Summary
Vi beskriver en teknikk for analyse av global RNA syntese i hypoksi ved hjelp av bildebehandling. Klikk-kjemi merking av RNA har ikke tidligere blitt utført under hypoksi og tillater visualisering av globale RNA endringer på celle-nivå. Denne tilnærmingen utfyller de eksisterende gjennomsnitt RNA teknikker, som tillater direkte visualisering av celle-til-celle endringer i global RNA-syntese.
Abstract
Hypoksi eller senking av oksygen tilgjengelighet er involvert i mange fysiologiske og patologiske prosesser. På molekylært nivå, celler i gang en bestemt transcriptional program for å montere en hensiktsmessig og koordinert cellulær respons. Cellen besitter flere oksygen sensor enzymer som krever molekylært oksygen som kofaktor for sin aktivitet. Disse spenner fra prolyl-hydroksylaser til histone demethylases. Flertallet av studiene analysere cellulære responser til hypoksi er basert på cellepopulasjoner og gjennomsnittlig studier, og som sådan enkelt celle analyse av hypoksiske celler blir sjelden utført. Her beskriver vi en fremgangsmåte for analyse av global RNA-syntesen på celle-nivået i hypoksi ved hjelp Click-iT RNA bildesett i en oksygen kontrollert arbeidsstasjon, etterfulgt av mikroskopi-analyse og kvantifisering. Ved hjelp av kreftceller som er utsatt for hypoksi for forskjellige lengder av tid, blir RNA-merket og målt i hver celle. Denne analysen kanvisualisering av tidsmessige og celle-til-celle endringer i global RNA syntese følgende hypoksisk stress.
Introduction
Hypoksi (lavt oksygen spenninger) oppstår når den normale oksygentilførsel til et vev blir forstyrret. Miljømessig oksygen er både et næringsstoff, og et signalmolekyl, som gir viktige signaler for mange celletyper. Endringer i miljø oksygen blir detektert av en gruppe dioxygenases som kontrollerer aktiviteten av en vesentlig transkripsjonsfaktor familie kjent som Hypoksi Induserbare Factors (HIFs). De HIFs er sammensatt av to subenheter, α-og β. Det er tre kjente isoformer av HIF-α (1, 2 og 3) og flere spleisevarianter av HIF-1β. HIF-1β er konstitutivt uttrykt og ikke regulert av miljømessige oksygennivå 1. De HIF-α familiemedlemmer er dynamisk regulert av en klasse av prolyl-hydroksylaser (doktorgrad) og Factor Hemme HIF (FIH); som begge krever oksygen som en ko-faktor for å katalysere hydroksylering av HIF-α 2,3. I normoksiske de HIF-α familiemedlemmer er hydroksyleres og merket for proteosomal degradering av E3-Ligase, von Hippel Lindau (VHL). I hypoksi doktorene og FIH er inaktive eller har en redusert aktivitet. HIF-α-isoformer blitt stabilisert, danner en heterodimer med HIF-1β, og bevirke transkripsjon av gener som gir den cellulære respons på hypoksisk miljø (figur 1A) 4..
Nåværende teknikker for RNA-analyse fokusere på kvantifisering av gjennomsnittsverdier over en gitt cellepopulasjon. Celler svare på en stimulus hypoksisk ved å initiere transkripsjon av en myriade av gener som tillater dem å tilpasse seg fiendtlig miljø 5. Men ofte finnes hypoksi som en gradient, og celler i et hypoksisk miljø er ikke underlagt en enhetlig hypoksisk stimulans. Vi beskriver en implementering av den klikk iT RNA bildebehandlingssett i en oksygen styrt arbeidsstasjon å undersøke global RNA syntese på celle-nivå i hypoksi.
RNA bildebehandlingssettet bruker en enlkyne-modifisert nukleosid, 5-etynyl-uridin (EU) og chemoselective ligering for å muliggjøre deteksjon av global RNA syntese i tid og rom i celler og vev 6. Kort fortalt blir celler behandlet med hypoksi og dyrket i nærvær av EU. De blir deretter fast og permeabilized og EU innlemmelse i begynnende RNA blir oppdaget av chemoselective ligation av EU med en azid inneholder fargestoff. En typisk arbeidsflyt for denne reaksjon er vist i figur 1B. Vi brukte RNA bildebehandlingssettet å undersøke RNA syntese på celle-nivå som resulterte fra behandling med hypoksi.
