Summary
Vi beskriver en teknik för analys av globala RNA-syntes i hypoxi med hjälp av bildbehandling. Klicka-kemi märkning av RNA inte tidigare har utförts i enlighet med hypoxi och möjliggör visualisering av globala RNA förändringar på enskild cellnivå. Denna metod kompletterar de befintliga medelvärdes RNA-tekniker, vilket gör att direkt visualisering av cell-till-cell förändringar i den globala RNA-syntes.
Abstract
Hypoxi eller sänkning av syretillgänglighet är involverat i många fysiologiska och patologiska processer. På molekylär nivå, celler initiera en särskild transkriptionsprogram för att montera ett lämpligt och samordnat cellulärt svar. Cellen äger flera syresensor enzymer som kräver molekylärt syre som kofaktor för sin verksamhet. Dessa sträcker sig från prolylspecifikt hydroxylaser till histon demethylases. Majoriteten av studier som analyserar cellulära svar på hypoxi är baserade på cellpopulationer och genomsnittliga studier, och som sådana enkelcellanalys av hypoxiska celler sällan utförs. Här beskriver vi en metod för analys av globala RNA-syntes på enskild cellnivå i hypoxi med Click-iT-RNA avbildnings kit i en syre kontrollerad arbetsstation, följt av mikroskopi analys och kvantifiering. Med hjälp av cancerceller som utsätts för hypoxi för olika lång tid, är RNA märkt och mätt i varje cell. Denna analys gör det möjligt förvisualisering av tidsmässiga och cell-till-cell förändringar i den globala RNA-syntes efter hypoxisk stress.
Introduction
Hypoxi (låga syrespänningar) uppstår när det normala syretillförseln till en vävnad är störd. Miljö syre är både ett näringsämne och en signalmolekyl, som ger viktiga ledtrådar för många celltyper. Förändringar i miljö syre känns av av en grupp dioxygenases som styr aktiviteten av en viktig transkriptionsfaktor familj kallas Hypoxi Inducerbara Factors (HIFS). De HIFS är sammansatta av två subenheter, α och β. Det finns tre kända isoformer av HIF-α (1, 2, och 3) och flera splitsvarianter av HIF-1β. HIF-1β uttrycks konstitutivt och inte regleras av miljösyrenivåer 1. Familjemedlemmar HIF-α dynamiskt regleras av en klass av prolylspecifikt hydroxylaser (doktorer) och Faktor Hämmande HIF (FIH); båda kräver syre som en co-faktor för att katalysera hydroxylering av HIF-α 2,3. I normoxia de HIF-α familjemedlemmar hydroxylerade och taggade för proteosomal nedbrytning av E3-ligas, von Hippel Lindau (VHL). I hypoxi de doktorer och FIH är inaktiva eller har en minskad aktivitet. HIF-α isoformer stabiliserats, bildar en heterodimer med HIF-1β, och åstadkommande av transkription av gener som ger den cellulära responsen till hypoxisk miljö (Figur 1A) 4.
Aktuella tekniker för RNA-analys fokuserar på kvantifiering av medelvärden över en given cellpopulation. Celler svarar på en hypoxisk stimulans genom att initiera transkriptionen av en myriad av gener som tillåter dem att anpassa sig till sin fientlig miljö 5. Dock existerar hypoxi ofta som en gradient, och celler i en hypoxisk miljö inte är föremål för en enhetlig hypoxisk stimulans. Vi beskriver en implementering av Click-iT-RNA avbildnings kit i en syre kontrollerad arbetsstation för att granska den globala RNA-syntes på enskild cellnivå i hypoxi.
RNA fotoenheten använder en alkyne-modifierad nukleosid, 5-etynyl uridin (EU) och kemoselektiv ligering för att möjliggöra detektering av det globala RNA-syntes i tid och rum i celler och vävnader 6. I korthet behandlas cellerna med hypoxi och odlades i närvaro av EU. De är sedan fast och permeabiliserades och EU inkorporering i begynnande RNA detekteras genom kemoselektiv ligation av EU med en azid innehåller färgämne. Ett typiskt arbetsflöde för denna reaktion visas i figur 1B. Vi använde RNA fotoenheten för att undersöka RNA-syntes på enskild cellnivå som ett resultat av behandling med hypoxi.
