Abstract
マウスはしばしば、利用可能なトランスジェニックマウスおよび試薬広範囲の移植免疫学の研究において、心臓移植のドナーとレシピエントとして使用されている。難しさに起因動物のサイズが小さく、心臓移植に関与する顕微かなりの技術的な課題に提示される。特に、初期の移植後の技術的な故障率の高さは、受信者の死や、後肢麻痺または非心臓の鼓動のような術後の合併症に起因する可能性がある。ここでは、異マウス心臓移植のための完全な技術は、レシピエントマウスにドナー心臓とその後の注入を収穫含む、実証されている。ドナー心臓は、上行大動脈と肺動脈の寒さのヘパリン化生理食塩水や離断とその場での灌流直後に収穫される。受信者動作は、続いて腹部大動脈および下大静脈（IVC）の調製を含むシングルランニング10-0 microsuture者と受信者のIVCとドナーの肺動脈の類似の吻合を使用して、受信者の大動脈とドナーの大動脈の端側吻合。操作以下の動物0.6mlの生理食塩水を皮下注射し、37℃の加熱パッド上で回復させる。 227マウス心臓移植の結果は86.8％の48時間での成功率で要約されている。 15（6.6％）が48時間以内に死亡した48時間以内で13.2％の失敗、5（2.2％）、虚血性傷害および/または血栓症を移植片に起因する非鼓動心を持っていた後肢麻痺、10（4.4％）を経験した。
Introduction
臓器移植の動物モデルは、臨床移植患者の治療を改善するための貴重な情報を提供することができる。マウスモデルは、遺伝子改変マウスや他の動物モデル1-3には使用できませんマウスに特異的な試薬の広い範囲に臓器移植拒絶または受諾の免疫機構を研究するために特に有用である。移植のマウスモデルでの課題は、満足のいく成果を達成するために、かなりの技術的なスキルを必要とし、ドナーとレシピエントのサイズが小さいです。
技術が最初に、その後、コリーら 5によるマウス心臓移植のために適合したラット4で心の異所移植のために記述されていた。この手法は、移植された心臓またはtの生存を危うくする可能性があり、どちらも、前にドナー操作に受信者とドナー心臓の無灌流の準備に関与彼は、受信者。本来移植拒絶反応および耐性6-8のメカニズムを調べるために記載した方法が広く用いられている。その他は、マウス9,10における心臓移植のために小野とリンジーの元のラットの心臓移植の手順を適応している。さらに最近では、技術はコリーら 11の方法に関連する問題のいくつかを克服したマウスの心臓移植のために出版された。直ちに開胸後のインサイチュ灌流冷ヘパリン化生理食塩水および受信者の動作時間を最小限に抑えるために従来の受信者動作にドナー動作を行う。プロトコルは、ここで説明挙げモットラムら 12に記載の方法に基づいて、我々の修飾を組み込んでいる。加えて、我々は代わりに6-0絹のネクタイの小さな非外傷性血管クランプを使用しています。血管クランプはより多くのスペースを取ることの欠点を持っていますが、彼らはあまりにもタイトな緩みすべきではないネクタイ、より制御が容易であるそしてクランプよりも除去が少なく簡単です。初期学習代替ステージが、我々の方法は、血管吻合のための単一の実行中の縫合糸を使用して縫合糸の均一性を確保するために、近位および遠位の角に滞在縫合糸を使用し、その吻合部分の開通することです。
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Protocol
実験の開始前に、計画された実験のための関連機関の動物管理倫理委員会の承認を得る。あなたの機関の要件に従って、マウスを維持する。以下のプロトコルは、シドニー大学とロイヤルプリンスアルフレッド病院の委員会によって承認されている。
手術を開始する前に、すべての器具は徹底的に洗浄し、80％エタノールに浸すことにより滅菌されるべきである。いくつかの機関は、しかし、これは長期的に細かい顕微楽器を損傷する可能性があり、オートクレーブ処理を規定している。可能な場合に使用できる滅菌の使い捨て器具。
1。麻酔
- 密閉容器内のイソフルランでマウスを麻酔し、素早く麻酔ノーズコーンを接続、操作盤の上に仰臥位に配置します。何レフがないことを確認するために後肢足をつまんで麻酔のテスト妥当。