Den lille størrelsen av alkynet tag muliggjør effektiv inkorporering av det modifiserte nukleosid til RNA spesifikt. Den chemoselective ligation eller 'klikk' reaksjon er svært effektiv, rask og bestemt 7-10. Alle reaksjonskomponenter er bioinert og reaksjonen krever ingen ekstreme temperaturer eller oppløsningsmidler. Klikket reaksjon negererkravet til konvensjonelle radiomerking og tillater direkte visualisering av resultater, siden utgangen er lys. I tillegg, kan deteksjonsmolekyl lett trenge komplekse prøver slik at for multiplex-analyse, inkludert antistoffer for påvisning av RNA-interaktive proteiner. Dette RNA bildebehandling analysen er kompatibel med organiske fargestoffer inkludert Alexa Fluor og fluorescein (FITC).
Vi målte endringen i RNA-syntese etter behandling av cellene ved hjelp av en implementering av den åpne mikros miljø for fjerntliggende objekter (OMERO). OMERO er open-source programvare, tilgjengelig på http://openmicroscopy.org/ . Dette mikroskop bilde visualisering og analyse programvare gir tilgang til, og bruk av et bredt spekter av biologiske data, herunder forvaltning av flerdimensjonale, heterogene datasettene. Klientprogrammet tillater ekstern visualisering og analyse av komplekse biologiske bildedata 11;vi brukte den til å kvantifisere de visuelle endringer i global og enkelt celle RNA-syntese. Disse data og trinnene som kreves for å analysere vår RNA bildebehandling eksperiment ved hjelp av denne mikroskop bilde visualisering og analyse programvare er vist nedenfor.
Vi så på endringer i global RNA syntese etter behandlingen av menneskelige osteosarkom (U2OS) celler med hypoksi i opptil 24 timer. I alle forhold, har vi oppdaget at celle-til-celle variasjon i nivået av RNA-produksjon. Korte perioder med hypoksi eksponering førte ikke til vesentlige endringer i nivået av begynnende RNA i cellene. Imidlertid utsettes for 24 timers av hypoksi resulterte i en betydelig økning i mengden av RNA produsert i cellene. De fleste av de cellulære responser til hypoksi måles etter lengre perioder med eksponering, for eksempel 4-24 timer. Imidlertid er noen mekanismer settes på plass mye tidligere, for eksempel; NF-κB aktivering skjer innen 5-15 min av hypoksi eksponering 12. Gransker kortere hypoXia eksponeringstider er derfor berettiget og kan ta oppmerksomheten vekk fra mer kompliserte tiltak som for eksempel cellesyklus og apoptose.
Protocol
En. Cell Culture and Treatment
- Samle reagenser og utstyr oppført i tabell 1 til kultur menneskelig osteosarkom (U2OS) celler. Forbered alle reagenser og gjennomføre alle vevkulturteknikk i laminær luftstrøm hette for å sikre sterilitet
- Klargjør kulturmedium på følgende måte: til 50 ml FCS, 5 ml L-glutamin og 5 ml penicillin / streptomycin i DMEM til å oppnå sluttkonsentrasjoner på 10% (FCS), 2 mM (L-glutamin), 50 U / ml ( penicillin) og 50 U / ml (streptomycin). Varm dyrkningsmediet ved 37 ° C i et vannbad.
- Forbered cellene for behandling:
- Steril flere Dekk i 70% etanol, la det lufttørke og plassere en på bunnen av seks 3,5 cm plater.
- Fordyp Dekk i 2 ml varmet komplett DMEM (37 ° C), trykke ned med dekkglass tang for å sikre at de forblir levd opp til bunnen av brønnene.
- Løsne U2OS celler fra deres vev kulture plate ved å vaske en gang med 3 ml PBS, å anvende 4 ml varmet 0,05% trypsin-EDTA (1%) og inkubering ved 37 ° C i 7 min.
- Suspender cellene i 6ml varmet komplett DMEM å inaktivere trypsin-EDTA og telle ved hjelp av en hemocytometer.
- Plate 2 x 10 5 celler til hver av de 3,5 cm plater utarbeidet i punkt 1.3.1. Rist platen for å sikre en jevn cellefordeling. Tillat cellene få feste seg over natten før behandling.
