Abstract
Mus anvendes ofte som hjertetransplanterede donorer og modtagere i studier af transplantation immunologi på grund af den brede vifte af transgene mus og reagenser til rådighed. En vanskelighed præsenteres på grund af den lille størrelse af dyret og de betydelige tekniske udfordringer, der er involveret i hjerte transplantation mikrokirurgi. Især kan en høj grad af teknisk svigt tidligt efter transplantation skyldes modtager død og postoperative komplikationer såsom bagbensparalyse eller en ikke-bankende hjerte. Her bliver den komplette teknik til heterotop mus hjerte transplantation demonstreret involverer høst donor hjerte og efterfølgende implantation i en recipient mus. Donor hjerte høstes umiddelbart efter in situ perfusion med koldt hepariniseret saltvand og transection af opstigende aorta og lungepulsåren. Modtageren operation indebærer fremstilling af den abdominale aorta og inferior vena cava (IVC), efterfulgt afende-til-side anastomose af donor aorta med modtageren aorta ved hjælp af en enkelt kørende 10-0 microsuture og en lignende anastomose af donor lungepulsåren med modtageren IVC. Efter transaktionen dyret injiceret med 0,6 ml normalt saltvand subkutant og fik lov til at komme på en 37 ° C varmepude. Resultaterne fra 227 mus hjerte transplantationer er sammenfattet med en succesrate på 48 timer på 86,8%. Af de 13,2% udfald inden for 48 timer, 5 (2,2%) oplevede bagbensparalyse, 10 (4,4%) havde en ikke-bankende hjerte på grund af pode iskæmisk skade og / eller trombose, mens 15 (6,6%) døde inden 48 timer .
Introduction
Dyremodeller for organtransplantation kan give værdifulde oplysninger til at forbedre behandling af kliniske transplanterede patienter. Musemodeller er især nyttige til at studere immun mekanisme organtransplantatafvisning eller accept på grund af den brede vifte af genetisk modificerede mus og reagenser specifikke for mus, der ikke er tilgængelige for andre dyremodeller 1-3. En udfordring med musemodeller af transplantation er den lille størrelse af donorer og modtagere, som kræver en betydelig teknisk dygtighed til at opnå tilfredsstillende resultater.
En teknik blev først beskrevet for heterotopisk transplantation af hjerter hos rotter 4, som efterfølgende blev tilpasset til mus hjerte transplantation af Corry et al 5.. Denne teknik involverede fremstilling modtageren før donoren og uden brug af perfusion af donor hjertet, som begge er tilbøjelige til at bringe overlevelsen af transplanterede hjerte eller than modtager. Proceduren har været meget anvendt som oprindeligt beskrevet for at undersøge de mekanismer, afstødning og tolerance 6-8. Andre har tilpasset den oprindelige rotte hjerte transplantation procedure Ono og Lindsey for hjerte transplantationer i mus 9,10. For nylig blev en teknik offentliggjort for muse hjerte transplantation, der overvandt nogle af de problemer, der er forbundet med fremgangsmåden ifølge Corry et al 11. Protokollen beskrevet her omfatter vores modifikationer, baseret på fremgangsmåden ifølge Mottram m.fl. 12, som omfatter: in situ perfusion med koldt hepariniseret saltvand umiddelbart efter torakotomi og udførelse donor drift før modtageren med henblik på at minimere modtagerens driftstid. Derudover bruger vi små atraumatisk fartøj klemmer i stedet for 6-0 silkeslips. Selv fartøj klemmer har den ulempe, at tage mere plads, de er lettere at styre end bånd, som ikke bør være for stram eller løsog er mindre ligetil at fjerne end klemmer. Vores metode anvender en enkelt kørende sutur for fartøjet anastomose, selv om det i første indlæring stadier et alternativ er at bruge ophold suturer ved den proximale og distale hjørner at sikre jævnhed suturer og dermed åbenhed af anastomosen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forud for påbegyndelsen af eksperimenter, indhente godkendelse fra den pågældende institution Animal Care Ethics Committee for de planlagte eksperimenter. Vedligehold mus i overensstemmelse med kravene i din institution. Følgende protokol er blevet godkendt af Sydney University og Royal Prince Alfred Hospital udvalg.