- 外科用メスで皮膚を剃ると80％エタノールで滅菌する。また、70％イソプロピルアルコール中2％クロルヘキシジンは、皮膚消毒のために使用することができる。麻酔導入時にイソフルラン濃度は3％ですが、メンテナンスのための百分の1から1.5まで絞り。定期的な呼吸や心拍数を維持するために、この濃度の微調整を行います。加熱パッド上に動物の温度を維持する。
2ドナー操作
- 胸壁フラップを形成するために、剣状突起のレベルで横のカットに続いて腋窩に肋骨端から胸郭の両側を通して胸を切断することにより、心臓や血管を露出するために開胸術を行います。頭の横にこのフラップを持ち上げて、オペレーティングボードにピン。心臓や血管を露出させ、心膜をはがします。
- IVCを通して心臓に冷たい、ヘパリン化生理食塩水の近位片手で、その他の注入1ミリリットルとピンセットで下大静脈を持ち上げ、その未然防止にIVCの小さな動脈クランプを置くバック針穴を通して灌流液のT流れ。
- ガーゼや綿棒を使って、上行大動脈と肺動脈を露出させ、下方の心を撤回。大動脈と肺動脈の束にチャンネル（横洞）事後を通してmicroscissorsの一方のブレードをパスし、吻合のための十分な長さを確保するために限り遠位に可能な限り一緒に大動脈と肺動脈を切った。
- ネクタイやIVC、右上大静脈（SVC）に分割は、6-0絹糸を使用して、SVCと肺静脈を左に。肺静脈と一緒に左のSVCを囲み、それを結ぶために心臓にシングルスレッドの後方に配置して、別々に、IVCと右のSVCを接続します。移植まで4℃で冷滅菌生理食塩水中に保管した後、タイへの遠位血管を切断することにより、ドナー部位から心臓を収穫します。これは放血によるドナーの死をもたらす。
3。受信者の操作
- 麻酔をかける（セクション1）上記のように受信者。慎重にリトラクターを形成するために曲げられ剣状突起とペーパークリップを使用して後退させる恥骨から正中切開により開腹を行い、その後、刺激を避けるために腹部を剃る。暖かい滅菌生理食塩水に浸したガーゼで腸をラップし、腹部の右上に撤回。
- インフラ腎大動脈と下大静脈を露出させ、焼灼装置を用いて、腰椎の血管から、それらを分割することにより腸骨分岐に左腎動脈と静脈から大動脈と下大静脈のバンドルされたセグメントを解放する。焼灼が正しい温度にあると血管端を分割して密封するのに十分な時間に使用することに注意してください。
- 大動脈遠位及び近位にIVCセグメントに小さな非外傷性血管クランプを適用します。最初の30のG針で穴を穿刺することによって大動脈の前壁の切開をすることができる。その後、ドナーの大動脈の大きさに合わせてmicroscissors垂直に切開を切った。任意のBLを削除するには、ヘパリン化生理食塩水で大動脈内腔をフラッシュしますOODの塊。
- 冷生理食塩水に浸したガーゼで覆われた受信者のサイトへのドナー心臓を持参し、腹部の右側に配置します。ドナーの大動脈が受容大動脈と受信者のIVCの隣に位置して、ドナーの肺動脈に切開の隣に位置していることを確認します。
- 動物が180°回転した段階れる遠位の角に達するまで、第1の左側に、近位の角や縫合から始まる10-0ナイロン縫合糸を実行している使用して、受信者の大動脈にドナーの大動脈端側を吻合。穏やかに大動脈の右側を露出し、遠位端から近位端まで大動脈壁の右側を通って縫合継続する腹部の左側にドナー心臓を動かす。大動脈吻合を閉じる前に、静かに任意の血栓や空気を除去するために、ヘパリン化生理食塩水でルーメンをフラッシュします。
- 受信者IVCドナー肺動脈（PA）の端側を吻合。切開バージョンを作るtically動脈吻合に従い、サイトでのIVCの前壁にmicroscissorsと。 IVCの内腔内に左側壁の遠位端から出発10-0ナイロン縫合糸を実行して、レシピエントにドナーIVC PAを吻合。近位端部に到達した後、吻合を完了するために遠位端に前方右側壁に沿って上昇縫合糸を続ける。吻合を閉じる前に、静かに任意の血栓や空気を除去するための内腔をフラッシュします。