- Behandle cellene ved å plassere fire 3,5 cm plater inn i hypoksi arbeidsstasjon og la de andre to 3,5 cm plater i inkubatoren ved 37 ° C i normale oksygenforhold. Vær klar til å starte RNA merking analysen henhold behandlede forhold (i hypoksi kammer for hypoksi behandlet celler) en time før hypoksi behandlingen avsluttes.
- Eksponere cellene til hypoksi i 1 time 15 min 1 t 30 min, i 2 timer, og 24 timer. Disse tidspunkter er fleksible og brukerbestemt.
- Bruk en Normoxic 3,5 cm plate som en positiv kontroll og en normoksisk 3,5 cm plate behandlet med Actinomycin D (10 pg / ml endelig konsentrasjon) i 4 timer som den negative kontroll. Actinomycin D er en inhibitor av global RNA-syntese.
Forsiktighetsregler:
Hoechst 33342 er en kjent mutagen.
DMSO er kjent for å muliggjøre innføringen av organiske molekyler i vev.
NaOH er etsende.
HCl er etsende.
Paraformaldehyd er meget giftige for alle dyr og kan føre til død hos mennesker.
Triton X-100 kan forårsake hudirritasjon etter direkte kontakt.
Actinomycin D er giftig ved hudkontakt eller svelging.
Ta nødvendige forholdsregler ved håndtering av alle farlige kjemikalier.
To. Klikk-iT analysen
- Samle opp de følgende reagenser som er nødvendige i tillegg til klikke-iT assay kit: fosfatbufret saltoppløsning (PBS) pH 7.2 - 7.6, 3,7% paraformaldehyd (PFA) i PBS, 1% Triton X-100 I PBS, deionisert vann (dH 2-O), dimetylsulfoksyd (DMSO), 10 M natriumhydroksid (NaOH), og 37% saltsyre (HCl); Valgfritt - pH-indikatorstrips.
- Forbered en frisk PFA stamløsning før du utfører Click-iT reaksjon som følger:
- Sett 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O og 10 pl of10 M NaOH i en 50 ml Falcon-røret. Kok 300-400 ml H2O i et stort begerglass i mikrobølgeovnen for å gjøre et vannbad, og denne står i et avtrekksskap.
- Plasser 50 ml Falcon inn i vannbad og forsiktig omrøre i 10 min, periodisk slipper lokket til PFA er oppløst.
- Sprøyte PFA løsningen gjennom et 0,2 mikrometer filter inn i en annen 50 ml Falcon rør, noe som resulterer i en 37% løsning.
- Fortynn denne 10x ved tilsetning av PBS, og bringer pH-verdien til 6,8 ved tilsetning av 12 mL konsentrert HCl. Alternativ: Sjekk at riktig pH med indikatorplatene i avtrekkshette.
- Brukes umiddelbart eller lagre overnight ved 4 ° C.
- Forbered aksje løsninger av RNA bildebehandlingssettet som følger:
- Legg 373 mL dH 2 O til komponent A som resulterer i en stamoppløsning på 100 mM i EU. Oppbevares ved -20 ° C i opptil en måned.
- Legg 85 mL av DMSO til komponent B (Alexa Fluor 594) og bland med pipettering eller virvling. Lagre både ved -20 ° C i inntil ett år.
- Tilsett 2 ml dH 2 O til komponent E for å lage en 10X oppløsning av RNA avbildningssettet reaksjonsbuffer additiv. Oppbevares ved -20 ° C i inntil ett år, kast når løsningen utvikler en brun farge.
- Merking av celler med EU: Fremstill en 2X arbeidsløsning av EU fra 100 mM stock fremstilt i trinn 2,3 i forvarmet komplett medium (37 ° C) utfører resten av dette trinn og trinn 2,5 i hypoksi kammer for celler behandlet med hypoksi. . Fortynn til 1X ved å tilsette et likt volum av 2X denne arbeidsløsning til medie fortsaining celler. Inkuber i 1 time etter behandling cellekulturbetingelser.