Den lilla storleken av alkyn taggen möjliggör effektiv inkorporering av den modifierade nukleosiden till RNA specifikt. Den kemoselektiv ligation eller "klick" reaktion är mycket effektiv, snabb och specifik 7-10. Samtliga reaktionskomponenter är bioinerta och reaktionen kräver inga extrema temperaturer eller lösningsmedel. Klick reaktion negerarkravet för konventionell radiomärkning och tillåter direkt visualisering av resultaten eftersom utsignalen är ljus. Dessutom kan detektionsmolekylen lätt tränga komplexa prover möjliggör multiplex analys inklusive antikroppar för detektion av RNA-interaktiva proteiner. Denna RNA-imaging-analysen är kompatibel med organiska färgämnen inklusive Alexa Fluor och fluorescein (FITC).
Vi mätte förändringen i RNA-syntes efter behandling av våra celler med användning av en implementering av den öppna mikroskopi miljö för fjärrobjekt (Omero). Omero är öppen källkod, som finns på http://openmicroscopy.org/ . Detta mikroskop bild visualisering och analys ger tillgång till, och användning av ett brett spektrum av biologiska data, inklusive hantering av flerdimensionella, heterogena datamängder. Klientapplikationen möjliggör fjärr visualisering och analys av komplexa biologiska bilddata 11;Vi använde det för att kvantifiera de visuella förändringarna i den globala och enda cell RNA-syntes. Dessa data och de steg som krävs för att analysera vår RNA imaging experiment med hjälp av denna mikroskop bild visualisering och analys visas nedan.
Vi tittade på förändringar i den globala RNA-syntes efter behandling av mänsklig osteosarkom (U2OS) celler med hypoxi i upp till 24 timmar. Under alla förhållanden upptäckte vi cell till cell variation i nivån av RNA-produktion. Korta perioder av hypoxi exponeringen ledde inte till betydande förändringar av nivån av begynnande RNA i celler. Men exponering för 24 h av hypoxi gav en signifikant ökning av den mängd RNA som framställs i celler. De flesta av de cellulära svaren på hypoxi mäts efter långa perioder av exponering, t.ex. 4-24 timmar. Det finns dock vissa mekanismer införts mycket tidigare, till exempel; NF-KB-aktivering sker inom 5-15 min av hypoxi exponering 12. Undersöka kortare hypoXia exponeringstider är därför berättigad och kan förringa mer komplicerade reaktioner såsom cellcykeln och apoptos.
Protocol
1. Cellodling och behandling
- Samla de reagenser och utrustning som anges i tabell 1 till kultur mänsklig osteosarkom (U2OS) celler. Förbered alla reagenser och genomföra alla vävnadsodlingstekniker i laminärt luftflöde huva för att säkerställa sterilitet
- Bered odlingsmediet enligt följande: tillsätt 50 ml FCS, 5 ml L-glutamin och 5 ml penicillin / streptomycin till DMEM för att uppnå slutliga koncentrationer av 10% (FCS), 2 mM (L-glutamin), 50 U / ml ( penicillin) och 50 U / ml (streptomycin). Värm odlingsmediet vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Förbered celler för behandling:
- Sterilisera flera täckglas i 70% etanol, låt lufttorka och placera en på undersidan av sex 3,5 cm plattor.
- Doppa täckglasen i 2 ml värmde komplett DMEM (37 ° C), tryck ner med täck pincett för att se till att de förblir anslutit sig till botten av brunnarna.
- Lossa de U2OS cellerna från deras vävnader kulture plattan genom tvättning en gång med 3 ml PBS, applicera 4 ml värmdes 0,05% trypsin-EDTA (1%) och inkubering vid 37 ° C under 7 min.
- Återsuspendera cellerna i 6ml värmdes fullständigt DMEM för att inaktivera trypsin-EDTA och räknas med användning av en hemocytometer.