- 血管クランプを解放する前に、場所吻合サイトの周りゲルフォームの断片を、止血が達成されるまで綿棒で穏やかな圧力を適用します。血管再生の際には、近位のクランプが続き、第一の遠位のクランプを解除する。
- 血行再建後は、その回復を支援するために、外部から移植片に37℃で温かい生理食塩水を適用します。移植片は、通常はすぐに細動を開始し、数分以内に洞調律に自然に戻ります。温かい0.6ミリリットルを注入レシピエントの水和を維持するために生理食塩水を皮下。手術が完了する前に鎮痛のためのブプレノルフィンの皮下に注入する
- 両方の層のための1 5-0吸収性ランニング縫合糸で腹部の創傷を閉じます。内層を完了することによって起動し、皮膚に沿って継続する。
4。回収および移植片の監視
- 感染症の予防のためのアンピシリンを注入し、回復のために、37℃で加熱パッド上で受信者を置く。ほとんどの動物は急速に回復し、通常は飲んで、多くの場合、3時間以内に食べている。マウスは苦痛の徴候を示していた場合は、原因を特定するために密接に調べます。明らかな原因があれば、ブプレノルフィンで処理し、密接に監視します。症状が重いか、8時間以上を持続する場合は、獣医師に相談して安楽死を考えてみましょう。必要な場合は、症状が解決するまで、ブプレノルフィンの12時間ごとに注射を継続して与える。マウスは8時間後に苦痛の徴候を示している場合は、12を続けて与える彼らが解決するまで、ブプレノルフィンの毎時注射。症状は以上48時間継続し、必要に応じて安楽死させる場合は、獣医師に相談してください。
- 直接腹部触診により移植心拍を監視し、+ + + +のような健康的な原因の高度な拒絶に弱拍のための+への移植片とのために、ビートの強さを記録する - 移植片の拒絶反応を完了することにより、非拍動など。実験期間中、週3回、その後、最初の10日間、毎日、マウスを監視します。
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Representative Results
初期トレーニング期間の後、我々の群におけるマウス異心臓移植の227例を分析した。最初の24時間以内で成功率は90.3％であり、48時間後に、それは86.8％であった。 48時間以内で30（13.2％）の障害、5（2.2％）後肢麻痺を経験し、安楽死させなければならなかった、10（4.4％）15ながら、虚血傷害および/または血栓症を移植片に起因する非鼓動心を持っていた（6.6％）48時間以内に死亡した。いくつかの実験的な移植片生存がひずみ、さまざまな組み合わせで表1に示す。非同一系統間の移植は拒否している間、同じドナーとレシピエント系統間の心臓移植は、長期的に受け入れられた。
移植された心臓の外観を図1に示す。心臓が心臓の外観と組み合わせて鼓動を停止したときに心臓移植失敗の原因は、一般に、移植後の時間によって決定される。必要であれば、原因ビートの停止の心臓部の組織学的分析によって確認されるべきである。たとえば、DBA / 2ドナー心臓移植のC57BL / 6系統の受信者に、心臓が未感作レシピエントにおける拒絶反応は、通常、少なくとも1週間かかるため最も珍しいとなる、2日目に暴行を中止した。 図1（a）は 、このから心臓を示しています血栓症および心臓組織の梗塞の証拠を有する受信者。 C57BL / 6の受信者に、C57BL / 6ドナーのひずみを組み合わせて、心が拒否されていなかったし、> 100日間（ 図1B）生存した。この場合、心臓は、その非生命維持の状態に二筋萎縮のサイズにわずかに減少していた。これとは対照的に、C57BL / 6の受信者にはDBA / 2ドナーの拒否ひずみ組み合わせて、移植された心臓は、7日目で打つために停止し、除去（ 図1C）の証拠を示していた。それは、一日100（ 図1D）によって完全に線維化と萎縮した。