- Cell Fiksering: Vask hver brønn en gang med PBS og tilsett 1 ml av den 3,7% PFA lager fremstilt i trinn 2.2 ovenfor under behandlingsbetingelsene. Inkuber i 15 minutter i henhold til behandlingsbetingelsene. Prøvene ble behandlet med hypoksi kan fjernes fra den hypoksi kammeret på dette tidspunkt. Fjern fiksativ og vask hver brønn gang med PBS (Vær nøye med å avhende PFA avfall ansvarlig). Utfør de neste trinnene i romtemperatur.
- Permeabilization: Fjern vaskeoppløsning og tilsett 1 ml av 1% Triton X-100 i PBS til hver brønn. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Fjern permeabilization buffer og vask hver brønn gang med PBS.
- Merket RNA Detection:
- Forbered en frisk 1X arbeidsløsning av RNA bildebehandlingssett reaksjon buffer tilsetningsstoff ved å fortynne 10X løsning (utarbeidet i trinn 2.3) 01:10 i dH 2 O.
- Forbered RNA bildebehandlingssettetReaksjons cocktail i henhold til tabell 2 for bruk umiddelbart etter fremstilling.
- Fjern vaskeløsningen og legge 500 mL av RNA bildebehandlingssett reaksjon cocktail til hver prøve. Inkuber i 30 min ved værelsestemperatur, beskytte mot lys.
- Fjern RNA bildebehandlingssettet reaksjon cocktail og vaske en gang med en ml av RNA bildebehandlingssett reaksjon skylle buffer (komponent F), deretter fjerne RNA bildebehandlingssettet reaksjon skylle buffer.
- Valgfritt multipleks reaksjon: Utføre ytterligere antistoff merking av prøver på dette punktet i henhold til produsentens anbefalinger.
- DNA Farging: Vask prøver med PBS deretter fjerne vaskeløsningen. Fortynne Hoechst 33342 (Component G) 1:1.000 i PBS. Tilsett 1 ml av fortynnet Hoechst 33342 til hver brønn og inkuberes i 15 min ved værelsestemperatur, beskytte mot lys. Fjern Hoechst 33342-oppløsning og vaske cellene to ganger med PBS. Fjern vaske løsning;n og fortsett til lysmikroskopi.
Tre. Lett Mikros
- Mount Dekk:
- Plasser 10 pl av monteringsmedium på midten av en standard objektglass.
- Plasser dekkglass med cellesiden ned på midten av objektglass for å dekke aliquot av monteringsmedium. Pass på å unngå generering av bobler i montering medium da dette vil skjule etterfølgende bildet oppkjøpet.
- Hold deg dekkglass til objektglass ved å bruke klar neglelakk til sin omkrets. La det tørke i 5 min ved romtemperatur. Beskyttes mot lys. Prøver kan bli lagret ved -20 ° C etter montering.
- Bilde oppkjøpet: Innhente bilder med et bredt-feltet mikroskop stand fluorescensdeteksjon. Tilnærmet fluorescens / eksitasjon utslipp maxima for Alexa Fluor fargestoff og Hoechst 33342 bundet til DNA er vist i Tabell 3.
- Prestam Imaging bruker en 40X/1.30 NA oljeneddyppingsobjektivet linse og ta bilder med en avkjølt CCD-kamera.
4. Data Analysis
- Deconvolve bilder ved hjelp av bildebehandlingsprogram (se Materialer tabell) før import til OMERO klient. Normalrende innstillinger for alle bilder i samme eksperiment i mikroskop bilde visualisering og analyse-programvare ved å bruke gjengivelsesinnstillinger fra kontroll normoksisk cellene til alle andre forhold.
- Bruk Region Of Interest (ROI) verktøyet i mikroskop bilde visualisering og analyse programvare (se Materialer tabell) for å velge kjerner fra hvert bilde. Skaff gjennomsnitts intensiteter for hver ROI og beregne gjennomsnitt og standardavvik for hver tilstand ved å velge intensiteten analyse alternativet, inkludert et tall mellom 30-50 celler.
- Konstruer Scatter plott ved hjelp av en data grafer programvare (se Materialer tabell) ved å plotte alle individuelle gjennomsnittsintensitetsverdier innhentet i trinn 4,2 to reflektere variasjonen mellom celler under hver tilstand. Alternativt konstruere søylediagrammer til å representere gjennomsnittet gjennomsnittlig intensitet pluss standardavvik av begynnende RNA.