- Plate 2 x 10 5 celler till var och en av de 3,5 cm plattor framställda i punkt 1.3.1. Skaka plattan för att säkerställa en jämn cellfördelning. Låt cellerna att vidhäfta över natten före behandlingen.
- Behandla cellerna genom att placera fyra 3,5 cm plattor i hypoxi arbetsstation och lämna de andra två 3,5 cm plattor i inkubatorn vid 37 ° C under normala syreförhållanden. Var redo att påbörja analysen av RNA-märkning enligt behandlade förhållanden (i hypoxi kammaren för hypoxi behandlade celler) 1 timme före hypoxi behandlingen avslutas.
- Exponera celler för hypoxi under 1 h 15 min, 1 tim 30 min, 2 timmar och 24 timmar. Dessa tidpunkter är flexibelt och användar bestämdes.
- Använd en normoxic 3,5 cm platta som positiv kontroll och en normoxisk 3,5 cm platta som behandlats med aktinomycin D (10 | ig / ml slutlig koncentration) under 4 h som den negativa kontrollen. Aktinomycin D är en hämmare av global RNA-syntes.
Försiktighetsåtgärder:
Hoechst 33342 är en känd mutagen.
DMSO är känt för att underlätta för organiska molekyler i vävnaderna.
NaOH är frätande.
HCI är frätande.
Paraformaldehyd är mycket giftigt för alla djur och kan leda till döden för människor.
Triton X-100 kan orsaka hudirritation efter direktkontakt.
Aktinomycin D är giftigt vid hudkontakt eller förtäring.
Vidta lämpliga försiktighetsåtgärder vid hantering av alla farliga kemikalier.
2. Click-iT-analys
- Samla följande reagens som krävs utöver den Click-iT analyskit: fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2-7,6, 3,7% paraformaldehyd (PFA) i PBS, 1% Triton X--100 I PBS, avjoniserat vatten (dH 2 O), dimetylsulfoxid (DMSO), 10 M natriumhydroxid (NaOH) och 37% saltsyra (HCl); Tillval - pH-indikatorremsor.
- Bered en färsk PFA stamlösning innan du utför Click-iT reaktion enligt följande:
- Sätt 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O och 10 | il of10 M NaOH i ett 50 ml Falcon-rör. Koka 300 - 400 ml H2O i en stor bägare i mikrovågsugn för att göra ett vattenbad och stå här i ett dragskåp.
- Placera 50 ml Falcon i vattenbad och skaka försiktigt under 10 min, periodiskt släppa locket tills PFA har lösts upp.
- Sprutan PFA lösningen genom ett 0,2 pm filter in i en annan 50 ml Falcon-rör, vilket resulterar i en 37%-ig lösning.
- Späd denna 10x genom tillsats av PBS och bringa pH till 6,8 genom tillsats av ca 12 ^ il koncentrerad HCl. Tillval: Bekräfta rätt pH med indikatorremsor i dragskåp.
- Använd omedelbart eller förvara overnight vid 4 ° C.
- Bered stamlösningar av RNA fotoenheten på följande sätt:
- Lägg till 373 l dH 2 O till komponent A resulterar i en stamlösning av 100 mM i EU. Lagra vid -20 ° C i upp till en månad.
- Addera 85 pl av DMSO till komponent B (Alexa Fluor 594) och blanda genom pipettering eller virvling. Lagra både vid -20 ° C i upp till ett år.
- Tillsätt 2 ml dH 2 O till komponent E för att skapa en 10X lösning av RNA avbildningssatsen reaktionsbuffert tillsats. Förvara vid -20 ° C i upp till ett år, kassera då lösningen utvecklar en brun färg.
- Märkning av celler med EU: Förbered en 2X arbetslösning i EU från 100 mM lager beredd i steg 2.3 i förvärmd komplett medium (37 ° C) Utför resten av detta steg och steg 2,5 i hypoxi kammaren för celler som behandlats med hypoxi. . Späd till 1X genom tillsats av en lika stor volym av denna 2X arbetslösning till media fortsaining celler. Inkubera i 1 h under behandlingscellodlingsbetingelser.
