Abstract
Mus brukes ofte som hjertetransplanterte givere og mottakere i studier av transplantasjon immunologi grunn av det store omfanget av transgene mus og reagenser tilgjengelige. En vanskelighet er presentert på grunn av den lille størrelsen av dyret og de betydelige tekniske utfordringene i mikro involvert i hjertetransplantasjon. Spesielt kan en høy grad av teknisk svikt tidlig etter transplantasjon skyldes mottaker død og postoperative komplikasjoner som hind lem lammelse eller en ikke-bankende hjerte. Her blir den komplette teknikk for heterotop mus hjertetransplantasjon vist, som omfatter høsting av donor hjerte og dens påfølgende implantering inn i en mottaker mus. Donor hjerte er høstet umiddelbart etter in situ perfusjon med kaldt heparinisert saltvann og transection av oppstigende aorta og lungearterien. Mottakeren operasjon involverer fremstillingen av den abdominale aorta og nedre vena cava (IVC), etterfulgt avende-til-side anastomose av donor aorta med mottakeren aorta ved hjelp av en enkelt løpe 10-0 microsuture og en tilsvarende anastomose av donor lungearterien med mottakeren IVC. Etter operasjonen dyret injisert med 0,6 ml normal saltoppløsning subkutant, og tillates å komme seg på en 37 ° C varmeblokk. Resultatene fra 227 mus hjertetransplantasjoner er oppsummert med en suksessrate på 48 hr på 86,8%. Av de 13,2% utfall innen 48 timer, 5 (2,2%) opplevde hind lem lammelse, 10 (4,4%) hadde en ikke-bankende hjerte på grunn av pode iskemisk skade og / eller trombose, mens 15 (6,6%) døde innen 48 timer .
Introduction
Dyremodeller av organtransplantasjon kan gi verdifull informasjon for å forbedre behandling av kliniske transplanterte pasienter. Musemodeller er spesielt nyttig for å studere immunsystemet av organtransplantasjon avvisning eller aksept på grunn av det store omfanget av genmodifiserte mus og reagenser spesifikke for mus som ikke er tilgjengelige for andre dyremodeller 1-3. En utfordring med musemodeller av transplantasjon er den lille størrelsen på givere og mottakere som krever store tekniske ferdigheter for å oppnå tilfredsstillende resultater.
En teknikk ble først beskrevet for heterotop transplantasjon av hjerter i rotter fire som senere ble tilpasset for mus hjertetransplantasjon ved Corry et al fem. Denne teknikken involverte fremstilling av mottakeren før donor drift og uten perfusjon av donor hjertet, som begge er sannsynlig å kompromittere overlevelse av det transplanterte hjerte-eller tHan mottakeren. Prosedyren har vært mye brukt som opprinnelig beskrevet å undersøke mekanismene for transplantasjon avvisning og toleranse 6-8. Andre har tilpasset det opprinnelige rotte hjertetransplantasjon prosedyre for Ono og Lindsey for hjertetransplantasjoner i mus 9,10. Mer nylig ble en teknikk publisert for mus hjertetransplantasjon som overvant noen av problemene i forbindelse med fremgangsmåten ifølge Corry et al 11.. Protokollen er beskrevet her omfatter våre modifikasjoner, basert på fremgangsmåten ifølge Mottram et al 12, som omfatter: in situ perfusjon med kaldt heparinisert saltoppløsning umiddelbart etter torakotomi og utføre donor operasjon forut for mottakerens drift for å redusere mottakerens driftstiden. I tillegg bruker vi små atraumatiske fartøy klemmer i stedet for 6-0 silkeslips. Selv om skips klemmer har den ulempen av å ta mer plass de er lettere å kontrollere enn bånd, som ikke bør være for stram eller løsog er mindre grei å fjerne enn klemmer. Vår metode bruker en enkelt løpe sutur for fartøy anastomose, selv om det i den første lærings stadier et alternativ er å bruke opphold suturer i den proksimale og distale hjørner for å sikre jevnhet av suturer og dermed patens av anastomose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før oppstart av eksperimenter, innhente godkjenning fra relevante institusjonens Animal Care etiske komité for de planlagte eksperimenter. Opprettholde mus i samsvar med kravene i din institusjon. Følgende protokoll er godkjent av Sydney University og Royal Prince Alfred Hospital komiteer.