Representative Results
En skjematisk av RNA avbildningssettet reaksjon er vist i figur 1B. Vi brukte denne reaksjon til kvantitativt å bestemme total RNA syntese i U2OS-celler etter behandling med hypoksi både et individ (enkeltcelle) og globalt nivå (populasjon av celler). Cellene ble behandlet med hypoksi og dyrket i nærvær av EU. De ble deretter fast og permeabilized og EU innlemmelse ble oppdaget av chemoselective ligation av EU med en azid inneholder fargestoff. Denne "klikk" reaksjon resulterer i et fluorescens-emisjon som kan detekteres og kvantifiseres ved hjelp av fluorescens-lys mikroskopi. Figur 2A viser et typisk resultat av dette eksperimentet. Fluorescensmerkede celler er pseudocolored rød og bildet er åpnet i den åpne mikros miljø for eksterne objekter (OMERO). Dette mikroskop bilde visualisering og analyse programvare har en innebygd ROI verktøy som kan brukes til å velge individuelle sub-mobilnettet struksjoner og kvantitativt analysere bildeintensitet innenfor det valgte området. Et typisk eksempel på data-utgang som følge av bruken av dette verktøy i klientprogrammet kan sees i figur 2B; enkelte celle intensiteter blir vist sammen med en representant bilde fra forsøket som fungerer som en visuell kontroll for å sikre data validitet.
De individuelle celle fluorescensintensiteter kan plottes som et punktdiagram for å vise fordelingen av de individuelle celle intensiteter innenfor den behandlede cellepopulasjon. Et eksempel på denne type graf er sett i figur 2C. Plotting intensitet data på denne måten er nyttig fordi det gir en rask sammenligning av behandlingsresultater og tydelig demonstrerer betydelig heterogenitet innen en behandling cellepopulasjon som ellers skjules ved hjelp av standard data representasjon. Responsen heterogeniteten er interessant i dette forsøk fordi selv en ensartet hypoksisk stimulus var enpplied til cellene, er det klart at hver celle fra den samme monolayer populasjon reagerer forskjellig på denne stimulus.
Figur 2D viser det samlede resultatet fra vårt eksperiment. Fluorescensintensiteter fra alle celler i en behandlingspopulasjonen ble midlet og deretter plottet i denne stolpediagram. En student t-test ble benyttet for å beregne den statistiske sannsynligheten for at hver behandlingsgruppe avviker vesentlig fra kontrollen. Interessant, hvor dataene viser at det er en statistisk signifikant økning i den globale RNA-syntese over tid når U2OS celler blir behandlet med hypoksi (til tider som er større enn 1 t 30 min * p <0,01,. ** P <0,05 og *** p <0,001, og n> 30). Disse data viser at etter lengre perioder med hypoksi behandling fokuserer cellen innsatsen om produksjon av RNA med i det ugjestmilde hypoksisk miljø. Actinomycin D behandling helt ablates fluorescens intensitet som forventet.
Figur 1. A. HIF-systemet reagerer på endringer i cellulær oksygen. I denne forenklede skjematisk hypoksi stabiliserer HIF heterodimer ved å hindre HIF-α hydroksylering (-OH) ved prolyl hydroksylase enzymer (doktorgrad) og dens påfølgende polyubquitination av von-Hippel Lindau protein (VHL). HIF stabiliserings resulterer i aktivering av utallige gener som hjelper cellen reagerer på cellulær hypoksi B. RNA syntese kan oppdages ved hjelp av Klikk og IT-analysen.; celler er merket med EU etter behandling klikke reaksjon oppdager RNA syntese som kan kvantifiseres ved fluorescens intensitet og lysmikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større version av denne figuren.
Figur 2. A. Skjermbilde fra OMERO å vise typisk mikroskopisk utgang følgende RNA merking. Dette mikroskop bilde visualisering og analyse programvare kan raskt trekke intensitet data på en enkelt celle nivå ved hjelp av sin innebygde ROI makro. Et skjermbilde av produksjonen fra denne kommandoen er vist i B. Globalt RNA syntese kan utledes fra individuelle celle intensitet, kan omfanget av som sees i spredningsplott C. En formell representasjon av disse aggregerte data kan sees D. * p <0,01; ** P <0,05 og *** p <0,001 og n> 30. Klikk her for å se større bilde.