Forud for påbegyndelse af operation, bør alle instrumenter rengøres grundigt og steriliseres ved iblødsætning i 80% ethanol. Nogle institutioner fastsætte autoklavering men dette kan beskadige fine mikrokirurgiske instrumenter på lang sigt. Hvor det er muligt brug sterilt engangsudstyr.
1.. Anæstesi
- Bedøver mus med isofluran i en forseglet beholder derefter placere den liggende på et operationsbord bord, hurtigt tilslutning bedøvelsesmiddel næse kegle. Test tilstrækkeligheden af anæstesi ved at knibe bagben for at sikre, at der ikke er nogen refleks.
- Barbere huden med en kirurgisk kniv ogsterilisere med 80% ethanol. Desuden kan 2% chlorhexidin i 70% isopropylalkohol anvendes til hud sterilisering. Under induktion af anæstesi det isofluran-koncentration er 3%, men reduceres til 1-1,5% for vedligeholdelse. Foretage mindre justeringer af denne koncentration at opretholde regelmæssig vejrtrækning og puls. Bibehold temperaturen af dyret på en varmepude.
2.. Donor Operation
- Foretag en torakotomi for at blotlægge hjertet og fartøjer ved skæring af brystet gennem begge sider af brystkassen fra rib op til armhulen efterfulgt af et tværgående snit i niveau xiphisternum at danne en brystvæggen klap. Løft denne klap op ved siden af hovedet og pin det til operativsystemet bord. Riv hjertesækken at blotlægge hjertet og fartøjer.
- Løft inferior vena cava med en pincet i den ene hånd og med den anden injiceres 1 ml kold hepariniseret saltvand proksimalt for hjerte gennem IVC, og derefter sætte en lille arterie klemme på IVC til forebyggelset flow perfusion opløsningen tilbage gennem nålen hul.
- Ved hjælp af gaze og en vatpind, trække hjertet nedad for at eksponere opstigende aorta og lungepulsåren. Pass et blad af et par microscissors gennem kanalen (tværgående sinus) posteriort for bundtet af aorta og lungepulsåren og skære aorta og lungepulsåren sammen så langt distalt som muligt for at sikre en tilstrækkelig længde til anastomose.
- Tie og opdele IVC, højre vena cava superior (SVC), venstre SVC og lungevenerne bruge 6-0 silketråd. Bind IVC og højre SVC separat derefter placere en enkelt tråd posterior til hjertet at omringe den venstre SVC sammen med lungevenerne og binde det. Harvest hjerte fra donor site ved at skære de fartøjer, distalt for bånd og opbevare det i koldt sterilt saltvand ved 4 ° C indtil transplantation. Dette resulterer i død donor ved afblødning.
3.. Modtager Operation
- Bedøvemodtageren som ovenfor (afsnit 1). Barbere forsigtigt maven for at undgå irritation, og derefter foretage en laparotomi ved midtliniesnit fra pubis til xiphisternum og trække bruge papirclips bøjet til at danne retraktorer. Pak tarmen i varmt sterilt saltvand gennemblødt gaze og oprulles den øverste højre side af maven.
- At udsætte den infra-renal aorta og IVC, befri de bundlede segmenter af aorta og IVC fra venstre nyre-arterie og vene til bækkenforgreningen ved at dividere dem fra lænde fartøjer, der anvender en cautery enhed. Sørg for, at kautering er ved den korrekte temperatur og anvendes i tilstrækkelig lang tid til at dele og forsegle fartøjets ender.
- Anvend små atraumatisk fartøj klemmer til aorta og IVC segmenter distalt og proksimalt. Lave et snit i den forreste væg af aorta ved først at punktere et hul med en 30 G nål; derefter skæres et snit lodret med microscissors der svarer til størrelsen af donorens aorta. Skyl aorta lumen med hepariniseret saltvand for at fjerne enhver blOOD blodpropper.
- Bring donor hjerte til modtagerens sted dækket med gaze vædet i koldt saltvand og placere den på højre side af underlivet. Sørg for, at donor aorta er placeret ved siden af snit på modtagerens aorta og donoren lungepulsåren placeret ud til modtageren IVC.
- Anastomoserer donor aorta ende-til-side til modtageren aorta under rindende 10-0 nylonsuturer startende fra den proksimale hjørne og sutur langs den venstre side først, indtil det når den distale hjørne, på hvilket stadium dyret drejes 180 °. Forsigtigt flytte donor hjertet til venstre side af maven for at blotlægge den højre side af aorta og fortsætte sutur gennem højre side af den aortiske væg fra den distale ende til den proximale ende. Før du lukker aorta anastomose skylles forsigtigt lumen med hepariniseret saltvand for at fjerne eventuel blodprop og luft.