Før du begynner kirurgi, bør alle instrumentene rengjøres grundig og steriliseres ved bløtlegging i 80% etanol. Noen institusjoner fastsette autoklave men dette kan skade fin mikrokirurgiske instrumenter på lang sikt. Der det er mulig bruk sterilt engangsutstyr.
En. Anestesi
- Anesthetize mus med isofluran i en lukket beholder deretter plassere den liggende på en driftspensjon, raskt koble bedøvelse nese kjegle. Test dekningen av anestesi ved å klemme bakfot å sikre at det ikke refleks.
- Barbere huden med en kirurgisk kniv ogsterilisere med 80% etanol. I tillegg kan 2% klorheksidin i 70% isopropanol brukes til huden sterilisering. Ved induksjon av anestesi den isofluran konsentrasjonen er 3%, men redusere dette til 1-1,5% for vedlikehold. Foreta mindre justeringer av denne konsentrasjonen å holde jevnlig pust og puls. Oppretthold temperaturen på dyret på en varmepute.
2. Donor Operation
- Gjør en torakotomi å eksponere hjertet og fartøy ved å kutte brystet gjennom begge sider av brystkassen fra ribben kanten opp til armhulen, etterfulgt av en tverrgående snitt på nivå med den xiphisternum for å danne en brystveggen klaff. Løft denne klaffen opp ved siden av hodet og feste det til operasjonsbordet. Riv av hjerteposen for å blottlegge hjertet og fartøy.
- Løft nedre vena cava med tang i den ene hånden og med den andre injisere en ml kaldt heparinisert saltvann proksimale til hjertet gjennom IVC, og deretter sette en liten arterie klemme på IVC å foret strøm av perfusjons-løsning tilbake gjennom nålen hullet.
- Ved hjelp av gasbind og en bomullspinne, trekke hjertet nedover for å eksponere den stigende aorta og lungearterien. Passerer en blad av et par microscissors gjennom kanalen (transverse sinus) posteriort for bunt av aorta og lungearterien og kuttet aorta og lungearterien sammen så langt distalt som mulig for å sikre at tilstrekkelig lengde for anastomose.
- Slips og dele IVC, rett superior vena cava (SVC), forlot SVC og lungevenene bruker 6-0 silketråd. Bind IVC og høyre SVC separat deretter plassere en enkelt tråd posterior til hjertet for å omringe den venstre SVC sammen med lungevener og bind den. Høste hjertet fra donor området ved å kutte fartøyene distal til båndene, og deretter lagre den i kaldt sterilt saltvann ved 4 ° C til transplantasjon. Dette resulterer i død av donor ved blodtapping.
Tre. Mottaker Operation
- Anesthetizemottaker som ovenfor (§ 1). Barbere nøye magen for å unngå irritasjon, deretter foreta en laparotomi ved midtlinjen snitt fra pubis til xiphisternum og trekke ved hjelp av binders bøyd for å danne haker. Pakk tarmen i varm sterilt saltvann gjennomvåt gasbind og trekke til øverst til høyre i magen.
- For å eksponere den nedenfor nyrene aorta og IVC, frigjøre de buntede segmenter av aorta og IVC fra den venstre renale arterie og vene for å iliaca bifurkasjonen ved å dele dem i lende fartøy ved hjelp av en elektrokirurgienhet. Pass på at kirurgi er ved riktig temperatur og brukes for tilstrekkelig tid til å dele seg og forsegle fartøyet endene.
- Påfør små atraumatiske fartøy klemmer til aorta og IVC segmenter distalt og proksimalt. Lag et snitt i den fremre vegg av aorta ved først å punktere et hull med en 30 G nål; deretter skjære et snitt vertikalt med microscissors å matche størrelsen på donor aorta. Spyl aorta lumen med heparinisert saltløsning for å fjerne eventuelle blood propper.
- Ta med donor hjerte til mottakeren området dekket med gasbind dynket i kaldt saltvann og plassere den til høyre side av magen. Kontroller at donor aorta er plassert ved siden av snittet på mottakerens aorta og donor lungearterien plassert ved siden av mottakeren IVC.
- Anastomose donor aorta ende-til-side til mottakeren aorta ved hjelp av rennende 10-0 nylon suturer som starter ut fra den nærmeste hjørne og suturering langs venstre side først til n distale hjørne, på hvilket stadium der dyret er rotert gjennom 180 °. Beveg donorhjerte til venstre side av abdomen for å eksponere den høyre siden av aorta og fortsette suturering gjennom den høyre siden av aorta fra den distale ende til den proksimale ende. Før lukking av aorta anastomose, skylles forsiktig lumen med heparinisert saltløsning for å fjerne eventuelle koagulere og luft.