図1。血栓の出現、移植された心臓を拒絶し、非拒絶。 （A）DBA / 2の心臓移植後血栓や梗塞心臓7日間を示すC57BL / 6受信者に移植した。（B）がよく灌流し、100日、移植後の心を打つ。（Cを示すC57BL / 6受信者に移植したC57BL / 6ハート100日、移植後拒絶され、心臓を示すC57BL / 6受信者に移植し7日、移植後拒絶され、心臓を示すC57BL / 6、受信者に移植）、DBA / 2の心臓。（D）DBA / 2の心臓。矢印は、移植された心臓を示している。
| 組み合わせ | 生存（日） | N | |
| B10.BR→B10.BR | > 200 X7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6→C57BL / 6 | 40、> 200×2 | 3 | > 200 |
| F1→B10.BR | 8×2、図9、図12 | 4 | 8.5 |
| 178.3→B10.BR | 7 2倍、8倍x2、9、10、12、13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6→B10.BR | 8 X4、9×2、10×5、11、12、14×2、15 | 16 | 10 |
| BALB / cの→C57BL / 6 | 7 X9 | 9 | 7 |
| DBA / 2→C57BL / 6 | 6、7×10 | 11 | 7 |
表1。異なるドナー/レシピエントの組み合わせにおける心臓移植片の生着。
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Discussion
マウスの心臓移植がマスターにかなりの外科技術を必要と挑戦的な顕微法である。最も困難な局面は、血管の小さい直径である。また、受信者動作時間と出血を制限する必要がある。マウス心臓移植のための技術は、第一のコリーらによって記載された。 1973年に、その後モットラムら 12による。私たちの修正は、以下の点が含まれています。まず、すぐに灌流後の大動脈と肺動脈バンドルの開胸や離断以下の寒さのヘパリン化生理食塩水でドナー心臓の即時灌流は、収穫時に温かい虚血を防ぐことができます。第二に、代わりにドナーの前に受信者を準備する、すぐにドナー収穫が終了した後、受信者の準備を開始し、生存率の改善が結果的にレシピエントにおける腹部の露出時間が短縮されます。最後に、小さな非外傷性血管の使用は、Bにクランプ血流をロックし、代わりに、受信者の大動脈/ IVCバンドルのネクタイ、通常の船舶への損傷が少なく、その結果と後肢麻痺の発生率を減らすことができます。
また、以下の点が成功のために重要である。ドナーとレシピエントの最適なサイズは約23〜26グラム、最適な年齢は10〜12週間です。高齢の動物は、より大きな血管を持っていないし、その増加した脂肪は、大動脈と下大静脈の露出をより困難にする。手術中の受信者の脱水や低体温は避けなければならない。レシピエント腸ウェル温生理食塩水に浸したガーゼを用いて脱水から保護される必要があり、受信者は、37℃の加熱マットの上に維持することができるガーゼは、動作中に、新鮮な、温かい生理食塩水の定期的な適用によって湿った保つ必要がある。後肢麻痺につながることができ、血栓、空気塞栓を最小限にするために、血管吻合サイトが閉じる前に十分にフラッシュする必要があります。腸を慎重completiで交換する必要があります移植の上腸間膜のいずれねじれを防止します。すぐに手術後の静脈より大量の流体が吻合の高血圧や出血を引き起こすことがあり、一方、0.6ミリリットル温かい生理食塩水の皮下注射は、動物の回復を支援します。レシピエント大動脈およびIVCがクロス30分未満にクランプされる時間を制限する成功率を向上させるであろう。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、オーストラリアのMicrosearch財団、およびMyeeコドリントン医学研究財団、オーストラリアプロジェクト無償1029205国立保健医療研究評議会（NHMRC）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
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