- Anastomoserer donor lungepulsåren (PA) ende-til-side med modtageren IVC. Lav et snit Vermatisk med microscissors i forstykket af IVC på et sted i overensstemmelse med den arterie anastomose. Anastomoserer donor PA til modtager IVC med rindende 10-0 nylonsuturer startende fra den distale ende af den venstre væg i lumen IVC. Efter at have nået den proksimale ende, fortsætter suturer langs fronten højre sidevæg op til den distale ende for at fuldføre anastomose. Før du lukker anastomose skylles forsigtigt lumen for at fjerne eventuelle blodpropper og luft.
- Før frigives fartøjet klemmer, sted stykker Gelfoam omkring anastomosen sites, og tryk forsigtigt med en vatpind applikator indtil hæmostase er opnået. På tidspunktet for revaskularisering, slipper distale klemme først, efterfulgt af den proximale klemme.
- Efter revaskularisering, påfør varmt saltvand ved 37 ° C til transplantatet udvendigt for at hjælpe dets nyttiggørelse. Transplantatet starter normalt flimren straks og vender tilbage spontant til sinusrytme inden for et par minutter. Injicer 0,6 ml varmsaltvand subkutant til at opretholde væskebalancen på modtageren. Sprøjt buprenorphin subkutant analgesi inden afslutningen af kirurgi
- Luk abdominale sår med en 5-0 absorberbar sutur kører for begge lag. Begynd med at udfylde det indre lag, og fortsætter langs huden.
4.. Inddrivelse og Graft Overvågning
- Sprøjt ampicillin til forebyggelse af infektioner og placere modtageren på en varmepude ved 37 ° C til nyttiggørelse. De fleste dyr kommer hurtigt, og er normalt drikker og ofte spise inden for 3 timer. Hvis musen viser tegn på lidelse, undersøge nøje for at fastslå årsagen. Hvis der ingen indlysende årsag, behandle med buprenorphin og overvåge nøje. Konsultere en dyrlæge, hvis symptomerne er alvorlige eller vedvarende mere end 8 timer og overveje dødshjælp. Hvis det er nødvendigt, giver fortsat 12 time injektioner af buprenorphin indtil symptomerne er forsvundet. Hvis musen viser tegn på lidelse efter 8 timer, giver fortsat 12timeløn injektioner af buprenorphin, indtil de løse. Rådfør dyrlæge, hvis symptomerne fortsætter i mere end 48 timer og aflive evt.
- Monitor transplantat hjerteslag ved direkte abdominal palpering og registrere styrken af slag som + + + + for en sund protesen + for svage slag på grund af avanceret afvisning og - ikke slå på grund af fuldstændig afvisning af transplantatet. Monitor mus dagligt i de første 10 dage, derefter 3x per uge for eksperimentets varighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter en indledende uddannelse periode blev 227 tilfælde af mus heterotopisk hjerte transplantation i vores gruppe analyseret. Succesraten inden for de første 24 timer var 90,3% og på 48 timer var det 86,8%. Af de 30 (13,2%) fejl inden for 48 timer, 5 (2,2%) oplevede bagbensparalyse og måtte aflives, 10 (4,4%) havde en ikke-bankende hjerte på grund af graft iskæmi skader og / eller trombose, mens 15 (6,6%) døde inden 48 timer. Nogle eksperimentelle graft overlevelse er vist i tabel 1 med en række strain kombinationer. Hjerte transplantationer mellem samme donor og modtager stamme blev accepteret langsigtet mens transplantationer mellem ikke-identiske stammer blev afvist.