- Cell Fixering: Tvätta varje brunn en gång med PBS och tillsätt 1 ml av 3,7% PFA lager framställts i steg 2.2 ovan under behandlingsförhållanden. Inkubera i 15 min under behandlingsbetingelserna. Proverna behandlade med hypoxi kan avlägsnas från den hypoxi kammaren vid denna punkt. Ta bort fixativ och tvätta varje brunn en gång med PBS (Var noga med att göra sig av PFA avfall på ett ansvarsfullt sätt). Utför nästa steg vid rumstemperatur.
- Permeabilization: Avlägsna tvättlösningen och tillsätt 1 ml 1% Triton X-100 i PBS i varje brunn. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna permeabilization buffert och tvätta varje brunn en gång med PBS.
- Märkt RNA Detektion:
- Bered en färsk 1X arbetslösning av RNA fotoenheten reaktionsbuffert tillsats genom att späda 10x-lösning (framställd i steg 2.3) 1:10 i dH 2 O.
- Förbered RNA fotoenhetenReaktions cocktail enligt tabell 2 för att användas omedelbart efter beredning.
- Avlägsna tvättlösningen och tillsätt 500 l av RNA fotoenheten reaktion cocktail till varje prov. Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur, skyddat från ljus.
- Ta RNA fotoenheten reaktion cocktail och tvätta en gång med 1 ml RNA-imaging kit reaktion sköljbuffert (komponent F), ta sedan bort RNA fotoenheten reaktion sköljbuffert.
- Valfri multiplex reaktion: Utför ytterligare märkning av prover antikropp vid denna punkt i enlighet med tillverkarens rekommendationer.
- DNA Färgning: Tvätta prover med PBS sedan bort tvättlösningen. Späd Hoechst 33342 (Component G) 1:1000 i PBS. Tillsätt 1 ml utspätt Hoechst 33342 i varje brunn och inkubera under 15 min vid rumstemperatur, skyddat från ljus. Avlägsna Hoechst 33342 lösningen och tvätta cellerna två gånger med PBS. Avlägsna tvätt Våra produktern och fortsätt till ljusmikroskop.
3. Ljus mikroskopi
- Mount Täck:
- Placera 10 | il av monteringsmedium på centrum av ett standardobjektglas.
- Placera täckglas med cellsidan nedåt på mitten av objektglas för att täcka alikvot av monteringsmedel. Var noga med att undvika bubblor i monteringsmedium eftersom detta kommer att skymma efterföljande bildtagning.
- Stick täckglas till objektglas genom att tillämpa tydliga nagellack till dess omkrets. Låt torka i 5 minuter vid rumstemperatur. Skydda mot ljus. Prover kan förvaras vid -20 ° C efter montering.
- Bild förvärv: Hämta bilder med hjälp av ett brett fält mikroskop kan fluorescensdetektering. Ungefärlig fluorescens / excitation emissionsmaxima för Alexa Fluor färgämnet och Hoechst 33342 bundna till DNA visas i tabell 3.
- Perform Imaging använder en 40X/1.30 NA oljeimmersionslins och ta bilder med en kyld CCD-kamera.
4. Dataanalys
- Deconvolve bilder med hjälp av bildbehandlingsprogram (se Material tabell) före import till Omero klienten. Normalisera renderingsinställningar för alla bilder i samma experiment i mikroskop bild visualisering och analys genom att tillämpa konverteringsinställningarna från kontroll normoxiska celler till alla andra förhållanden.
- Använd regionen av intresse (ROI) verktyg i mikroskop bild visualisering och analys (se Material tabell) för att välja kärnor från varje bild. Skaffa medelnivåer för varje ROI och beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för varje tillstånd genom att välja alternativet intensitetsanalys, inklusive ett antal mellan 30-50 celler.
- Konstruera Spridningsdiagram med hjälp av en data grafiska program (se Material tabell) genom att rita alla enskilda medelintensitetsvärden som erhållits i steg 4,2 to reflektera variationen mellan celler under varje villkor. Alternativt konstruera stapeldiagram för att representera genomsnittliga medelvärdet intensitet plus standardavvikelsen för begynnande RNA.
