA utilizzata per fissare il campione è fresco e le fasi di lavaggio che seguono la reazione' scegliere 'vengono eseguite come descritto per garantire bassa bassa colorazione del campione. Se background fluorescenza diventa un problema, si raccomanda di lavare ancora una volta con 1 ml di imaging RNA tampone di reazione kit di risciacquo dopo il punto 2.7.4.
Il kit imaging RNA qui menzionato rappresenta un avanzamento significativo nella tecnologia di imaging RNA in termini di semplicità d'uso e la specificità e la velocità di reazione. Questa tecnica è limitata principalmente dal tempo necessario per etichettare il campione. Il kit imaging RNA richiede un periodo di etichettatura 1 ora che impedisce l'esame dei rapidi cambiamenti RNA globale che si verificano di solito entro questo lasso di tempo. E 'per questo motivo il nostro punto prima volta è limitato a 1 ora e 15 min. La tecnica è associata con poche altre limitazioni che riguardano principalmente reagente compatibilità con altri marcatori fluorescenti, per esempio, questo kit imaging RNA non è compatibile con falloidina colorazione.
Tutti gli approcci esistenti di studiare la sintesi di RNA in cellule sono basati su incorporazione di nucleosidi modificati nellaRNA nascente e il rilevamento di etichette incorporate con mezzi diversi. L'approccio pionieristico si è basata sull'utilizzo di precursori di RNA marcati radioattivamente seguita da rilevamento con autoradiografia. Questo metodo ha portato alla scoperta di fasi del ciclo cellulare e altri reperti importanti; tuttavia, ha un sacco di svantaggi, come la macchinosità del lavoro radioattività, tempi di esposizione lunghi e le immagini a bassa risoluzione di autoradiografia 6. Il successivo avanzamento nel campo sfruttato mezzi dell'immunochimica per eliminare la necessità di radioattività. RNA è stato etichettato per incorporazione di Bru seguita da rilevazione immunochimica. Tuttavia, anticorpo efficace legame necessario denaturazione degli acidi nucleici per migliorare l'accesso al DNA o RNA che ha causato la perdita di morfologia cellulare e danneggiato gli epitopi di molte proteine, impedendo loro ulteriore rilevazione con anticorpi fluorescente 13. L'introduzione della tecnologia 'click chemistry' semplificato il processo di rilevamento e tegli procedura rispetto a autoradiografia e immunochimica. La tecnologia è basata su azide-alchino Huisgen reazione di cicloaddizione dove alchino terminale 5-ethyniluridine lega con azide coniugato con il fluoroforo in presenza di Cu (I). La reazione è specifica, rapida, non richiede ulteriori passaggi, ed è facilmente compatibile con la rilevazione immunochimica di altri costituenti cellulari.
Utilizzando questa tecnologia di imaging RNA abbiamo dimostrato che le cellule, nella stessa popolazione monostrato, hanno diversi livelli di sintesi di RNA in risposta all'ipossia. Abbiamo ristretto il nostro esperimento per esaminare l'effetto della sola produzione di RNA; tuttavia, è del tutto possibile con questo kit imaging RNA modificati, effettuare ulteriori reazioni multiplex che consentono una più complessa analisi della produzione di RNA. Ad esempio, la colorazione secondaria utilizzando un anticorpo specifico per marcatori di trascrizione attivi quali i livelli di fosforilazione RNA polimerasi II o anche componenti della traduzionezione macchinari per dare un'indicazione della quantità di questo RNA di nuova produzione che viene convertito in proteine sono possibili. Proteine addizionali, quali actina, una proteina che non dovrebbe cambiare significativamente con ipossia, possono essere testati come controllo aggiuntivo. Inoltre, diversi tipi cellulari possono essere testate, in quanto è molto probabile che le cellule differenti avranno differenti tassi di sintesi di RNA e anche risposte diverse a ipossia.
L'utilizzo di questo kit imaging RNA è molto semplice, purché i passaggi vengono eseguiti come descritto. Passaggi critici nel protocollo riguardano placcatura cellule, la fissazione delle cellule e la colorazione e l'acquisizione delle immagini. E 'importante per placcare le cellule ad una densità descritto per evitare sopra o sotto confluenza in sperimentazione che influenzerà notevolmente il risultato. E 'anche importante usare fissativo fresco, assicurando la migliore' fotografia 'della cellula è preso e curare quando si lava le cellule dopo colorazione per ridurre il background ad un livello accettabile per l'analisi efficiente. Infine, il metodo di acquisizione di immagini è di vitale importanza per ottenere immagini che sono di buona qualità sufficiente per la successiva analisi. Si consiglia di utilizzare il miglior microscopio ottico a disposizione per esaminare i campioni otticamente come il microscopio utilizzato in questo protocollo che è disponibile presso i centri più intensivo di ricerca a livello globale.
Disclosures
Il JRS è fondatore di Glencoe Software, Inc., una società commerciale statunitense open-source che contribuisce alla OMERO.
Acknowledgments
JB è un collega clinico CRUK, AS è uno studente di dottorato Wellcome Trust, il laboratorio di SR è finanziato da un CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Questo lavoro è stato supportato da due Wellcome Trust Awards strategici (097945/B/11/Z e 095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
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