Udseendet af transplanterede hjerter er vist i fig. 1. Årsagen til hjerte transplantation svigt generelt bestemmes af den tid efter transplantation, når hjertet ophørte med at slå i kombination med fremkomsten af hjertet. Hvis det er nødvendigt, årsagenfor ophør af slag bør bekræftes ved histologisk analyse af hjertet. For eksempel ophørte hjerte i en C57BL / 6 stamme modtageren af en DBA / 2 donor hjerte transplantation slå på dag 2, som er mest usædvanlige som afvisning i unsensitized modtagere tager normalt mindst en uge. Figur 1A viser hjertet fra dette modtager med tegn på trombose og infarkt af hjertet væv. I stammen kombinationen af C57BL / 6 donor til C57BL / 6 modtager, blev hjerte ikke afvist, og overlevede i> 100 dage (figur 1b). I dette tilfælde hjerte var lidt mindre i størrelse som følge af muskelatrofi sekundært til sin ikke livsopretholdende status. I modsætning hertil i afvise stamme kombinationen af DBA / 2 donor til C57BL / 6 modtager, havde det transplanterede hjerte ophørte med at slå på dag 7 og viste tegn på afstødning (figur 1C). Det var helt fibrotisk og indskrumpet ved dag 100 (figur 1D).
Figur 1.. Udseende af thrombosed, afvise og ikke-afstøde transplanterede hjerter. (A) DBA / 2 hjerte transplanteret til C57BL / 6 modtager viser thrombosed og infarcted hjerte 7 dage efter transplantation. (B) C57BL / 6 hjerte transplanteret til C57BL / 6 modtager viser en godt perfunderet og bankende hjerte 100 dage efter transplantationen. (C ) DBA / 2 hjerte transplanteret til C57BL / 6 modtager viser afvist hjerte 7 dage efter transplantationen. (D) DBA / 2 hjerte transplanteret til C57BL / 6 modtager viser afvist hjerte 100 dage efter transplantation. Pile angiver det transplanterede hjerte.
| Kombinationer | Overlevelse (dage) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4. | 8.5 |
| 178,3 → B10.BR | 7 x2, 8 x2, 9, 10, 12, 13 | 8. | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, 9 x2, 10 x5, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Tabel 1. Heart transplantatoverlevelse i forskellige donor / recipient kombinationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mouse hjerte transplantation er en udfordrende microsurgical metode, der kræver en betydelig kirurgisk færdighed at mestre. Den mest udfordrende aspekt er den lille diameter af skibene. Desuden er det nødvendigt at begrænse modtageren driftstid og blødning. Teknikken til mus hjerte transplantation blev først beskrevet af Corry et al. i 1973 og efterfølgende i Mottram et al 12. Vores modifikationer indeholde følgende punkter. For det første øjeblikkelig perfusion af donor hjerte med koldt hepariniseret saltvand efter torakotomi og transection af aorta og lungepulsåren bundt hurtigt efter perfusion forhindrer varm iskæmi under høsten. For det andet, starter forberedelsen modtageren hurtigt efter afslutningen af donor høst, i stedet for at forberede modtageren før donoren, reducerer abdominal eksponeringstid i modtageren med deraf følgende forbedring i overlevelse. Endelig brug af små atraumatisk fartøj klemmer til blåse blodgennemstrømning, i stedet for bånd for modtageren aorta / IVC bundle, normalt resulterer i færre skader på skibene, og kan reducere forekomsten af bagbensparalyse.
Desuden er de følgende punkter er vigtige for succes. Den optimale størrelse af donorer og modtagere er omkring 23 til 26 g og optimal alder er 10 til 12 uger. Ældre dyr ikke har større fartøjer og deres øgede fedt gør eksponering af aorta og IVC vanskeligere. Dehydrering og hypotermi af modtageren under kirurgi skal undgås. Modtager tarm skal være godt beskyttet mod dehydrering ved hjælp af varmt saltvand gennemblødt gaze og modtageren kan opretholdes på en varmemåtte ved 37 ° C. Den gaze skal holdes fugtig ved regelmæssig anvendelse af frisk, varm saltvand under operationen. For at minimere blodpropper og luft emboli, der kan føre til bagbensparalyse, fartøjets anastomose sites nødt til at være godt skylles før lukning. Tarm bør nøje udskiftes completipå transplantation for at forhindre enhver snoning af mesenteriet. Subkutan injektion af 0,6 ml varm saltvand hjælper dyr opsving mens en større mængde af intravenøs væske hurtigt efter operationen kan medføre forhøjet blodtryk og afblødning af anastomoser. Begrænse den tid, at modtageren aorta og IVC er cross fastspændt til mindre end 30 min vil forbedre succesraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Health and Medical Research Council National (NHMRC) i Australien Project Grant 1.029.205, ved Microsearch Foundation i Australien, og ved Myee Codrington Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
- Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
- Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
- Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
- Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
- Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
- Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
- Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).