| Cell kultur reagenser |
| Fosfatbufret saltløsning (PBS) pH 7,2 til 7,6 |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) |
| Føtalt kalveserum (FCS) filtersterilisert |
| Penicillin / streptomycin |
| L-glutamin |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1%) |
| 70% etanol |
| Actinomycin D (1 pg / pl stam) |
| Cell Culture Utstyr |
| Steril Pasteur pipetter |
| En rekke cellekultur-behandlede og plast egnet for vedlikehold og behandling av celler i kultur |
| Vannbad innstilt på 37 ° C |
| Laminær luftstrøm hette |
| Inkubator innstilt på 37 ° C, 5% CO 2 |
| Hypoksi arbeidsstasjon satt ved 37 ° C, 5% CO2, 1% O to |
| Glass Dekk |
| presisjon tang |
| Hemocytometer |
Tabell 1. Reagenser og utstyr som kreves for dyrking av U2OS celler.
| Reaksjons Komponenter | Antall Dekk | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| Klikk-iT RNA reaksjon buffer (Komponent C) | 428 mL | 856 mL | 1,7 ml | 2,1 ml | 2,58 ml | 4,3 ml |
| CuSO 4 (Komponent D) | 20 mL | 40 mL | 80 mL | 100 mL | 120 mL | 200 mL |
| Alexa Fluor Azid (Utarbeidet i trinn 2.3) | 1,8 mL | 3,7 mL | 7,4 mL | 9,3 mL | 11,28 mL | 18,8 mL |
| Klikk-iT reaksjon buffer tilsetningsstoff (Utarbeidet i trinn 2.3) | 50 mL | 100 mL | 200 mL | 250 mL | 300 mL | 500 mL |
| Tilnærmet totalvolumet | 500 mL | 1 ml | 2 ml | 2,5 ml | 1,5 ml | 5 ml |
. Tabell 2 RNA bildebehandlingssett reaksjons cocktails: Referanse tabellen detaljering forholdet mellom master-mix komponenter for RNA bildebehandlingssett reaksjon i henhold til antall dekkglass for å bli farget.
| Fluoroforen | Eksitasjon (nm) | Emission (nm) |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 |
| Hoechst 33342, bundet til DNA | 350 | 461 |
. Tabell 3 Fluorescens / eksitasjon utslipp maxima: Tilnærmet fluorescens / eksitasjon utslipp maksimalt for Alexa Fluor fargestoff og Hoechst 33342 bundet til DNA.
Discussion
Vi har beskrevet bruken av et RNA avbildningssettet for å undersøke virkningen av hypoksi for RNA-syntese i osteosarkom (U2OS) celler. Denne teknikken er relativt enkel og gir data om global transkripsjon ved en enkelt celle nivå. Vi endret den konvensjonelle protokollen for dette settet for å innlemme merking i en hypoksi kammer. Så vidt vi vet er dette den første rapport om anvendelse av denne teknikken for å måle endringer i RNA-syntese i hypoksi. RNA bildebehandlingssettet vi brukte er egnet for eksperimentering i hypoksi siden det krever ingen radioaktive isotoper og er teknisk kompatibel med begrensningene av å jobbe i en kontrollert atmosfære arbeidsstasjon. Vanlige problemer med denne teknikken bekymring effektiv fiksering og merking av prøven. Det er ekstremt viktig at PFA brukes til å fikse prøven er frisk og vasketrinnet som følger den "klikk" reaksjon utføres som beskrevet for å sikre lav bakgrunnsfarging av prøven. Hvis background fluorescens blir et problem, anbefales det å vaske en gang til med en ml RNA bildebehandlingssett reaksjon skylle buffer etter trinn 2.7.4.
RNA bildebehandlingssettet nevnt her representerer et betydelig fremskritt i RNA bildeteknologi i form av brukervennlighet og spesifisitet og hastigheten på reaksjonen. Denne teknikk er i første rekke begrenset av tiden det tar å merke prøven. RNA bildebehandlingssett krever en hr merking periode som hindrer undersøkelse av raske endringer i global RNA som vanligvis ville oppstå innenfor denne tidsrammen. Det er av denne grunn vår første tidspunkt er begrenset til 1 time og 15 min. Teknikken er forbundet med noen andre begrensninger som i stor grad er knyttet til reagensrom kompatibilitet med andre fluorescerende markører, for eksempel, er ikke kompatibel med phalloidin flekker dette RNA bildebehandlingssettet.