- Anastomose donor lungearterie (PA) ende-til-side med mottakeren IVC. Gjør et snitt vertisk med microscissors i den fremre vegg av IVC ved et sete i henhold til arterien anastomose. Anastomose donor PA til mottaker IVC med rennende 10-0 nylon suturer med start fra den distale ende av den venstre vegg i lumen av IVC. Etter å ha nådd den proksimale ende, fortsetter sting langs den fremre høyre sidevegg opp til den distale ende for å fullføre anastomose. Før du lukker anastomose, skyll forsiktig lumen for å fjerne eventuelle klumper og luft.
- Før du slipper fartøyets klemmer, sted biter av Gelfoam rundt anastomose nettsteder, og trykk forsiktig med en bomulls applikator inntil hemostase er oppnådd. På tidspunktet for revaskularisering, frigjøre den distale klemme først, etterfulgt av den proksimale klemme.
- Etter revaskularisering, anvende varm saltløsning ved 37 ° C for å pode utad for å hjelpe dens utvinning. Transplantasjonen starter vanligvis flimmer umiddelbart og går tilbake spontant til sinusrytme i løpet av få minutter. Injisere 0,6 ml varmesaltvann subkutant for å unngå uttørking av mottakeren. Injisere buprenorfin subkutant for analgesi før gjennomføringen av operasjonen
- Lukk abdominal såret med en 5-0 absorberbare kjører sutur for begge lagene. Start med å fullføre det indre laget og fortsette langs huden.
4. Recovery og Graft Monitoring
- Injisere ampicillin for profylakse av infeksjon og plasser mottakeren på en varmepute på 37 ° C for å bli frisk. De fleste dyrene komme hurtig og er vanligvis drikker og ofte spise i løpet av 3 timer. Hvis musa viser tegn på stress, undersøke nøye for å fastslå årsaken. Hvis ingen åpenbar årsak, behandle med buprenorfin og overvåke nøye. Oppsøke veterinær dersom symptomene er alvorlige eller vedvarer mer enn 8 timer og vurdere aktiv dødshjelp. Hvis det er nødvendig, gi fortsatt 12 time injeksjoner av buprenorfin til symptomene forsvinner. Hvis musa viser tegn på stress etter 8 timers, gi fortsatt 12time injeksjoner av buprenorfin til de løse. Konsultere veterinær hvis symptomene fortsetter i mer enn 48 timer og avlive hvis det er nødvendig.
- Monitor pode hjerteslag ved direkte abdominal palpasjon og registrere styrken i slag da + + + + for en sunn pode til + for svak rytme på grunn av avansert avvisning og - som ikke juling grunnet fullstendig avvisning av pode. Monitor mus daglig de første 10 dagene, deretter 3x per uke for varigheten av forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter en innledende opplæring periode, ble 227 tilfeller av muse heterotop hjertetransplantasjon i vår gruppe analysert. Den suksessrate i løpet av de første 24 timer var 90,3%, og ved 48 timer var den 86,8%. Av de 30 (13,2%) feil innen 48 timer, 5 (2,2%) opplevde hind lem lammelse og måtte avlives, 10 (4,4%) hadde en ikke-bankende hjerte på grunn av pode iskemi skader og / eller trombose, mens 15 (6,6%) døde innen 48 timer. Noen eksperimentelle pode overlevelse er vist i tabell 1 med en rekke belastningskombinasjoner. Hjertetransplantasjoner mellom samme donor og belastning mottaker ble akseptert langsiktig mens transplantasjoner mellom ikke-identiske stammer ble avvist.