Representative Results
En schematisk bild av RNA fotoenheten reaktion visas i figur 1B. Vi använde denna reaktion för att kvantitativt bestämma den totala RNA-syntes i U2OS celler efter behandling med hypoxi på både ett individuellt (enda cell) och global nivå (population av celler). Cellerna behandlades med hypoxi och odlades i närvaro av EU. De var sedan fast och permeabiliserades och EU inkorporering påvisades genom kemoselektiv ligation av EU med en azid innehåller färgämne. Detta "klick" reaktion resulterar i en fluorescensemission som kan detekteras och kvantifieras med hjälp av fluorescens Ijusmikroskopi. Figur 2A visar ett typiskt resultat från detta experiment. Fluorescerande celler pseudocolored rött och bilden har öppnats i öppen mikroskopi miljö för avlägsna objekt (Omero). Detta mikroskop bild visualisering och analys har en inbyggd ROI verktyg som kan användas för att välja enskilda sub-cellulära strukturrer och kvantitativt analysera bildintensiteten inom det valda området. Ett typiskt exempel på den data som matas ut efter det att användningen av detta verktyg i klientprogrammet kan ses i figur 2B; enskilda cell intensiteter visas tillsammans med en representativ bild från experiment som fungerar som en visuell kontroll för att säkerställa uppgifternas giltighet.
De individuella cellfluorescensintensiteterna kan ritas som ett punktdiagram för att visa fördelningen av de enskilda cellulära intensiteter i den behandlade cellpopulationen. Ett exempel på denna typ av graf ses i figur 2C. Plotta intensitet uppgifter på detta sätt är användbart eftersom det ger en snabb jämförelse av behandlingsresultat och tydligt visar på betydande heterogenitet inom en behandlingscellpopulation som annars döljs med standard datarepresentation. Svaret heterogenitet är intressant i detta experiment eftersom även om en enhetlig hypoxisk stimulans var enpplied till cellerna, är det uppenbart att varje cell från samma monoskikt befolkningen reagerar olika på denna stimulus.
Figur 2D visar det samlade resultatet från vårt experiment. Fluorescensintensiteter från alla celler i en behandlingspopulationen beräknades och sedan plottas i detta stapeldiagram. En student t-test har använts för att beräkna den statistiska sannolikheten för varje behandlingsgrupp som skiljer sig signifikant från kontrollen. Intressant nog visar dessa data att det finns en statistiskt signifikant ökning av den globala RNA-syntes med tiden när U2OS cellerna behandlas med hypoxi (ibland större än 1 tim 30 min * p <0,01,. ** P <0,05 och *** p <0,001 och n> 30). Dessa data visar att efter längre perioder av syrebrist behandling, fokuserar cellen sina ansträngningar på produktion av RNA även i denna fientliga hypoxisk miljö. Aktinomycin D behandling helt ablates fluorescensintensiteten som förväntat.
Figur 1. A. HIF-systemet reagerar på förändringar i cellulära syre. I denna förenklade schematiska hypoxi stabiliserar HIF heterodimer genom att förhindra HIF-α hydroxylering (-OH) av prolylhydroxylas enzymer (doktorer) och dess efterföljande polyubquitination genom von-Hippel Lindau protein (VHL). HIF stabilisering leder till aktivering av otaliga gener som hjälper cellen svarar på cellulär hypoxi B. RNA-syntes kan detekteras med hjälp av Klicka-IT-analysen.; celler är märkta med EU efter behandling klickreaktionen upptäcker RNA-syntes, som kan kvantifieras genom fluorescensintensitet och ljusmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. A. Skärmdump från Omero att visa typiska mikroskopiska utgång efter RNA-märkning. Detta mikroskop bild visualisering och analys programvara kan snabbt extrahera intensitets uppgifter om en enskild cellnivå med hjälp av dess inbyggda ROI makro. En skärmdump av utdata från kommandot visas i B. Global RNA-syntes kan härledas från enskild cell intensitet, kan intervallet som ses i punktdiagram C. En formell representation av dessa aggregerade data kan ses D. * p <0,01; ** P <0,05 och *** p <0,001 och n> 30. Klicka här för att visa en större bild.