Alle eksisterende metoder for å studere RNA-syntese i cellene er basert på inkorporering av modifiserte nukleosider inn i detbegynnende RNA og påvisning av innlemmet etiketter med ulike virkemidler. Den banebrytende tilnærming var basert på bruk av radioaktivt merket RNA forløpere fulgt av deteksjon med autoradiografi. Denne metoden førte til et funn av cellesyklusfaser og andre viktige funn; Men, den har en masse ulemper som tungvint natur radioaktivitet arbeid, lange eksponeringstider og lav oppløsning bilder av autoradiografi seks. Den neste fremskritt innenfor området utnyttes hjelp av immunkjemi for å eliminere nødvendigheten av radioaktivitet. RNA ble merket ved inkorporering av BRU, etterfulgt av immunologisk kjemisk påvisning. Imidlertid effektiv antistoffbinding kreves nukleinsyre denaturering for å forbedre tilgangen til DNA eller RNA som skyldes tap av celle-morfologi og skadet epitopene av mange proteiner, forhindrer deres videre deteksjon med fluorescensmerkede antistoffer 13. Innføringen av "klikk kjemi 'teknologi forenklet deteksjonstrinnet og tHan prosedyre i forhold til autoradiografi og immunkjemi. Teknologien er basert på azid-alkynet Huisgen cycloaddition reaksjon hvor terminal alkynet av 5-ethyniluridine bindes med azid konjugert med fluoroforen i nærvær av Cu (I). Reaksjonen er spesifikk, rask og ikke krever noen ytterligere trinn, og det er lett forenlig med immunokjemisk påvisning av andre cellebestanddeler.
Ved å bruke denne RNA avbildningsteknologi vi viste at cellene i den samme monolayer populasjon, har forskjellige RNA syntese nivåer i respons til hypoksi. Vi begrenset vår eksperiment for å undersøke effekten av RNA produksjon bare; Det er imidlertid helt mulig med denne RNA avbildningssett for å utføre modifiserte, videre multipleks reaksjoner som gir mulighet for en mer kompleks analyse av RNA-produksjon. For eksempel, sekundære flekker ved hjelp av et antistoff som er spesifikke for markører av aktiv transkripsjon som nivået av fosforylert RNA polymerase II, eller til og med komponenter av omregsjon maskineri for å gi en indikasjon på mengden av dette nylig produserte RNA som blir omdannet til protein er mulig. Andre proteiner, slik som Actin, et protein som ikke skal endres vesentlig med hypoksi, kan testes som en ytterligere kontroll. Videre kan ulike celletyper testes, så det er svært sannsynlig at ulike celler vil ha ulike RNA-syntese priser og med ulike reaksjoner på hypoksi.
Ved å bruke denne RNA avbildningssettet er ganske enkelt gitt trinnene blir utført som beskrevet. Kritiske trinn i protokollen innebærer celle plating, celle fiksering og farging og bilde oppkjøpet. Det er viktig å plate cellene ved den beskrevne tetthet for å forhindre over-eller underløpet ved eksperimentering som vil påvirke resultatet. Det er også viktig å bruke frisk fiksativ, som sikrer den beste "snapshot" av cellen er tatt og for å ta vare når du vasker cellene etter farging å redusere background til et nivå som er akseptabelt for effektiv analyse. Til slutt, er den fremgangsmåte for bildeopptak av vital betydning for å oppnå bilder som er av en god nok kvalitet for etterfølgende analyse. Vi anbefaler at du bruker den beste lysmikroskop tilgjengelig for å undersøke prøver optisk som mikroskopet brukes i denne protokoll som er tilgjengelig på de fleste forskningsintensive sentre globalt.
Disclosures
JRS er grunnlegger av Glencoe Software, Inc., en åpen kildekode-USA-baserte kommersielle selskap som bidrar til OMERO.
Acknowledgments
JB er en CRUK klinisk stipendiat, AS er et Wellcome Trust Stipendiat, SR lab er finansiert av en CRUK Seniorforsker Fellowship (C99667/A12918). Dette arbeidet ble støttet av to Wellcome Trust Strategiske Awards (097945/B/11/Z og 095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