Utseendet av transplanterte hjerte er vist i figur 1.. Årsaken til hjertetransplantasjon svikt er generelt bestemt av tiden etter transplantasjon når hjertet sluttet å slå sammen med fremkomsten av hjertet. Hvis det er nødvendig, årsakenopphør av kryss bør bekreftes ved histologisk analyse av hjertet. For eksempel, i en C57BL / 6 belastning mottaker av en DBA / 2 donor hjertetransplantasjon, hjertet stanset juling på dag 2, som er mest uvanlig som avvisning i unsensitized mottakere tar vanligvis minst en uke. Figur 1a viser hjertet fra dette Mottakeren med bevis for trombose og infarkt i hjertevevet. I belastningen kombinasjon av C57BL / 6 donor til C57BL / 6 mottaker, ble hjertet ikke avvist og overlevde i> 100 dager (Figur 1b). I dette tilfellet hjertet hadde noe redusert i størrelse på grunn av muskelatrofi sekundært til sin ikke livet opprettholde status. I kontrast, i avvise belastningen kombinasjon av DBA / 2 donor til C57BL / 6 mottaker, hadde det transplanterte hjertet sluttet å slå etter dag 7 og viste tegn på avvisning (figur 1C). Det var helt fibrotisk og krympet etter dag 100 (figur 1D).
Figur 1. Utseende av thrombosed, avvise og ikke-avstøter transplanterte hjerter. (A) DBA / 2 hjerte transplantert til C57BL / 6 mottaker viser thrombosed og infarcted hjerte 7 dager etter transplantasjon. (B) C57BL / 6 hjerte transplantert til C57BL / 6 mottaker som viser et godt perfundert og bankende hjerte 100 dager etter transplantasjonen. (C ) DBA / 2 hjerte transplantert til C57BL / 6 mottaker viser avvist hjerte 7 dager etter transplantasjonen. (D) DBA / 2 hjerte transplantert til C57BL / 6 mottaker viser avvist hjerte 100 dager etter transplantasjonen. Pilene angir det transplanterte hjertet.
| Kombinasjoner | Overlevelse (dager) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178,3 → B10.BR | 7. x2, 8 x 2, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, 9 x2, 10 x5, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Tabell 1. Hjerte graft overlevelse i ulike giver / mottaker kombinasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus hjertetransplantasjon er en utfordrende microsurgical metode som krever betydelig kirurgisk ferdighet å mestre. Den mest utfordrende aspekt er den lille diameter av fartøyene. I tillegg er det nødvendig å begrense mottakeroperasjon tid og blødning. Teknikken for mus hjertetransplantasjon ble først beskrevet av Corry et al. i 1973 og senere av Mottram et al 12. Våre endringene omfatter følgende punkter. For det første, umiddelbare perfusjon av donor hjerte med kaldt heparinisert saltvann følgende Thoracotomi og transection av aorta og lungearterien bunt snart etter perfusjon hindrer varm iskemi under høsting. For det andre, som starter mottakeren preparatet straks etter fullføring av donor høsting, i stedet for fremstilling av mottakeren før donor, reduserer abdominale eksponeringstid i mottakeren med derav følgende forbedring i overlevelse. Til slutt, bruk av små skånsomme fartøy klemmer til blåse blodstrømmen, i stedet for bånd for mottakeren aorta / IVC bunten, vanligvis resulterer i mindre skade på skip og kan redusere forekomsten av hind lem lammelse.
I tillegg er de følgende punkter er viktig for å lykkes. Den optimale størrelsen på givere og mottakere er rundt 23 til 26 g og optimal alder er 10 til 12 uker. Eldre dyr har ikke større skip og deres økt fett gjør eksponering av aorta og IVC vanskeligere. Dehydrering og nedkjøling til mottakeren under en operasjon, må unngås. Mottaker tarm må være godt beskyttet mot dehydrering med varmt saltvann gjennomvåt gasbind og mottakeren kan opprettholdes på en varmematte ved 37 ° C. Gasen må holdes fuktig ved vanlig anvendelse av frisk, varm saltløsning under operasjonen. For å minimere blodpropp og luft emboli som kan føre til hind lem lammelse, fartøyet anastomose nettsteder trenger å være godt spyles før stengetid. Tarm bør settes forsiktig på ferdigstillelseson av transplantasjon for å forhindre enhver vridning av mesenterium. Subkutan injeksjon med 0,6 ml varmt saltvann bistår dyr utvinning, mens et større volum av intravenøs fluid snart etter kirurgi kan føre til høyt blodtrykk og blødning av anastomoser. Å begrense den tid mottakeren aorta og IVC er kryssfastklemt til mindre enn 30 min vil bedre suksessrate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia Prosjekt Grant 1.029.205, ved Microsearch Foundation of Australia, og ved Myee Codrington Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
- Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
- Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
- Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
- Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
- Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
- Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
- Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic Heart Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. , (2007).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).