| Cellodlingsreagens |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2-7,6 |
| Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM) |
| Fetalt kalvserum (FCS) filtersteriliserades |
| Penicillin / streptomycin |
| L-glutamin |
| 0,05% trypsin-EDTA (1%) |
| 70% etanol |
| Aktinomycin D (1 ^ g / | il-lager) |
| Cell Culture Utrustning |
| Steril Pasteur-pipetter |
| Ett utbud av cellkultur-behandlade plastartiklar lämplig för underhåll och behandling av celler i kultur |
| Vattenbad vid 37 ° C |
| Laminärt luftflöde huven |
| Inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2 |
| Hypoxi Workstation inställd på 37 ° C, 5% CO2, 1% O 2 |
| Täckglas av glas |
| precisions pincett |
| Hemocytometer |
Tabell 1. Reagens och utrustning som krävs för odling av U2OS celler.
| Reaktionskomponenter | Antal Täckglas | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| Click-iT-RNA-reaktionsbuffert (Komponent C) | 428 | il | 856 | il | 1,7 ml | 2,1 ml | 2,58 ml | 4,3 ml |
| CUSO4 (komponent D) | 20 | il | 40 | il | 80 | il | 100 | il | 120 | il | 200 | il |
| Alexa Fluor-azid (framställd i steg 2,3) | 1,8 ^ il | 3,7 ^ il | 7,4 ^ il | 9,3 ^ il | 11,28 ^ il | 18,8 | il |
| Click-iT reaktionsbuffert tillsatser (Utarbetad i steg 2.3) | 50 | il | 100 | il | 200 | il | 250 | il | 300 | il | 500 | il |
| Ungefärlig Total volym | 500 | il | 1 ml | 2 ml | 2,5 ml | 1,5 ml | 5 ml |
. Tabell 2 RNA avbildningssats reaktions cocktails: Referens tabell över förhållandet mellan master-mix komponenter för RNA-avbildningssats reaktion enligt antalet täckglas som ska färgas.
| Fluorofor | Excite (nm) | Emission (nm) |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 |
| Hoechst 33342, bunden till DNA | 350 | 461 |
. Tabell 3 fluorescens / excitation emissionsmaxima: Ungefärlig fluorescens / excitation emissions maximal för Alexa Fluor färgämne och Hoechst 33342 binds till DNA.
Discussion
Vi har beskrivit vår användning av en RNA-avbildning kit för att undersöka effekterna av hypoxi på RNA-syntes i osteosarkom (U2OS) celler. Denna teknik är relativt enkelt och ger information om globala transkription vid en enda cell nivå. Vi ändrade det konventionella protokollet för detta kit för att införliva märkning i en hypoxi kammare. Såvitt vi vet är detta den första rapporten av användningen av denna teknik för att mäta förändringar i RNA-syntes i hypoxi. RNA fotoenheten som vi använt är lämplig för experiment i hypoxi eftersom det kräver inga radioaktiva isotoper och är tekniskt kompatibla med de begränsningar som arbetar i en kontrollerad atmosfär arbetsstation. Vanliga problem med denna teknik oro effektiv fixering och märkning av provet. Det är oerhört viktigt att PFA används för att fixera provet är fräsch och tvättstegen som följer klick reaktion utförs enligt beskrivning för att säkerställa låg bakgrundsfärgning av provet. Om bakgrund fluorescens blir ett problem rekommenderas det att tvätta en gång med 1 ml RNA fotoenheten reaktion sköljbuffert efter steg 2.7.4.
RNA fotoenheten som uppges är ett viktigt framsteg i RNA-bildteknik när det gäller användarvänlighet och specificitet och förmåga att reagera. Denna teknik är primärt begränsad av den tid det tar att märka provet. RNA fotoenheten kräver en märkning perioden 1 timme som hindrar en undersökning av snabba förändringar i den globala RNA som normalt skulle uppstå inom den tidsramen. Det är av denna anledning vår första tidpunkten är begränsad till 1 timme och 15 min. Tekniken är förknippad med några andra begränsningar som till stor del avser reagens kompatibilitet med andra fluorescerande markörer, till exempel, är inte kompatibel med phalloidin färgning detta RNA fotoenheten.
Alla befintliga metoder för att studera RNA-syntes i celler bygger på inkorporering av modifierade nukleosider ibegynnande RNA och detektion av inbyggda etiketter på olika sätt. Den banbrytande strategi byggde på att använda radioaktivt märkta RNA prekursorer följt av detektion med autoradiografi. Denna metod ledde till en upptäckt av cellcykelsteg och andra viktiga fynd; Men, den har en hel del nackdelar såsom tungrodda radioaktivitet arbete, långa exponeringstider och lågupplösta bilder av autoradiografi 6. Nästa framsteg inom området utnyttjas hjälp av immunkemi för att eliminera behovet av radioaktivitet. RNA märktes genom inkorporering av BRU följt av immundetektion. Men bindning effektiv antikropp krävs nukleinsyra denaturering för att förbättra tillgången till DNA eller RNA som orsakade förlust av cellens morfologi och skadade de epitoper av många proteiner, förhindrar deras vidare detektion med fluorescerande antikroppar 13. Införandet av "klickkemi" teknik förenklat detekteringssteget och tHan förfarande jämfört med autoradiografi-och immunkemi. Tekniken bygger på azid-alkynen Huisgen cykloadditionsreaktion där terminal alkyn av 5-ethyniluridine binder med azid konjugerat med fluoroforen i närvaro av Cu (I). Reaktionen är specifik, snabb, inte kräver några ytterligare steg, och är lätt kompatibel med immunkemisk detektion av andra cellbeståndsdelar.
Med användning av detta RNA-bildteknik vi visade att celler, på samma monoskikt befolkningen har olika RNA-syntesnivåer som svar på hypoxi. Vi begränsade våra experiment för att undersöka effekten av RNA-produktionen endast; Det är emellertid helt möjligt med denna RNA-fotoenheten att utföra modifierade, ytterligare multiplexa reaktioner som möjliggör en mer komplex analys av RNA-produktion. Exempelvis sekundär färgning med användning av en antikropp specifik för markörer av aktiv transkription såsom nivåer av fosforylerad RNA-polymeras II eller till och med komponenterna i översätttion maskiner för att ge en indikation på hur mycket av denna nyproducerade RNA som omvandlas till protein är möjliga. Andra proteiner, såsom aktin, ett protein som inte bör ändras påtagligt med hypoxi, kan testas som en ytterligare kontroll. Vidare kan olika celltyper skall testas, eftersom det är mycket troligt att olika celler kommer att ha olika RNA-synteshastigheter och till och med olika svar på hypoxi.
Användning av denna RNA-imaging kit är ganska enkelt förutsatt att stegen utförs enligt beskrivning. Kritiska steg i protokollet innebär cell plätering, cell fixering och färgning och bildtagning. Det är viktigt att plattan cellerna vid den beskrivna täthet för att förhindra över eller under sammanflödet vid experiment som avsevärt kommer att påverka resultatet. Det är också viktigt att använda färska fixativ säkerställer bästa "ögonblicksbild" av cellen tas och att ta hand om tvätt av cellerna efter färgning för att minska background till en nivå som är acceptabel för en effektiv analys. Slutligen är metoden för bildinhämtning oerhört viktigt att uppnå bilder som är av en tillräckligt god kvalitet för efterföljande analys. Vi rekommenderar att du använder den bästa ljusmikroskop tillgängliga undersöka prov optiskt såsom mikroskop som används i detta protokoll som finns på de flesta forskningsintensiva centra globalt.
Disclosures
JRS är grundare av Glencoe Software, Inc., en öppen källkod USA-baserade kommersiella företag som bidrar till Omero.
Acknowledgments
JB är en CRUK klinisk karl, AS är en Wellcome Trust doktorand, SR labbet finansieras av en CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Detta arbete stöddes av två Wellcome Trust Strategiska Awards (097945/B/11/Z och 095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
